Le travail est partiellement soutenu par le Wageningen University Fund (WUF), le China Scholarship Council Program for Graduate Students et une subvention NWO-VIDI 12378.

1. Conditions de croissance et d’essai des plantes
<ol><li>Cultiver et entretenir les plantes dans des serres ou des chambres climatiques contrôlées dans la plage de températures de 18 à 22 °C et sous régime de lumière naturelle ou avec un régime jour/nuit de 16 h/8 h. Enlevez les branches axillaires afin de rendre les plantes plus gérables.</li>
	<li>Pour la pomme de terre, maintenir in vitro les plantules dans des bocaux en plastique stérile contenant du milieu Murashige-Skoog (MS) (20 g/L de saccharose, 5 g/L de sels ms contenant des vitamines, gélose de 8 g/L, pH 5,8) dans des conditions contrôlées dans des chambres climatiques à 18 °C avec un régime jour/nuit de 16 h/8 h pendant deux semaines, puis les transférer dans des pots de sol stérilisé dans des compartiments de serre réglementés.</li>
</ol>2. Agroinfiltration
<ol><li>Matériel végétal: Pour Nicotiana benthamiana, utilisez environ 4-5 semaines de plantes cultivées en graines. Pour la pomme de terre, utilisez environ 4-5 semaines de greffes in vitro. Choisissez des feuilles jeunes, saines et pleinement développées pour les infiltrations.</li>
	<li>
Culture d’Agrobacterium:<ol>
<li>Préparer le milieu YEB à l’avance (tableau 1). Remplissez les tubes de 50 ml avec un milieu YEB de 10 ml complété par 1 μl d’acétosyringone (200 mM), 100 μl de tampon MES (2-(N-morpholino)-éthane sulfonique acide, 1 M) et les antibiotiques appropriés. Pipetter 20 μl de glycérol stock des souches désirées(tableau 2)(contenant le gène d’intérêt) dans le YEB. Initier des cultures pour toutes les souches d’Agrobacterium dans ce test en même temps. Incuber les cellules en secouant pendant 1-2 jours à 28 °C et 200 rpm à une DO600 d’environ 1,0.</li>
		<li>Prélever les cellules par centrifugation à 3 000 x g pendant 10 min. Versez le surnageant et ressuscitez la pastille dans un milieu MMA fraîchement fabriqué(tableau 3)à une DO600 de 0,3. Vortex doucement cellules pour les ressusciter. Pour la coinfiltration de deux souches bactériennes, mélanger la culture dans un rapport de 1:1.</li>
		<li>Laissez la culture sur le banc à température ambiante pendant 1-6 heures avant les infiltrations. En attendant, étiquetez les plantes à infiltrer et la date de l’expérience.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infiltrations : Utilisez une seringue sans aiguille de 1 ml pour infiltrer les suspensions d’Agrobacterium. Injectez soigneusement et lentement des panneaux de feuilles avec les suspensions de la seringue (pour des raisons de santé et de sécurité, une protection oculaire doit être portée pendant ce processus). Infiltrer au moins trois plantes pour chaque souche. Utilisez trois feuilles par plante pour servir de triples. Remarque: Normalement, 1 ml de suspension d’Agrobacterium pourrait suffire pour 3 plantes de N. benthamiana. Pour la pomme de terre, plus de suspension est nécessaire car les feuilles des espèces de Solanum sont plus difficiles à infiltrer. Les volumes requis de suspensions dépendent de l’espèce Solanum. Évitez la contamination croisée en changeant les gants ou en stérilisant les gants avec de l’éthanol entre les infiltrations et en n’arrosant les plantes que le lendemain de l’inoculation.</li>
	<li>Marquer: Marquer les réponses macroscopiques environ 3 jours après l’infiltration lorsque le phénotype de mort cellulaire est clair (Figure 1). Si le phénotype de mort cellulaire est quantitatif, utilisez les critères donnés (Figure 2). En bref, les échelles pour la notation macroscopique de la mort cellulaire dépendent principalement des pourcentages de mort cellulaire de la zone infiltrée. Les pourcentages de mort cellulaire sont représentés sur une échelle allant de 0 % (aucun symptôme) à 100 % (mort cellulaire confluente). Les réponses intermédiaires vont de réponses faibles telles que la chlorose à l’augmentation des niveaux de mort cellulaire. Si vous le souhaitez, la notation macroscopique peut également être évaluée quantitativement à l’aide d’un équipement de photo-imagerie moderne.</li>
</ol>3. Agroinfection PVX
<ol><li>Matériel végétal: Pour N. benthamiana,utilisez environ 2-3 semaines de plantes à graines. Pour la pomme de terre, utilisez environ 2-3 semaines de greffes in vitro. Pour les tests à grande échelle, utilisez des plantes légèrement plus anciennes (4-5 semaines), car ces plantes ont des feuilles plus nombreuses et plus grandes pour accueillir un plus grand nombre de taches d’inoculation d’Agrobacterium.</li>
	<li>
Culture d’Agrobacterium :<ol>
<li>Préparez le milieu YEB à l’avance. Remplissez les tubes de 10 ml avec 3 ml de YEB complétés par les antibiotiques appropriés. Pipetter 20 μl de glycérol stock des souches désirées(tableau 2)(contenant le gène d’intérêt) dans le YEB. Initier des cultures pour toutes les souches d’Agrobacterium dans ce test en même temps. Incuber les cellules en secouant pendant 1-2 jours à 28 °C et 200 rpm à une DO600 d’environ 1,0.</li>
		<li>Pipetter environ 300 μl de chaque souche d’Agrobacterium et les étaler sur des plaques de milieu de gélose solide LB complétées par les antibiotiques appropriés et incuber les cellules à 28 °C pendant 1-2 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infections: Utilisez une spatule pour recueillir la culture Agrobacterium dans la plaque. Trempez un cure-dent en bois dans la culture Agrobacterium sur la spatule et percez les feuilles pour inoculer une grande quantité de bactéries. Inoculer au moins trois plantes pour chaque souche. Utilisez trois feuilles par plante pour servir de triples. Dans chaque feuille, faites plusieurs sites d’inoculation pour chaque souche.</li>
	<li>Marquer: Marquer les réponses macroscopiques environ deux semaines après l’inoculation (Figure 3). Pour les écrans à haut débit, enregistrez les réponses qualitatives (oui/non) pour chaque point d’inoculation. Calculez ensuite le pourcentage de sites répondants et comparez-les avec des contrôles.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors.">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li><li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens.">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes.">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li><li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes,+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2.">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li><li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis.">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans.">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li><li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire.">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li><li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+genomics:+new+insights+and+future+directions.">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li><li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing.">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li><li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana.">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li><li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , 1-13 (2012).</li><li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection.">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li><li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves.">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li><li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes.">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li><li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H., Lamour, K., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics.">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. 23, 455-475 (2009).</li><li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves.">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li><li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., An&#233;, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing:+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato.">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li><li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ternary+transformation+system:+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato.">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li><li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a,+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm.">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes.">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li><li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora.">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum.">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li><li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary.">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. 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J. 3, 259-273 (2005).</li><li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19.">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li><li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation.">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li><li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta.">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les essais transitoires comme l’agroinfiltration et l’agroinfection sont des méthodes efficaces qui sont essentielles à la recherche moderne en phytopathologie moléculaire. Malgré certaines limites, ces méthodes répondent à la demande d’analyses fonctionnelles à haut débit efficaces et robustes dans les usines.
Le système d’agroinfiltration est un test fonctionnel largement utilisé dans une gamme d’espèces végétales. L’agroinfiltration facilite l’administration de plusieurs transgènes dans la même cellule avec l’expression simultanée de protéines en interaction. Ceci est avantageux pour récapituler les relations R-AVR, en cofiltrant les souches Agrobacterium qui expriment les gènes Avr avec des souches qui expriment les gènes R correspondants. En outre, pour les paires R-AVR connues, de telles co-infiltrations peuvent être utilisées comme contrôles positifs. Il est important d’inclure de tels contrôles, car dans certains génotypes végétaux, l’efficacité de la transformation peut être inférieure au seuil de détection des réponses. L’inclusion de contrôles négatifs, par exemple une souche Agrobacterium contenant un vecteur sans insertion de gène, est également essentielle pour déterminer si un certain génotype de plante soulève des réponses de défense non spécifiques à l’Agrobacterium. Cette caractéristique se produit à une certaine fréquence dans le matériel génétique de la pomme de terre, et toutes les espèces de Solanum ne conviennent pas bien à ce système d’expression à base d’Agrobacterium. En général, le test d’agroinfiltration fonctionne très bien chez N. benthamiana et la plupart des génotypes de pommes de terre. En plus de l’effectoromique, il existe diverses autres applications potentielles pour la technique d’agroinfiltration, telles que la production de protéines à partir de transgènes et la localisation de protéines dans les cellules végétales par microscopie confocale.
L’agroinfection PVX est un système de criblage très sensible et généralement plus adapté aux criblages à haut débit. Étant donné que l’Agrobacterium n’est plus présente que localement, les réponses non spécifiques à cette bactérie ne sont plus très inquiétantes, car le virus PVX prend le relais de la propagation du transgène. Cependant, les plantes peuvent être résistantes au PVX ou monter des réponses de résistance extrême (ER), et dans ce cas, la méthode d’agroinfection ne convient pas. Une autre limitation de la méthode d’agroinfection PVX est la taille de l’insert du gène d’intérêt. Les phénotypes observés des réponses peuvent varier d’une nécrose noire intense entourant la blessure à la nécrose faible près du point d’inoculation. Chez les espèces de N. benthamiana et de Solanum, l’agroinfection PVX est reconnue comme plus sensible que l’agroinfiltration.
En tenant compte du fait que le contexte génétique des divers génotypes de plantes testés peut avoir certaines restrictions (voir ci-dessus), nous obtenons généralement des conclusions similaires par agroinfection pvx et agroinfiltration. Ces résultats sont également comparables à ceux obtenus dans d’autres dosages, tels que les infiltrationsprotéiques 29 et ELISA3. Compte tenu des avantages et des limites des deux systèmes, nous vous recommandons d’utiliser les deux méthodes pour se compléter ou confirmer des résultats indépendants.

L’effectoromique, une approche génomique fonctionnelle à haut débit, est récemment apparue comme un outil puissant pour identifier les gènes de résistance(R)dans les plantes cultivées et les gènes d’avirulence(Avr)correspondants des agents pathogènes1-4. Contrairement à la transformation stable plus longue avec les gènes R, la stratégie effectoromique est basée sur des tests transitoires de séquences de gènes pathogènes.
Depuis l’ère de la génomique, les génomes des phytopathogènes ont été largement explorés. Par exemple, pour les oomycètes, qui comprennent les agents pathogènes des plantes les plus dévastateurs, de grandes collections de séquences ont été générées et analysées pour les gènes qui jouent un rôle lors de l’interaction avec la plante5-10. Une classe de protéines pathogènes représente les effecteurs, qui manipulent la structure et la fonction de la cellule hôte soit pour faciliter l’infection (facteurs de virulence), soit pour déclencher des réponses de défense (facteurs d’avirulence)11-13. L’expression des gènes Avr dans les cellules végétales contenant des gènes R entraîne généralement la réponse hypersensible à la mort cellulaire (HR)14,15. Dans les plantes, l’expression des gènes R et Avr peut être accomplie en utilisant des systèmes d’expression transitoire tels qu’Agrobacterium tumefaciens -transformation transitoire basée (agroinfiltration)16. Cette transformation transitoire peut également être appliquée en combinaison avec des systèmes d’expression virale (agroinfection)17,18.
Pour l’agroinfiltration, l’agent le plus couramment utilisé est A . tumefaciens, un agent pathogène de large gamme d’hôtes des plantes dicotylédones. A . tumefaciens contient un plasmide induisant une tumeur (Ti). L’ADN de transfert (ADN-T) d’un plasmide Ti se déplacera dans les cellules végétales après l’activation de la machinerie de virulence de la bactérie. Ceci peut être déclenché dans les cellules végétales blessées, par les composés phénoliques de faible poids moléculaire libérés et les monosaccharaides dans un environnement légèrement acide19. Le gène de virulence est activé après l’infiltration des suspensions d’Agrobacterium dans les panneaux foliaires définis par les principales nervures. Ensuite, les cellules végétales dans les panneaux foliaires seront transformées et exprimeront le ou les transgènes contenus dans la région de l’ADN-T.
L’agroinfection est basée sur Agrobacteriuminoculée par plaie, qui négocie la translocation d’un virus vers les cellules végétales. Le virus se propage ensuite aux tissus végétaux adjacents, en l’absence d’Agrobacterium. Pour l’agroinfection, plusieurs phytovirus peuvent être utilisés. Les virus à ARN sont des vecteurs idéaux pour l’expression des gènes car ils peuvent se multiplier à des niveaux très élevés dans les plantes infectées. Parmi les virus à ARN des plantes, le virus X de la pomme de terre (PVX) est largement utilisé pour les écrans effectoromiques. Pour faciliter les tests fonctionnels d’un gène inséré, des vecteurs binaires contenant le génome PVX flanqué du promoteur du virus de la mosaïque du chou-fleur 35S et du terminateur de la nopaline synthase, ont été clonés dans l’ADN-T de A. tumefaciens20. Une fois l’ADN-T transféré dans les cellules végétales, le génome PVX contenu dans l’ADN-T est transcrit à partir du promoteur 35S. Ensuite, les particules virales se propagent systématiquement dans les plantes infectées, entraînant l’expression du gène inséré. Cette méthode basée à la fois sur Agrobacterium et PVX est appelée agroinfection PVX.
Nous montrons ici des exemples pour les tests d’agroinfiltration et d’agroinfection PVX. En tant que plantes hôtes, nous utilisons du matériel génétique de pomme de terre (Solanum section Petota), pour lequel les approches effectoromiques ont été lancées et ont fait leurs preuves3,4. Nous utilisons également Nicotiana benthamiana, qui est réputée comme plante modèle dans les plantes solanacées 14,21,22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Beef extract</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">B4888</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0037</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0021</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MgSO4</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">208094</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MS salts (without vitamins)</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M0221</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MES</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M1503</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">LB broth powder</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">L3022</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D134406</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:267px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Incubator</td>
			<td style="width:267px;">Infors HT</td>
			<td style="width:219px;">Multitron II</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus</td>
			<td style="width:219px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:219px;">Biophotometer 6131</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana

L’agroinfiltration et l’agroinfection PVX sont deux tests d’expression transitoire efficaces pour l’analyse fonctionnelle des gènes candidats dans les plantes. L’agent le plus couramment utilisé pour l’agroinfiltration est Agrobacterium tumefaciens, un agent pathogène de nombreuses espèces de plantes dicotylédones. Cela implique que l’agroinfiltration peut être appliquée à de nombreuses espèces végétales. Ici, nous présentons nos protocoles et les résultats attendus lors de l’application de ces méthodes à la pomme de terre(Solanum tuberosum),ses espèces apparentées de Solanum contenant des tubercules sauvages(Solanum section Petota)et la plante modèle Nicotiana benthamiana. En plus de l’analyse fonctionnelle de gènes uniques, tels que les gènes de résistance(R)ou d’avirulence(Avr),le test d’agroinfiltration est très approprié pour récapituler les interactions R-AVR associées à des interactions pathogènes hôtes spécifiques en délivrant simplement des transgènes R et Avr dans la même cellule. Cependant, certains génotypes végétaux peuvent susciter des réponses de défense non spécifiques à Agrobacterium, comme nous l’avons observé par exemple pour plusieurs génotypes de pommes de terre. Par rapport à l’agroinfiltration, la détection de l’activité AVR avec l’agroinfection PVX est plus sensible, plus haut débit dans les écrans fonctionnels et moins sensible aux réponses de défense non spécifiques à Agrobacterium. Cependant, une défense non spécifique contre le PVX peut se produire et il existe un risque de manquer des réponses en raison d’une résistance extrême induite par le virus. Malgré ces limites, d’après notre expérience, l’agroinfiltration et l’agroinfection PVX sont des tests appropriés et complémentaires qui peuvent être utilisés simultanément pour confirmer les résultats de l’autre.

La figure 1 montre une expérience représentative d’agroinfiltration avec 7 effecteurs différents (E1-E7) dans la pomme de terre et N. benthamiana. La mort cellulaire apparaît dans les panneaux foliaires infiltrés environ 3 jours après l’infiltration. L’ampleur du phénotype de mort cellulaire doit être comparée aux contrôles. Un mélange de la souche AGL1(pVirG)23 d’Agrobacterium contenant pBINplus-R3a et pK7WG2-AVR3a a été utilisé comme témoin positif24,25, tandis que L’AGL1(pVirG) a été utilisé comme témoin négatif. Les figures 1A et 1B montrent de bons exemples d’agroinfiltration dans le génotype de pomme de terre MaR8 (Mastenbroek R8)26 et N. benthamiana,respectivement, qui se prêtent très bien à l’agroinfiltration. Il y a la mort cellulaire confluente dans le panneau foliaire coinfiltré avec le contrôle positif, tandis qu’aucune réponse de mort cellulaire ne se produit avec le contrôle négatif ou pBINplus-R3a. Dans MaR8, deux effecteurs AVR3a (E2) et AVR4 (E3) induisent une mort cellulaire, tandis que les autres effecteurs (E1 et E4-E7) ne le font pas. Chez N. benthamiana, aucun des effecteurs testés n’induit une réponse de mort cellulaire. Les figures 1C et 1D montrent des exemples d’agroinfiltration dans la pomme de terre sauvage Solanum berthaultii 483-1 et Solanum rechei 210-5, qui ne se préparent pas bien à la technique de l’agroinfiltration. Chez S. berthaultii 483-1, le tissu foliaire présente une nécrose non spécifique aux témoins négatifs ainsi qu’à tous les effecteurs testés. Chez S. rechei 210-5, les panneaux foliaires infiltrés montrent une très faible réponse de mort cellulaire au contrôle positif.
La figure 2 montre une gamme d’échelles de notation qui peuvent être utilisées pour quantifier la réponse à Agrobacteriumagroinfiltrée. Les pourcentages de mort cellulaire sont représentés sur une échelle de 0 à 100 %. Les phénotypes observés vont des symptômes macroscopiquement non visibles (0%), à travers une gamme de réponses intermédiaires montrant la chlorose et l’augmentation des niveaux de mort cellulaire, jusqu’à la mort cellulaire confluente (100%).
La figure 3 montre une expérience représentative après l’agroinfection du PVX dans la pomme de terre. Normalement, la mort cellulaire en expansion peut être trouvée aux emplacements environ deux semaines après l’inoculation de dent-pick. Comme le montrent les deux panneaux de la figure, la mort cellulaire en expansion est présente aux sites qui ont été inoculés avec pGR106-CRN2 (contrôle positif à l’aide du crinkler effecteur Crn2), qui est un gène induisant la mort cellulaire générale de P. infestans27. Indépendamment de la réponse mineure aux blessures, aucune mort cellulaire en expansion n’est notée aux sites qui ont été inoculés de dent-pick avec le pGR106-vide (contrôle négatif). Sur la figure 3A,représentant le génotype maR3 de la pomme de terre (Mastenbroek R3), deux effecteurs pGR106 (E1 et E2) n’ont pas induit la mort cellulaire. Sur la figure 3B,on présente un résultat positif du criblage effecteur dans le Solanum huancabambense 354-1 sauvage ; on a observé la réponse de mort cellulaire à deux pGR106-effecteurs (E1-E3, représentant des elicitins)28.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> Figure 1. Examples of agroinfiltration in potato and N. benthamiana. Des plantes comprenant(A)un génotype de pomme de terre MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana, (C) Solanum berthaultii 483-1 et (D) Solanum rechei 210-5 ont été infiltrées avec un mélange de la souche Agrobacterium AGL1(pVirG) 23 contenant pBINplus-R3a et pK7WG2-AVR3a (témoin positif), AGL1 (pvirG) (témoin négatif), pBINplus-R3a, et sept effecteurs (E1-E7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> Figure 2. Quantification des réponses d’agroinfiltration. La photographie montre des échelles de notation représentatives pour la mort cellulaire, allant de 0% (aucun symptôme) à 100% (mort cellulaire confluente). Les réponses intermédiaires vont de réponses faibles telles que la chlorose à l’augmentation des niveaux de mort cellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> Figure 3. Exemples d’agroinfection PVX dans la pomme de terre. Génotype maR3 (Mastenbroek R3)(A)et solanum huancabambense 354-1(B)cure-dent inoculé avec pGR106-CRN2 (témoin positif), pGR106-vide (témoin négatif) et pGR106-E1-2 (effecteurs), ou pGR106-E1-E3, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image</a>.
Tableau 1. Milieu YEB
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 L</td>
			<td>distilléH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>saccharose</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>extrait de bœuf</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>peptone bactériologique</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 g</td>
			<td>extrait de levure</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ml</td>
			<td>MgSO4 (1 M)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2. Vecteurs et souches utilisés pour l’agroinfiltration et l’agroinfection PVX. Plusieurs vecteurs binaires peuvent être utilisés. Les vecteurs de la liste ci-dessous permettent une expression élevée des gènes candidats et ont bien fonctionné entre nos mains. Nous préférons utiliser la souche Agrobacterium GV3101(pMP90)29 chez N. benthamiana et trouvons AGL130 contenant le plasmide auxiliaire pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 plus approprié dans la pomme de terre31. D’autres souches ont été analysées dans d’autres groupes sur diverses plantes modèles, y compris N. benthamiana, mais pas dans la pomme de terre32.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW : passerelle version36
Tableau 3. Milieu MMA. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
Régler le pH à 5,6.

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Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

L’agroinfiltration et l’agroinfection PVX sont des tests fonctionnels de routine pour l’expression ectopique transitoire des gènes dans les plantes. Ces méthodes sont des tests efficaces dans les stratégies effectoromiques (résistance rapide et découverte de gènes avirulence) et cruciales pour la recherche moderne en pathologie moléculaire des plantes. Ils répondent à la demande d’analyses fonctionnelles robustes à haut débit dans les usines.

Agroinfiltration et PVX Agroinfection dans la pomme de terre et Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

agroinfiltration-pvx-agroinfection-potato-nicotiana

Research

JoVE Journal

Biology

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

20.1K vues.  Wageningen University. L’agroinfiltration et l’agroinfection PVX sont des tests fonctionnels de routine pour l’expression ectopique transitoire des gènes dans les plantes. Ces méthodes sont des tests efficaces dans les stratégies effectoromiques (résistance rapide et découverte de gènes avirulence) et cruciales pour la recherche moderne en pathologie moléculaire des plantes. Ils répondent à la demande d’analyses fonctionnelles robustes à haut débit dans les usines.

Vidéo: Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Induite par le virus Gene Silencing (VIGS) dans Nicotiana benthamiana Et aux tomates

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Recherche

Biologie

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration efficace des plantes pour l&#39;expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Optimisation et l&#39;utilisation des<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Médiée par la production de protéines transitoire dans<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Production de protéines de fusion IgG exprimées transitoirement à Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Quantification de l’initiation de la mort cellulaire par imagerie continue

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as the formation of cell death zones on inoculated leaves. Here, a protocol for studying the rate of cell death initiation by imaging inoculated leaves in the time between the cell death initiation and the cell death appearance using a digital microscope is presented. The digital microscope enables a continuous imaging process in desired intervals, which allows an accurate determination of cell death initiation rate up to minutes exactly, as opposed to hours in traditional methods. Imaging with the digital microscope is also independent of light and can therefore be used during day and night without disturbing the circadian rhythm of the plant. Different pathosystems resulting in programmed cell death development could be studied using this protocol with minor modifications. Overall, the protocol thus allows simple, accurate, and inexpensive identification of cell death initiation rate.

Pleins feux sur l’auteur : Une approche simplifiée pour étudier l’initiation de la mort cellulaire dans la réponse hypersensible 

Here we present a protocol for studying the rate of programmed cell death initiation by continuously imaging inoculated leaves following cell death induction.

Étudier l’initiation de la mort cellulaire à l’aide d’un microscope numérique

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

An Experimental Study on Colorado Potato Beetle Hibernation Under Natural Conditions

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and diseases of the CPB are conducted during active feeding stages. Nonetheless, there are fewer studies on resting stages, although these beetles spend most of their life cycle in a state of winter diapause (hibernation). In this work, a method for investigating CPB hibernation under natural conditions was developed and tested, offering an opportunity to collect a sufficient number of individuals in winter. In this article, CPB survival was assessed, and infectious agents at different stages of hibernation were identified. CPB mortality increased during the hibernation, reaching a maximum in April-May. Entomopathogenic fungi (Beauveria, Isaria, and Lecanicillium) and bacteria Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, and Serratia were isolated&#160;from the dead insects. The survival rate of the beetles for the entire hibernation period was 61%. No frozen or desiccated beetles were found, indicating the success of the presented method.

Here we present a method for studying Colorado potato beetle hibernation under the natural conditions of the temperate zone as well as a technique for collecting beetles in winter. This method allows to obtain a desired number of overwintering individuals for various analyses at any stage of hibernation.

Étude expérimentale sur l’hibernation du doryphore de la pomme de terre dans des conditions naturelles

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and ...

Analyse de la résilience de la pomme de terre en cas de stress lié au climat

High Throughput Image-Based Phenotyping for Determining Morphological and Physiological Responses to Single and Combined Stresses in Potato

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions over time. By using multiple imaging sensors, many traits of interest can be assessed, including plant biomass, photosynthetic efficiency, canopy temperature, and leaf reflectance indices. Plants are frequently exposed to multiple stresses under field conditions where severe heat waves, flooding, and drought events seriously threaten crop productivity. When stresses coincide, resulting effects on plants can be distinct due to synergistic or antagonistic interactions. To elucidate how potato plants respond to single and combined stresses that resemble naturally occurring stress scenarios, five different treatments were imposed on a selected potato cultivar (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) at the onset of tuberization, i.e. control, drought, heat, waterlogging, and combinations of heat, drought, and waterlogging stresses. Our analysis shows that waterlogging stress had the most detrimental effect on plant performance, leading to fast and drastic physiological responses related to stomatal closure, including a reduction in the quantum yield and efficiency of photosystem II and an increase in canopy temperature and water index. Under heat and combined stress treatments, the relative growth rate was reduced in the early phase of stress. Under drought and combined stresses, plant volume and photosynthetic performance dropped with an increased temperature and stomata closure in the late phase of stress. The combination of optimized stress treatment under defined environmental conditions together with selected phenotyping protocols allowed to reveal&#160;the dynamics of morphological and physiological responses to single and combined stresses. Here, a useful tool is presented for plant researchers looking to identify plant traits indicative of resilience to several climate change-related stresses.

Pleins feux sur l’auteur : Démêler les réponses des plantes aux stress abiotiques à l’aide de la plateforme robotique PlantScreen

We designed an image-based phenotyping protocol to determine the morphological and physiological responses to single and combined heat, drought, and waterlogging treatments. This approach enabled the identification of early, late, and recovery responses at a whole plant level, particularly above-ground parts, and highlighted the necessity of using multiple imaging sensors.

Phénotypage basé sur l’image à haut débit pour déterminer les réponses morphologiques et physiologiques à des stress uniques et combinés chez la pomme de terre

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions ...