Les auteurs souhaitent te remercier Kim Yates, Eileen Franklin, et Rebecca Tjepkema (soins vétérinaires et de services, Université d&#39;Ottawa) de l&#39;aide pour les chirurgies d&#39;animaux. Lee-Hwa Tai est soutenu par un Fonds de recherche du Québec Fellowship santé. Ce travail a été financé par des subventions de fonctionnement de l&#39;Innovation Grant Institut de recherche de la Société canadienne du cancer, Ministère de la Recherche et du Développement Bourse de nouveaux chercheurs de l&#39;Ontario et de la Fondation canadienne pour l&#39;innovation - Subvention d&#39;appui du chef de Rebecca Auer.

Une. Le maintien 4T1 cellules tumorales in vitro <ol><li> des cellules tumorales non modifiées 4T1 de culture dans du DMEM complet (DMEM, 10% de FBS, 1 x pénicilline / streptomycine) dans des plaques de 10 cm pour culture de tissus. Incuber à 37 ° C, 5% CO 2 incubateur de culture tissulaire. </li><li> cultures Split 2-3 fois / semaine. Pour maintenir les cellules de viabilité optimales ne doivent pas dépasser 80% de confluence. Ne pas utiliser des cellules pour établir des tumeurs primaires in vivo si les cultures ont été exposées in vitro pour&gt; 1 mois à compter de cette malignité et diminue le potentiel métastatique de cellules à des passages plus tôt. </li></ol> 2. Récolte 4T1 cellules tumorales pour injection <ol><li> Aspirer le milieu de culture à partir de la plaque de culture de tissu à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur. </li><li> Ajouter 10 ml de PBS 1x stérile contenant 2 ml d&#39;EDTA. Laisser la solution PBS incuber la plaque à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur de culture tissulaire pour 5-7 min. </li><li> Solution PBS récolte de la plaque, rinsing la plaque 2-3x avec une solution, transférer 15 ml tube conique. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g, à 4 ° C, dans une centrifugeuse de paillasse. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans du DMEM sans sérum. </li><li> Déterminer la concentration des cellules en utilisant un compteur de cellules. </li><li> Diluer les cellules avec du milieu sans sérum à 1x10 6 cells/500 ul (1x10 5 cellules/50 ul (pour injection et de placer les cellules sur de la glace. </li></ol> 3. L&#39;injection des souris avec des cellules tumorales 4T1 Toutes les études réalisées sur l&#39;animal étaient en conformité avec les directives institutionnelles aux Services vétérinaires de protection des animaux de l&#39;Université d&#39;Ottawa de recommandations pour tous les animaux recevant des injections ou des implants orthotopiques tumorales. <ol><li> Offrez-souris sous-cutanée avec la buprénorphine (0,05 mg / kg) 1 h avant la chirurgie pour la gestion de la douleur. </li><li> Induire et maintenir une souris sous anesthésie à l&#39;aide de 2,5% d&#39;isoflurane pendant la durée de l&#39;injectiontion. Pincez la patte de la souris pour détecter réponse réflexe. Si rien n&#39;est détecté, les niveaux d&#39;anesthésie efficaces sont atteints. Lubrifiant oculaire stérile est ensuite appliquée pour éviter un dessèchement de la cornée. </li><li> Chargez un 30 G ½ en seringue &quot;Ultra-fine&quot; avec exactement 50 pi de suspension de cellules. S&#39;assurer que toutes les bulles d&#39;air sont éliminées de la colonne de seringue en appuyant sur le côté de la seringue afin de déloger les bulles d&#39;air. </li><li> Placez la souris (sous anesthésie) ventrale vers le haut. </li><li> Nettoyez le site d&#39;injection à l&#39;aide d&#39;un tampon imbibé d&#39;alcool et d&#39;introduire l&#39;aiguille horizontalement et directement dans la 4ème coussinet adipeux mammaire, passer lentement le volume de la seringue. </li><li> Utilisez un coton-tige pour nettoyer toute fuite possible. </li><li> Permettre souris pour récupérer de l&#39;anesthésie. </li><li> Maintenir la buprénorphine (0,05 mg / kg) pour la gestion de la douleur sc administré toutes les 8 h pendant 2 jours. </li></ol> 4. Administrer le traitement péri-opératoire dans 4T1 tumorales portant souris BALB / c <ol><li> 13 jours d&#39;injection de cellule post-tumorale, de mesurer la tumeur primaire à l&#39;aide d&#39;un étrier externe. Mesurer le plus grand diamètre longitudinal (longueur) et le plus grand diamètre transversal (largeur) de l&#39;étrier. La formule ellipsoïdale modifiée est utilisée pour calculer le volume de la tumeur (volume de la tumeur = 1/2 (longueur, une largeur 2) </li><li> 13 jours d&#39;injection de cellules post-tumeur, la tumeur primaire doit mesurer environ 1 cm 3. Lorsque cette mesure est atteint d&#39;une tumeur, de préparer le réactif de traitement péri-opératoire. </li><li> Virus oncolytique est un thérapeutique innovante que l&#39;on peut administrer pendant la période périopératoire. Préparer virus oncolytique (1x10 9 PFU / 1 ml) en 1x PBS stérile et placer sur la glace avant l&#39;injection. </li><li> Souris sécurisé et lieuen dispositif de retenue pour injection intraveineuse dans la veine caudale. </li><li> Chauffer doucement la queue de la souris dans l&#39;eau chaude du robinet pour visualiser latérales veines de la queue. </li><li> Chargez un 27 G ½ &quot;seringue à insuline&quot; avec précisément 100 pi de traitement du virus oncolytique. Veiller à ce que toutes les bulles d&#39;air sont éliminées de la colonne de la seringue. </li><li> Injecter la souris avec 1x10 8 PFU/100 ul / souris à un des veines de la queue latérales. Si l&#39;aiguille est correctement inséré dans une veine latérale, pas de résistance devrait être sentie en appuyant sur la seringue. </li></ol> 5. La résection complète de la tumeur et abdominale gauche néphrectomie <ol><li> 14 jours d&#39;injection de cellule post-tumorale, initier les soins périopératoires routine suivante Université d&#39;Ottawa Animal Care Service vétérinaire et protocoles approuvés. Offrez-souris sous-cutanée avec la buprénorphine (0,05 mg / kg) 1 h avant la chirurgie pour la gestion de la douleur. Induire et maintenir une anesthésie en utilisant 2,5% d&#39;isoflurane pendant la chirurgie. Under conditions et en utilisant des instruments chirurgicaux stériles stérilisés, site chirurgical est rasée et nettoyée. Les animaux sont administrés fluides sous-cutanés et lubrifiant oculaire avant la chirurgie. </li><li> Faire une petite incision (1-2 cm de longueur) pour enlever délicatement et complètement le primaire 4T1 tumeur du coussinet adipeux mammaire. </li><li> Fermer l&#39;incision avec 2-3 de 9 mm agrafes. </li><li> Exposer l&#39;abdomen en coupant à travers la peau et la couche sous-cutanée le long de la ligne médiane ventrale de la souris. </li><li> Faire une incision à la ligne blanche (3-4 cm) pour accéder péritoine de la souris. </li><li> Exposer le côté intérieur gauche de l&#39;abdomen en déplaçant les entrailles recouvrant sur le côté. Assurez-vous que les intestins sont maintenues humides avec une gaze stérile saline trempé. </li><li> En utilisant une paire de pinces chirurgicales émoussé, saisir le rein gauche doucement. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un enduit de cire 3-0 suture tressée de soie noué dans une boucle, ligaturer le hile du rein gauche et le fixer avec 3 nœuds chirurgicaux. Retirez le rein gauche avec Surgiciseaux cal. </li><li> Inspectez soigneusement la cravate de suture afin de s&#39;assurer que l&#39;hémostase adéquate est obtenue. </li><li> Fermez la couche sous-cutanée avec une suture en boucle continue en utilisant 5-0 couche tressé résorbable, puis agrafer la peau à l&#39;aide de 9 mm agrafes. Les étapes 5.2 à 5.10 doivent exiger 10 min / animal. </li><li> Maintenir la buprénorphine (0,05 mg / kg) pour la gestion de la douleur sc administré toutes les 8 h pendant 2 jours. </li></ol> 6. Souris euthanasier et de traitement et la quantification des tumeurs du poumon fardeau <ol><li> 28 jours après l&#39;injection de la tumeur 4T1, euthanasier les souris selon le soin des animaux et les services vétérinaires protocole à l&#39;Université d&#39;Ottawa. </li><li> Arroser souris avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Faire une incision initiale avec des ciseaux juste en dessous de la cage thoracique. </li><li> Exposer le thorax en coupant à travers la peau et la couche sous-cutanée le long de la ligne médiane ventrale de la cavité de la poitrine de la souris. </li><li> Faire des incisions latérales à travers la peau et du tissu de chaque côté jusqu&#39;à la neck de la souris. </li><li> Disséquer les poumons en saisissant doucement le poumon tout en coupant loin le tissu conjonctif ci-dessus et ci-dessous les poumons. </li><li> Presoak extrait poumons dans du PBS froid pour enlever les résidus de sang, puis placez dans 10% tamponnée de formaldéhyde. </li><li> Photographier chaque poumon pour l&#39;évaluation des métastases tumorales. Peser les poumons pour la quantification de la charge tumorale. </li></ol>

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Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

La résection chirurgicale est la pierre angulaire du traitement pour les patients atteints de tumeurs solides localisées. Même avec une résection complète, de nombreux patients développent une récidive métastatique et finissent par mourir de leur maladie. La période post-opératoire immédiate fournit un environnement idéal pour la formation de métastases cancéreuses, modulé, en grande partie, par la suppression postopératoire des cellules NK. Malgré cela, il reste une fenêtre thérapeutique qui est largement ignorée. Il n&#39;existe actuellement aucun traitement anti-cancéreux périopératoires standards visant à prévenir les métastases postopératoires. Le défi actuel est d&#39;identifier des thérapies sûres et prometteuses qui activent les cellules NK dans la période périopératoire empêchant ainsi l&#39;établissement de la maladie micrométastatique. Ces thérapies doivent être caractérisés de façon rigoureuse pour la sécurité et l&#39;efficacité dans des modèles animaux précliniques et ensuite traduits en essais cliniques soigneusement conçu. Le rapport principalnale de développement d&#39;un modèle de tumeur de souris de stress chirurgical est d&#39;explorer les mécanismes de l&#39;immunosuppression et la dissémination métastatique après chirurgie et d&#39;évaluer les immunothérapies innovantes à fort potentiel pour une utilisation future chez les patients cancéreux qui subissent une chirurgie pour enlever la tumeur primaire. Pour atteindre cet objectif, un modèle murin 4T1 de carcinome mammaire couplé avec le stress chirurgical a été développé. Alors que la lignée cellulaire 4T1 est une souris &quot;carcinome mammaire&quot;, la raison d&#39;utiliser cette lignée cellulaire est la reproductibilité des métastases spontanées qui nous permet d&#39;évaluer les effets du stress chirurgical dans un modèle de cancer réaliste. Dans ce contexte, l&#39;origine réelle de la tumeur maligne est moins important que la biologie potentiel et tumeur métastatique. Le second composant essentiel de notre modèle est la mise au point d&#39;une procédure chirurgicale animale pour ressembler étroitement la chirurgie du cancer humain. Dans cet animal chirurgicale modèle de stress, le primaire 4T1 tumeur du sein est excisé après avoir atteint 1 cm 3. Parce quechirurgies du cancer chez des patients humains impliquent la suppression immunitaire significative, une néphrectomie à ventre ouvert dans les groupes de traitement de «stress chirurgical» est en outre effectué. Comme il compare avec plus d&#39;une résection tumorale classique chez les humains, le caractère invasif d&#39;une néphrectomie totale gauche est très comparable à de nombreux types de traitements chirurgicaux pour les tumeurs solides, y compris une intervention chirurgicale pour un cancer colorectal, le cancer de l&#39;ovaire, le cancer du rein, le cancer du pancréas, du poumon et de l&#39;œsophage cancer. En outre, nous dirions que les changements physiologiques profonds qui se produisent en période périopératoire, en raison de la laparotomie + néphrectomie, reproduit adéquatement les changements physiologiques qui se produisent écrasante après la chirurgie invasive pour la plupart des tumeurs solides. Pour contrôler les facteurs périopératoires qui pourraient conduire à un excès de stress chirurgical et la mortalité, la durée de l&#39;anesthésie et de la chirurgie et de maintenir la température du corps au cours de la chirurgie est précisément définie. Tous ces paramètres sont exécutés précisément uned définie dans notre protocole de chirurgie pour refléter les soins périopératoires routine chez les patients cancéreux humains. Le calendrier des traitements périopératoires est un élément essentiel supplémentaire pour le modèle de sauvetage périopératoire. Souris porteuses 4T1 tumorales ont été précédemment traités avec 3 régimes de vaccin contre la grippe: néoadjuvante (donné 5 jours avant la chirurgie), périopératoire (donnée le même jour de la chirurgie) et périopératoire + multidose (donné le jour de la chirurgie, suivis par 2 doses supplémentaires donnés cinq jours d&#39;intervalle). Remarquablement, les 3 modes de traitement de vaccin ont diminué de manière significative des métastases pulmonaires 22. Toutefois, le vaccin antigrippal administré en péri-opératoire en une seule dose métastases réduites plus efficacement. Collectivement, ces expériences mettent en évidence l&#39;importance de la période péri-opératoire immédiat comme une fenêtre thérapeutique étroite à intervenir dans le processus métastatique. Utilisation périopératoire d&#39;immunothérapies innovantes telles que oncolyvirus tic et vaccins a été exclusivement limitée à notre groupe de recherche. Nous avons démontré pour la première fois que l&#39;administration périopératoire de virus oncolytique roman de l&#39;ORF et la vaccine peut inverser la suppression de cellules NK après la chirurgie dans des modèles animaux 1. Plus important encore, ce sauvetage de la fonction immunitaire est en corrélation avec une réduction de la formation de métastases post-opératoires. Dans les études humaines, les patients de chirurgie du cancer postopératoires avaient réduit cytotoxicité des cellules NK et périopératoire OV augmente nettement l&#39;activité des cellules NK chez les patients cancéreux 1. Utilisation de vaccins prophylactiques disponibles dans le commerce, nous avons démontré que la grippe périopératoire administration du vaccin a réduit de façon significative les métastases tumorales et amélioré la cytotoxicité des cellules NK dans des modèles de tumeur précliniques. Dans les études humaines, le vaccin antigrippal amélioré de manière significative l&#39;activité des cellules NK chez des donneurs humains en bonne santé et les patients de chirurgie du cancer 22. Plusieurs approches sont utilisées pour réduire cancer récidive, y compris la chimiothérapie et la radiation, mais ces traitements sont habituellement administré semaines à quelques mois avant (néoadjuvante) ou après (adjuvant) chirurgie. La recherche dans ce domaine montre que la période post-opératoire immédiate est essentielle pour déterminer le taux de récidive de la tumeur à long terme. Par conséquent, les interventions cliniques sous la forme d&#39;immunothérapies au cours de cette période critique peut avoir des avantages considérables à long terme. Nos études utilisant un modèle murin de métastases pulmonaires spontanées et stress chirurgical offrent une occasion unique d&#39;explorer de nouvelles thérapies et de déterminer leur potentiel de prévenir l&#39;immunosuppression périopératoire chez les patients de chirurgie du cancer et ainsi réduire également le taux de récidive du cancer.

La chirurgie est une composante essentielle dans le traitement curatif du cancer de tumeurs solides, mais en dépit de résection complète, de nombreux patients développent une récidive métastatique et finalement mourir de leur maladie. De plus en plus, de la période post-opératoire, à la suite de la réponse à un stress physiologique pour la chirurgie, notamment la coagulation du sang, la libération de facteurs de croissance, et la suppression immunitaire, est reconnu comme temps critique pour le développement des métastases. Notre 1,2 de groupe et d&#39;autres 5.3 ont montré que la période post-opératoire immédiate est un moment unique sensible à la formation de métastases. L&#39;un des principaux mécanismes responsables des effets prometastatic de la chirurgie est la dysfonction postopératoire de Natural Killer (NK) 1-3. Les cellules NK sont des lymphocytes cytotoxiques du système immunitaire inné impliquée dans le contrôle de la croissance tumorale et les métastases 6. Dysfonctionnement des cellules NK après la chirurgie a été documenté in deux patients humains 1,7-9 et des modèles animaux 1,10,11. La suppression des cellules NK postopératoire est corrélée avec une augmentation des métastases dans les modèles animaux de métastases spontanées et implantés 1,11-14, tandis que dans des études humaines, activité NK bas pendant la période péri-opératoire est associée à un taux de récidive du cancer et de la mortalité 15,16 ultérieure. Malgré cela, il n&#39;existe actuellement aucun traitement de cancer portant spécifiquement sur les changements qui se produisent prometastatic immédiatement après la chirurgie du cancer. La période périopératoire représente une fenêtre d&#39;opportunité thérapeutique dans lequel d&#39;intervenir dans le processus métastatique. Alors que les traitements du cancer traditionnels, tels que la chimiothérapie cytotoxique, sont considérés comme trop toxiques pour être administré à des patients qui se remettent d&#39;une chirurgie majeure 17, thérapies immunitaires sont des candidats idéaux pour l&#39;administration périopératoire. Utilisation périopératoire de l&#39;IL-2 et IFN-Î ³ recombinant ont été explorées in première phase des essais cliniques démontrant leur capacité à empêcher la suppression postopératoire des cellules NK et améliorer la survie sans progression 18-21. Malheureusement, le développement a été entravé par la tolérance de ce traitement par une cytokine non spécifique associée à une intervention chirurgicale majeure 17. Les virus sont également des activateurs non spécifiques puissants des cellules NK. Notre recherche a déjà démontré que l&#39;administration préopératoire de virus se répliquant, comme roman anti-cancer virus oncolytiques (OV), et nonreplicating vaccins viraux, tels que le vaccin de la grippe, peut inhiber NK dysfonctionnement cellulaire induite par la chirurgie et atténuer la maladie métastatique 1,22. Le modèle chirurgical décrit dans le présent document a facilité notre compréhension des mécanismes impliqués dans la propagation et la croissance des cellules tumorales après la chirurgie et nous a permis d&#39;explorer de nouvelles thérapies ciblées qui peuvent être administrés dans la période périopératoire. Pour atteindre cet objectif, un animalmodèle de stress chirurgical et la métastase spontanée wad développé. Le modèle utilise des tumeurs de carcinome mammaire de la souris (BALB / c 4T1) - qui sont capables de former des métastases spontanément à partir de la glande mammaire primaire de plusieurs sites distants, en particulier les poumons. Au jour 0, des cellules de cancer du sein sont implantés dans le coussinet adipeux mammaire de la souris. Au jour 14 après implantation de la tumeur, une résection complète de la tumeur mammaire primaire est réalisée dans tous les animaux. Un sous-groupe d&#39;animaux reçoit le stress chirurgical supplémentaire sous la forme d&#39;une néphrectomie abdominale. Au jour 28, les nodules de tumeur pulmonaire dans chirurgicalement souligné et aucune souris témoins par rapport à la chirurgie sont isolés et quantifiés. Dans ce modèle animal de cancer et de la chirurgie, les effets de la chirurgie sur les métastases cancéreuses sont à l&#39;étude et l&#39;efficacité de l&#39;administration péri-opératoire des immunothérapies innovantes, y compris la replication et nonreplicating immuns stimulants à base de façon virale sont testés pour la première fois.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:111px;">Corning Cell-Gro</td>
			<td style="width:153px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:111px;">HyClone</td>
			<td style="width:153px;">SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:153px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1X sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:111px;">Corning cell gro</td>
			<td style="width:153px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:111px;">Chiron, Guelph</td>
			<td style="width:153px;">RXN309968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:111px;">Baxter Corp</td>
			<td>1001936040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1/2 ultra-fine syringe</td>
			<td style="width:111px;">Terumo</td>
			<td>30 Gauge, SS05M3009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">9mm staples</td>
			<td style="width:111px;">Braintree</td>
			<td style="width:153px;">ACS BX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 braided absorbable suture</td>
			<td style="width:111px;">Covidien</td>
			<td style="width:153px;">UL-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3-0 wax braided silk suture</td>
			<td style="width:111px;">Covidien</td>
			<td style="width:153px;">S-194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formalin</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td style="width:153px;">SF100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4T1 tumor cells</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:153px;">CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BALB/c</td>
			<td style="width:111px;">Charles Rivers Labs</td>
			<td style="width:153px;">Strain Code:028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies

La résection chirurgicale est un traitement essentiel pour la plupart des patients atteints de cancer, mais la chirurgie induit un dysfonctionnement dans le système immunitaire, ce qui a été liée au développement d&#39;une maladie métastatique dans des modèles animaux et chez les patients cancéreux. Travail préclinique de notre groupe et d&#39;autres ont démontré une suppression profonde de la fonction immunitaire innée, en particulier les cellules NK dans la période postopératoire et ce joue un rôle majeur dans le développement accru de métastases après la chirurgie. Relativement peu d&#39;études sur les animaux et des essais cliniques ont porté sur la caractérisation et inverser les effets néfastes de la chirurgie du cancer. En utilisant un modèle animal rigoureuse des tumeurs métastasiques spontanément et le stress chirurgical, la mise en valeur de la chirurgie du cancer sur le développement des métastases pulmonaires a été démontrée. Dans ce modèle, des cellules de cancer du sein 4T1 sont implantées dans la souris coussinet adipeux mammaire. Au jour implantation de la tumeur 14 de poste, une résection complète de la tumeur mammaire primaire est performed chez tous les animaux. Un sous-groupe d&#39;animaux reçoit le stress chirurgical supplémentaire sous la forme d&#39;une néphrectomie abdominale. Au jour 28, nodules tumoraux du poumon sont quantifiés. Lorsque l&#39;immunothérapie a été donnée immédiatement avant l&#39;opération, une activation profonde des cellules immunitaires qui a empêché le développement de métastases après la chirurgie a été détectée. Bien que le modèle de la chirurgie de la tumeur du sein 4T1 permet la simulation des effets du stress chirurgical abdominal sur les métastases tumorales, son applicabilité à d&#39;autres types de tumeur doit être testé. Le défi actuel est d&#39;identifier les immunothérapies sûres et prometteuses dans des modèles précliniques de souris et de les traduire en thérapies périopératoires viables à être administré à des patients de chirurgie du cancer de prévenir la réapparition de la maladie métastatique.

Un modèle de souris reproductible de stress chirurgical qui se traduit par l&#39;amélioration spectaculaire des métastases pulmonaires a été développé. Au jour 28 après 4T1 inoculation de la tumeur (et 14 jours après la résection tumorale + / - néphrectomie abdominale), les poumons ont été récoltés et visualisés de métastases. Chirurgie augmente nettement la quantité de métastases pulmonaires par comparaison aux souris non traitées comme démontré par des images, des poumons (Figure 1A), le dénombrement des nodules pulmonaires (figure 1B) et le poids des poumons (Figure 1C). L&#39;administration préopératoire de la réplication virale oncolytique et vaccin antigrippal inactivé sauve considérablement les effets prometastatic de la chirurgie du cancer (figures 1A-C). Pour déterminer si les cellules NK jouent un rôle de médiateur dans la prévention des métastases traitement post-vaccin, les cellules NK ont été épuisés sur le plan pharmacologique utilisant des anticorps anti-asialo-GM-1 dans le modèle de métastase de la tumeur. En l&#39;absence de NKcellules, nous avons observé une abrogation de l&#39;effet thérapeutique de l&#39;immunothérapie périopératoires (Figures 2A et 2B). Ces données suggèrent que la suppression des métastases tumorales dans notre modèle de stress chirurgical est principalement médiée par le virus de la grippe et le vaccin oncolytique activation des cellules NK et NK lyse tumorale médiée par la suite. Pour caractériser la fonction des cellules NK après l&#39;administration périopératoire de virus oncolytique et vaccin contre la grippe, ex vivo des cellules NK meurtre a été évaluée. Brièvement, mis en commun et triés DX5 + les cellules NK ont été isolées à partir de splénocytes de chirurgicalement stressé et les souris témoins. Ils ont été co-cultivées pendant 4 heures avec du chrome marqué YAC-1 des cellules cibles, à l&#39;effecteur à la cible différent ratios, suivie par mesure de la libération de chrome surnageant avec un compteur gamma. Une chirurgie défaut important induit dans cytotoxicité des cellules NK avec une reprise significative de NK meurtre après l&#39;administration périopératoire de virus oncolytique et inflvaccin uenza par rapport à la chirurgie seule (figures 2C et 2D) a été observée. Pris ensemble, ces résultats démontrent que la suppression des cellules NK périopératoire peut être traitée avec succès et une maladie métastatique réduit avec de nouvelles thérapies immunostimulantes. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51253/51253fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51253/51253fig1.jpg" /> Figure 1. Nouveau vaccin anti-cancer oncolytique virus et la grippe comme traitement périopératoire contre l&#39;amélioration induite par chirurgie des métastases pulmonaires. Évaluation de 4T1 métastases tumorales du poumon à jour 28 groupes de traitement indiqués par (A) des photos de poumons représentatifs, (B) l&#39;énumération de tumeur du poumon nodules et (C) poids des poumons. Les données sont représentatives de 3 expériences similaires avec n = 5-10/group (*, p = 0,01; **, p &lt;0,0001;<html> ns, non significatif). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51253/51253fig2.jpg" /> Figure 2. Stress chirurgical augmente métastases tumorales pulmonaires par l&#39;altération des cellules NK. (A, B) Quantification de métastases de tumeurs du poumon chez les souris traitées par voie chirurgicale a souligné avec une thérapie périopératoire roman. (C, D) La capacité des DX5 + purifiées à partir de cellules NK chirurgicalement souligné et les témoins non traités pour tuer les cellules tumorales. Les données sont affichées comme pour cent de moyenne (+ / - écart-type) de libération de chrome de trois puits pour la indiquée rapports E: T. Les données sont représentatives de 3 expériences similaires où n = 4-5/group (*, p = 0,01; **, p &lt;0,005; ns, non significatif)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Un modèle de tumeur de souris de stress chirurgical est utilisé pour explorer comment l&#39;immunosuppression postopératoire favorise la maladie métastatique et pour évaluer les thérapies périopératoires immunostimulantes.

Une tumeur modèle murin de stress chirurgical à explorer les mécanismes de l&#39;immunosuppression postopératoire et évaluer de nouvelles immunothérapies périopératoires

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

29.8K vues.  Ottawa Hospital Research Institute.  Un modèle de tumeur de souris de stress chirurgical est utilisé pour explorer comment l'immunosuppression postopératoire favorise la maladie métastatique et pour évaluer les thérapies périopératoires immunostimulantes. 

Vidéo: A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Méthode pour le développement de nouveaux médicaments anti-cancer en utilisant des explants des tumeurs des spécimens chirurgicaux


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Recherche

Médecine

Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused by whole-body hypoperfusion.5,6 Successful reproduction of whole-body hypoperfusion in rodent models has been fraught with 
difficulty.7-9,9,10 Models which employ focal ischemia have repeatedly demonstrated results which do not translate to the clinical setting, and larger 
animal models which allow for whole body hypoperfusion lack access to the full toolset of genetic manipulation possible in the mouse.11,12 However, in recent 
years a mouse model of cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation has emerged which can be adapted to model AKI.13 This model reliably reproduces 
physiologic, functional, anatomic, and histologic outcomes seen in clinical AKI, is rapidly repeatable, and offers all of the significant advantages of a murine surgical 
model, including access to genetic manipulative techniques, low cost relative to large animals, and ease of use. Our group has developed extensive experience 
with use of this model to assess a number of organ-specific outcomes in AKI.14,15

A powerful model for perioperative and critical care related acute kidney injury is presented. Using whole body hypoperfusion induced by cardiac arrest it is possible to nearly replicate the histologic and functional changes of clinical AKI.

Normothermique arrêt cardiaque et la réanimation cardiorespiratoire: un modèle murin de l&#39;ischémie-reperfusion

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused ...

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our understanding of the mechanisms underlying parkinsonian symptoms, since it recapitulates the changes in basal ganglia circuitry and pharmacology observed in parkinsonian patients1-4. However, the precise cellular and molecular changes occurring at cortico-striatal synapses of the output pathways within the striatum, which is the major input region of the basal ganglia remain elusive, and this is believed to be site where pathological abnormalities underlying parkinsonian symptoms arise3,5.
In PD, understanding the mechanisms underlying changes in basal ganglia circuitry following degeneration of the nigro-striatal pathway has been greatly advanced by the development of bacterial artificial chromosome (BAC) mice over-expressing green fluorescent proteins driven by promoters specific for the two striatal output pathways (direct pathway: eGFP-D1; indirect pathway: eGFP-D2 and eGFP-A2a)8, allowing them to be studied in isolation. For example, recent studies have suggested that there are pathological changes in synaptic plasticity in parkinsonian mice9,10. However, these studies utilised juvenile mice and acute models of parkinsonism. It is unclear whether the changes described in adult rats with stable 6-OHDA lesions also occur in these models. Other groups have attempted to generate a stable unilaterally-lesioned 6-OHDA adult mouse model of PD by lesioning the medial forebrain bundle (MFB), unfortunately, the mortality rate in this study was extremely high, with only 14% surviving the surgery for 21 days or longer11. More recent studies have generated intra-nigral lesions with both a low mortality rate &gt;80% loss of dopaminergic neurons, however expression of L-DOPA induced dyskinesia11,12,13,14 was variable in these studies. Another well established mouse model of PD is the MPTP-lesioned mouse15. Whilst this model has proven useful in the assessment of potential neuroprotective agents16, it is less suitable for understanding mechanisms underlying symptoms of PD, as this model often fails to induce motor deficits, and shows a wide variability in the extent of lesion17, 18.
Here we have developed a stable unilateral 6-OHDA-lesioned mouse model of PD by direct administration of 6-OHDA into the MFB, which consistently causes &gt;95% loss of striatal dopamine (as measured by HPLC), as well as producing the behavioural imbalances observed in the well characterised unilateral 6-OHDA-lesioned rat model of PD. This newly developed mouse model of PD will prove a valuable tool in understanding the mechanisms underlying generation of parkinsonian symptoms.

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson&#039;s Disease

A protocol for performing unilateral 6-OHDA lesions of the medial forebrain bundle in mice is described. This method has a low mortality rate (13.3 %) with 89% of the surviving animals showing &#62;95% loss of striatal dopamine and 90.63&#177;-4.02 % ipsiversive rotational bias towards the side of the lesion.

Développement d&#39;une manière unilatérale-lésés 6-OHDA modèle murin de la maladie de Parkinson

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several techniques, including infusion of exogenous bacterial toxin (endotoxemia) or bacteria (bacteremia), as well as surgical perforation of the cecum by cecal ligation and puncture (CLP)1-3. CLP allows bacteria spillage and fecal contamination of the peritoneal cavity, mimicking the human clinical disease of perforated appendicitis or diverticulitis. The severity of sepsis, as reflected by the eventual mortality rates, can be controlled surgically by varying the size of the needle used for cecal puncture2. In animals, CLP induces similar, biphasic hemodynamic cardiovascular, metabolic, and immunological responses as observed during the clinical course of human sepsis3. Thus, the CLP model is considered as one of the most clinically relevant models for experimental sepsis1-3.
Various animal models have been used to elucidate the intricate mechanisms underlying the pathogenesis of experimental sepsis. The lethal consequence of sepsis is attributable partly to an excessive accumulation of early cytokines (such as TNF, IL-1 and IFN-&gamma;)4-6 and late proinflammatory mediators (e.g., HMGB1)7. Compared with early proinflammatory cytokines, late-acting mediators have a wider therapeutic window for clinical applications. For instance, delayed administration of HMGB1-neutralizing antibodies beginning 24 hours after CLP, still rescued mice from lethality8,9, establishing HMGB1 as a late mediator of lethal sepsis. The discovery of HMGB1 as a late-acting mediator has initiated a new field of investigation for the development of sepsis therapies using Traditional Chinese Herbal Medicine. In this paper, we describe a procedure of CLP-induced sepsis, and its usage in screening herbal medicine for HMGB1-targeting therapies.

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection, and can be simulated by a surgical technique termed cecal ligation and puncture (CLP). Here we describe a method to use CLP-induced animal model to screen medicinal herbs for therapeutic agents.

L&#39;utilisation de modèle animal de sepsis pour évaluer de nouvelles thérapies à base de plantes

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Une nouvelle approche chirurgicale pour l&#39;administration intratrachéale d&#39;agents bioactifs dans un modèle de souris fœtale

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Initiation de carcinome du sein métastatique en ciblant de l&#39;épithélium canalaire avec adénovirus Cre: un modèle de souris transgénique roman du cancer du sein

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

L&#39;isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes d&#39;un cancer Modèle Souris

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

A Novel Murine Model of Arteriovenous Fistula Failure: The Surgical Procedure in Detail

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the exact pathophysiology remains unknown. In order to unravel the pathophysiology a murine model of AVF-failure was developed in which the configuration of the anastomosis resembles the preferred situation in the clinical setting. A model was described in which an AVF is created by connecting the venous end of the branch of the external jugular vein to the side of the common carotid artery using interrupted sutures. At a histological level, we observed progressive stenotic intimal lesions in the venous outflow tract that is also seen in failed human AVFs. Although this procedure can be technically challenging due to the small dimensions of the animal, we were able to achieve a surgical success rate of 97% after sufficient training. The key advantage of a murine model is the availability of transgenic animals. In view of the different proposed mechanisms that are responsible for AVF failure, disabling genes that might play a role in vascular remodeling can help us to unravel the complex pathophysiology of AVF failure.

Here we present a murine model of arteriovenous fistula (AVF) failure in which a clinically relevant anastomotic configuration is incorporated. This model can be used to study the pathophysiology and to test possible therapeutic interventions.

A Novel modèle murin de la fistule artério-veineuse échec: la procédure chirurgicale en détail

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

À l’aide de In Vitro imagerie de cellules vivantes pour explorer les agents chimiothérapeutiques livré par nanoparticules à base de lipides

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...