Ce travail a été soutenu par des subventions de fonctionnement à KJ du Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et la maladie de Crohn et la colite Foundation of Canada (CCFC). VM est soutenu par une bourse CFRI et GB une bourse d&#39;études supérieures des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). BAV est un des enfants avec des troubles intestinaux et hépatiques Fondation (ENFANT) président de pédiatrie recherche sur les MII et la Chaire de recherche du Canada en gastroentérologie pédiatrique et KJ est un clinicien-chercheur principal soutenu par enfant et l&#39;enfant and Family Research Institute (CFRI) Programme des cliniciens chercheurs Prix , Université de la Colombie-Britannique.

Procédures portant sur des sujets d&#39;animaux suivent les directives de protection des animaux énoncées par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) à l&#39;Université de la Colombie-Britannique. Procédures mentionnées dans ce protocole seront décrits pour les rats et les souris, alors que les résultats représentatifs seront présentés à partir de rats Sprague-Dawley. Une. Préparation de DNBS et de l&#39;administration intrarectale <ol><li> Pour instillation rectale de DNBS chez le rat, fraîchement préparer 15-30 mg de DNBS/250 ul de 50% d&#39;éthanol. Pour les souris, préparer 2-6 mg de DNBS/100 ul d&#39;éthanol à 50%. Remarque: Optimiser la concentration de DNBS exacte à administrer à chaque installation. Des rats mâles Sprague-Dawley et des souris C57BL / 6 sont préférés pour l&#39;induction de la colite DNBS, cependant, d&#39;autres souches de souris et de rat, peuvent être utilisés. Les souris et les rats traités seulement avec 50% d&#39;éthanol peuvent être utilisés comme groupes témoins mais étant donné les effets de l&#39;éthanol sont doux ou absent, on peut omit l&#39;inclusion de ce groupe pour une étude de 12. </li><li> Attacher une seringue de 1 ml à une aiguille G 19, qui a un cathéter en polyethylene (PE-90 - les rats ou PE-50 - souris) fixée à son extrémité. </li><li> Légèrement anesthésier le rat ou de repos de la souris sur un coussin chauffant (par exemple en administrant 1,5% d&#39;isoflurane par cône, les animaux devraient toujours avoir le réflexe palpébral et de la déglutition et de la respiration régulière afficher). Appliquer le gel lacrymogène à ses yeux pour éviter les yeux se dessécher. </li><li> Appuyez doucement du bout des doigts à l&#39;extrémité postérieure de l&#39;animal pour éliminer toute selles qui peuvent être présents dans le côlon distal. </li><li> Insérez délicatement le cathéter intra-rectale, avec le cathéter pour atteindre environ 8 cm de l&#39;anus chez les rats, ou 3-4 cm pour les souris. Injecter une petite quantité de la solution lors de l&#39;insertion du cathéter à lubrifier, ce qui permet l&#39;insertion facile. Remarque: Si une résistance se fait sentir lors de l&#39;insertion du cathéter, ne continuez pas à insérer car cela peut mener à la perforation dela paroi intestinale. Retirer le cathéter et tenter de réinsérer doucement, lubrification à nouveau le côlon procédure. </li><li> Injecter lentement 250 (rats) ou 100 (souris) ul de DNBS, ou un volume égal ou 50% d&#39;éthanol pour les contrôles. Après injection de la DNBS, positionner l&#39;animal la tête en bas pendant 90 secondes pour éviter la perte de la DNBS. </li><li> Après administration DNBS, nourrir les animaux 8% d&#39;eau de saccharose dans une solution saline à 0,2% pour éviter la déshydratation au cours de la première semaine. </li><li> Observer attentivement les animaux, avec un suivi quotidien pour perdre du poids et des signes de déshydratation ou de détresse pour la durée de l&#39;expérience. Remarque: La perte de poids peut approcher rapidement les recommandations du CCPA de perte de poids maximal admissible. Depuis ce essentiellement dérivée de la déshydratation, perte de poids doit être utilisé comme un indicateur de l&#39;administration de la solution de Ringer lactate pour limiter la déshydratation. S&#39;il vous plaît assurez-vous de consulter le vétérinaire de l&#39;établissement sur les questions de santé, le cas échéant. </li></ol> 2. Collecting tissus et l&#39;évaluation des dommages histologiques dans DNBS de souris infectées <ol><li> Au point de temps souhaité après la provocation avec DNBS, euthanasier les animaux par surdosage avec de l&#39;isoflurane dans une chambre d&#39;anesthésie complété avec suffisamment d&#39;oxygène. Observer l&#39;animal jusqu&#39;à ce qu&#39;il ne montant ou descendant de la poitrine est vu et il n&#39;ya pas de rythme cardiaque palpable. Confirmez l&#39;animal a été correctement euthanasiés par l&#39;absence d&#39;une réponse à pincement de l&#39;orteil ou toucher de la cornée, suivie par dislocation cervicale. </li><li> Ouvrez la cavité abdominale et enlever le gros intestin. Ouvrir l&#39;intestin longitudinalement; ulcères des muqueuses macroscopiques doivent être observés à environ 5-6 cm en amont de l&#39;extrémité distale du côlon chez le rat (2-3 cm chez la souris). Remarque: Après avoir retiré le gros intestin, évaluer les dommages macroscopiques scores si désiré. Rassembler les segments de côlon de localisation anatomique correspondant des animaux témoins. Remarque: Les personnes obtenant le tissu pour dommages macroscopiques scores devraientêtre aveuglé à l&#39;identité des groupes de traitement. Note des coupes de tissus à l&#39;aide des critères suivants ou similaires: gravité et l&#39;étendue de l&#39;ulcération (0-10), a résumé avec des scores de l&#39;absence ou de la présence de diarrhée (0 ou 1), des adhérences (0, 1 ou 2) et de l&#39;épaisseur de la paroi colique maximale en millimètres 11. </li><li> Recueillir des coupes de 0,5 cm à proximité du site de dommages macroscopique maximale. Aligner geler une section de 0,5 cm dans l&#39;azote liquide à évaluer plus tard la myéloperoxydase (MPO) (une mesure de l&#39;infiltration de neutrophiles), et placer l&#39;autre partie dans 10% du formol tamponné neutre pour l&#39;analyse histologique. Remarque: Enclenchez tissus congelés pour le dosage de la myéloperoxydase peut être conservé à -80 ° C pendant 1 mois. </li><li> Laisser les tissus prélevés pour l&#39;analyse histologique à l&#39;étape 2.3 de fixer dans le formol nuit, puis laver avec de l&#39;éthanol à 70%. Incluez les tissus dans de la paraffine et coupé à l&#39;épaisseur désirée (3-5 um), la tache avec de l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine (HE) pour la notation histologique. </li&gt; <li> Ont deux observateurs marquer au moins trois sections de tissus de chaque animal sous un microscope optique pour déterminer les dommages histologiques scores pour chaque groupe. Remarque: Les personnes obtenant le tissu pour les dommages histologiques scores devraient être aveuglés à l&#39;identité des groupes de traitement. Note des coupes de tissus à l&#39;aide des critères suivants ou similaires: mesure de l&#39;infiltrat de cellules inflammatoires (0 = absent, 3 = transmurale), la perte de l&#39;architecture de la muqueuse (0 = absent, 3 = sévère), la présence ou l&#39;absence d&#39;abcès cryptiques (0-1) , et l&#39;épuisement des cellules à mucus (0-3). Déterminer histologique score de dégâts que la somme de ces scores 11. </li></ol> 3. Exécution myéloperoxydase (MPO) Essai sur DNBS contesté tissu intestinal <ol><li> l&#39;activité de MPO de dosage dans les segments 0,5 cm du côlon obtenus dans l&#39;étape 2.3. Homogénéiser les tissus dans du tampon d&#39;homogénéisation (MPO hexadécyltriméthylammonium 0,5%-bromure d&#39;ammonium dans du tampon phosphate de potassium 50 mM (pH 6,0)) pour donner deux points segme 50 mgnt / ml de suspension homogénéisation tampon. </li><li> Aliquoter la solution homogénéisée dans 1 ml portions et centrifugation à 4 ° C pendant 2 min à 10 000 x g. </li><li> Mélanger 100 ul de chaque fraction aliquote de 2,9 ml de 50 mM de tampon phosphate (pH 6,0) contenant 0,167 mg / ml de o-dianisidinedihydrochloride et 0,0005% de peroxyde d&#39;hydrogène dans une cuve. </li><li> Mesurer le taux d&#39;absorbance en utilisant un spectrophotomètre à 460 nm. Remarque: activité MPO est définie comme la quantité d&#39;enzyme dégradant une umol / min de H 2 O 2 en H 2 O à température ambiante et est exprimée en unités par mg de tissu. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Le modèle DNBS décrite dans ce protocole est un modèle de colite précieux, peu coûteux et reproductible qui peut être utilisé pour étudier divers aspects de l&#39;EIA. Lorsqu&#39;il est administré par voie rectale à des rats ou des souris, DNBS induit un degré important de l&#39;inflammation et une lésion tissulaire dans le côlon, ressemblant à la maladie de Crohn humaine dans ses diverses caractéristiques histologiques, y compris l&#39;infiltration transmurale de polynucléaires et activation Th1 NF-kB-d...

Une maladie intestinale inflammatoire (IBD) est caractérisée par une inflammation chronique récidivante dans le tractus gastro-intestinal (GI), ce qui entraîne des symptômes de la diarrhée, la perte de poids, et des douleurs abdominales. Rectocolite hémorragique (RCH) et la maladie de Crohn (MC) sont les deux formes principales de l&#39;IBD, et peuvent être distingués par la localisation de l&#39;inflammation dans le tractus gastro-intestinal. Chez les patients UC, l&#39;inflammation implique généralement le rectum et s&#39;étend de manière contiguë le colon pour un degré variable affectant seulement la muqueuse superficielle. En revanche, les CD peut affecter n&#39;importe quelle partie du tractus gastro-intestinal, même si elle touche principalement l&#39;iléon et le caecum. CD manifeste fréquemment que l&#39;inflammation transmurale souvent associée à des granulomes et conduisant à sténosante (fibrostenotic) et / ou de pénétration (fistulizing) maladie. Bien que l&#39;étiologie des MICI reste insaisissable, il est bien admis que l&#39;EIA est multifactorielle, impliquant des interactions entre les hôtes du système immunitaire, la susceptibilité génétique et responsabilitésession à des facteurs environnementaux et microbiens. À ce jour, les différents modèles de MII ont été proposées afficher diverses réponses cliniques, histologiques et immunitaires caractéristiques de l&#39;UC et CD. Les modèles les plus couramment utilisés sont des souris génétiquement modifiées (IL-2, IL-10, SAMP / Yit), infection des modèles induits (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), les modèles de transfert adoptif (CD45 + RB haut, transfert de cellules CD62L + dans des souris SCID) et modèles de colite induite chimiquement (Dextran Sodium Sulfate (DSS), de l&#39;acide sulfonique trinitrobenzène (TNBS), et l&#39;acide sulfonique Dinitrobenzene (DNBS)). En raison de leur faible coût et l&#39;apparition rapide de la maladie, les modèles chimiques sont considérés comme précieux pour l&#39;étude des divers aspects de l&#39;EIA. Chacun des modèles de colite chimiques énumérés présente des avantages ainsi que des limitations dans certains aspects de leur pertinence clinique, immunologique et histopathologique de l&#39;EIA. DSS est une des méthodes chimiques les plus couramment employés pour induire colitis en une rongeurs. Administration de 3-10% DSS (MW: 42 kDa) pendant 7-10 jours dans l&#39;eau de boisson des souris peut induire des symptômes et des signes de colite y compris la perte de poids, diarrhée avec du sang, le raccourcissement du côlon, ulcération de la muqueuse et l&#39;infiltration de neutrophiles. Ce modèle est particulièrement utile pour les études de criblage de médicaments, ainsi que d&#39;explorer les mécanismes de régénération épithéliale, l&#39;impact de l&#39;immunité innée sur homéostasie de la muqueuse, et le rôle de l&#39;inflammation dans la promotion de la dysplasie intestinale et le développement de l&#39;adénocarcinome. Il ya cependant quelques inconvénients du modèle DSS, y compris la variation de la concentration de DSS nécessaire pour induire la colite dans différentes installations pour les animaux, ainsi que l&#39;absorption d&#39;eau incompatible par la souris et l&#39;exposition donc incompatible MAS, résultant de la variation dans le degré, l&#39;étendue et distribution des lésions de la muqueuse et une ulcération dans le côlon. Toutes ces caractéristiques conduisent à l&#39;hétérogénéité des résultats et limitent la capacité de comparer les résultats entre les études frdifférents groupes de recherche de l&#39;OM. Une alternative au modèle DSS est induite par le DNBS haptène ou des modèles de colite TNBS. Ce modèle emploie instillation rectale de la muqueuse sensibiliser les agents DNBS ou TNBS, dilué à des concentrations variables d&#39;éthanol. L&#39;administration de l&#39;éthanol est une condition préalable à briser la barrière de la muqueuse du côlon pour permettre la pénétration de DNBS ou TNBS dans la lamina propria. DNBS / TNBS alors haptenize les protéines du côlon et de l&#39;intestin microbiennes localisées pour devenir immunogène, déclenchant ainsi l&#39;hôte innée et l&#39;immunité adaptative. En général, ce modèle est associé à la diarrhée sévère et parfois sanglante, la perte de poids et intestinal épaississement de la paroi mais les symptômes varient en fonction du type de rongeur utilisé, ainsi que le moment, la dose et le degré d&#39;exposition à la DNBS ou de TNBS utilisé dans l&#39; étude. Distinctions importantes entre les rats et les souris sont à noter, avec les avantages d&#39;un coût moindre pour l&#39;achat et le conseil, ainsi que Lower de masse corporelle pour diminuer les coûts par animal en rapport avec un traitement in vivo. Cela devrait être réglé contre le cours plus rapide et sévère de colite chez la souris, où les animaux les plus fragiles et sensibles peuvent rapidement atteindre un point de terminaison humaine. L&#39;inflammation intestinale initialement en résulte dans de l&#39;éthanol dégâts liés aux cellules épithéliales de l&#39;intestin, conduisant à une augmentation de la perméabilité épithéliale, la pénétration microbienne dans la muqueuse, haptenization de protéines de l&#39;hôte, tout ceci résultant de l&#39;infiltration de neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes Th1 T dans la muqueuse endommagée. En comparaison à DNBS, TNBS est considéré comme un produit chimique dangereux en raison de ses propriétés hautement oxydatif qui peut présenter un risque d&#39;explosion au contact de bases tels que le sodium et l&#39;hydroxyde de potassium. Par conséquent DNBS est actuellement considéré comme un premier choix de produit chimique sur TNBS pour induire la colite. Chez les rongeurs, DNBS colite est considéré comme l&#39;une des méthodes les plus commodes pour étudier la suiIBD aile modificateurs de la maladie associée: <ol><li> La dépression et la réactivation de la colite: Il a été démontré que le stress, l&#39;anxiété et la dépression chez les patients atteints de MII sont souvent associées à une rechute de la maladie. DNBS colite est un modèle approprié pour étudier le rôle de la dépression et ses conséquences sur la réactivation de la colite chez les souris. Le procédé implique typiquement l&#39;induction initiale de la colite par DNBS, suivie par la résolution de la colite en laissant les souris pendant 6-8 semaines. Les souris sont ensuite administrés à la dépression agents pathogènes comme la réserpine ou par bulbectomy olfactif provoquer une dépression suivie en les testant pour la réactivation de la colite par défi avec une dose de subcolitic DNBS 2. </li><li> Le stress et la réactivation de la colite: Le stress est un autre facteur environnemental commun qui a été liée à la pathogenèse MII. Il ya un nombre croissant de preuves qui suggère une forte association entre le stress chronique et l&#39;apparition des symptômes de l&#39;UC et CD chez les rongeurss ainsi que chez les humains et les primates non humains 3. DNBS colite est un bon modèle pour étudier le stress associé à la réactivation de la colite chez les souris et les rats. La méthode est généralement utilisée de la même façon que ci-dessus pour la dépression, sauf en place de la dépression, les animaux sont exposés à des facteurs de stress tels que le stress sonore et de retenue 4. </li><li> Inflammation neurogène: Un certain nombre d&#39;études ont décrit soit modifications transitoires ou permanentes dans le système nerveux entérique (ENS) de la structure et de la fonction, comme on le voit dans les échantillons de tissus provenant de modèles animaux et de patients atteints de MICI. DNBS est un bon modèle pour étudier les effets de l&#39;inflammation sur l&#39;ENS 5 et à étudier à la fois noradrénergique et voies nerveuses cholinergiques 6. </li><li> Mécanismes blessure de réparation: Lors de l&#39;EIA pathogenèse, les médiateurs de blessures accueil dérivés tels que les espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS), l&#39;oxyde nitrique (NO), une molécule d&#39;adhésion intercellulaire 3 (ICAM-3), et la P-sélectine ont tous été montré pour pjeter un rôle dans la perturbation de l&#39;épithélium intestinal. DNBS est un excellent modèle pour étudier les blessures causées par la sur-régulation de ces médiateurs ainsi que des mécanismes de réparation qui sont réglementés par l&#39;utilisation de médicaments sélectifs ou des inhibiteurs 7,8. </li><li> Inflammation transmurale: En plus des applications de DNBS mentionnés ci-dessus, le modèle peut également être appliquée à l&#39;étude inflammation transmurale de l&#39;intestin, une caractéristique classique trouvé dans les patients atteints de MC. Les deux DNBS et la colite induite par le TNBS sont associées à une infiltration importante de lymphocytes, dans la muqueuse colique rendre ces modèles particulièrement utile pour étudier les mécanismes immunitaires dépendantes des lymphocytes T. </li></ol> En comparaison avec le modèle DSS, les avantages de DNBS et la colite induite par le TNBS comprennent faible coût, le développement rapide de la colite (nécessite habituellement 1-3 jours pour montrer ulcération reproductible et de l&#39;inflammation) et des dommages localisés conforme à la partie distale du côlon. Toutefois, les inconvénients sont une exigence pour unle niveau d&#39;expertise technique, l&#39;optimisation de la dose DNBS / TNBS, et la nécessité d&#39;une anesthésie pour l&#39;administration rectale. Dans le présent document méthodologique, nous avons étudié les effets de différentes concentrations de n-6 et n-3 sont des acides gras polyinsaturés sur la modification de la réponse de la muqueuse colique de colite DNBS induite chez le rat en utilisant le huiles végétales huile de carthame (SO) et l&#39;huile de canola (CO) , et l&#39;huile de poisson (FO). Il a été montré que les acides n-6 et n-3 acides gras sont des médiateurs importants de la maladie inflammatoire intestinale par leur rôle en tant que groupements acyle de phosopholipids de la membrane cellulaire 9. En revanche le potentiel pro-inflammatoire des n-6 acides gras n-3 les acides gras à suffisamment grande consommation sont potentiellement des agents anti-inflammatoires. Les actions anti-inflammatoires de la série n-3 des acides gras sont médiés directement à travers le remplacement de l&#39;acide arachidonique en tant que substrat d&#39;eicosanoïdes, l&#39;inhibition du métabolisme de l&#39;acide arachidonique et indirectement par la modification de proinfll&#39;expression du gène ammatoires et la signalisation cellulaire. Les acides gras n-3 donnent également lieu à résolvines, une famille de médiateurs anti-inflammatoires. Une forte consommation de n-3 des acides gras est associée à une diminution de la production d&#39;eicosanoïdes pro-inflammatoires, des cytokines, des chimiokines, des espèces réactives de l&#39;oxygène et de l&#39;expression des molécules d&#39;adhésion. Dans cette étude, les rats ont été nourris ad régimes libitum identiques dans tous les nutriments à l&#39;exception des acides gras, avec comme source d&#39;énergie pour cent de matières grasses, 20% de SO, 20% de CO, ou 18% d&#39;huile de poisson plus 2% d&#39;huile de carthame (FO) 10-11 . En pourcentage de l&#39;énergie quotidienne, le régime SO fourni 15% d&#39;acide linoléique (LA), avec &lt;0,06% α-linolénique (ALA) et pas d&#39;acide eicosapentaénoïque (EPA) ou de l&#39;acide docosahexaénoïque (DHA), le régime de CO avait 4.2 % LA et ALA 1,9% sans l&#39;EPA ou DHA, et l&#39;alimentation FO fourni 1,4% de l&#39;EPA, DHA 4,9%, 0,32% LA et ALA 0,12%. Trois semaines après l&#39;initiation de l&#39;alimentation de lipides, les souris ont été administrés DNBS intrarectale ou 50% d&#39;éthanol et sacrifiés 5 jours plus tard. L&#39;inflammatoires réponse a été évaluée par l&#39;évaluation de la perte de poids, des lésions histologiques de partitions et de l&#39;activité de la myéloperoxydase des tissus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">19 gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE-50</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>427517</td>
			<td>for intra-rectal administration in mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE-90</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>427519</td>
			<td>for intra-rectal administration in rat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNBS</td>
			<td>MP Bio</td>
			<td>150959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tear gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>63601662596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5F93-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">warming pad</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>TPZ-0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A-962.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hexadecyltrimethyl-ammonium bromide</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium phosphate buffer solution</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>79628-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">O-dianisidine dihydrochloride</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">30% H2O2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>31642</td>
			<td>hydrogen peroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>Benchmarker Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Image.Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Data analysis software program </td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;"> GraphPad Prism Software Version 4.00 </td>
			<td><a href="http://www.graphpad.com/">San Diego California USA, www.graphpad.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dnbs/tnbs colitis models: providing insights into inflammatory bowel disease and effects of dietary fat

Les maladies inflammatoires de l&#39;intestin (MICI), y compris la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, ont longtemps été associées à une base génétique, et accueillir plus récemment réponses immunitaires aux agents microbiens et environnementaux. Colite Dinitrobenzene acide sulfonique (DNBS) induite permet d&#39;étudier la pathogenèse des MICI déclencheurs environnementaux associés tels que le stress et l&#39;alimentation, les effets des thérapies potentielles, et les mécanismes de blessure de l&#39;inflammation intestinale et de la muqueuse sous-jacente. Dans cet article, nous avons étudié les effets des acides n-3 et n-6 gras alimentaires sur la réponse inflammatoire de la muqueuse colique de DNBS colite induite chez le rat. Tous les rats ont été nourris avec les régimes alimentaires identiques à l&#39;exception des différents types d&#39;acides gras [huile de carthame (SO), l&#39;huile de canola (CO), ou d&#39;huile de poisson (FO)] pendant trois semaines avant l&#39;exposition à intrarectale DNBS. Les rats témoins proposés éthanol rectale ont continué à prendre du poids au cours de l&#39;étude de 5 jours, alors que, chez le rat DNBS traités recevant une ration de lipides tous lost de poids des rats nourris CO FO et montrant une perte de poids significative de 48 h et les rats nourris SO de 72 h. Le gain de poids repris après 72 h DNBS de poste, et par 5 DNBS jours de poste, le groupe FO eu un poids supérieur à SO ou CO. Sections du côlon recueillies 5 jours après DNBS traitement a montré une ulcération focale, la destruction crypte, l&#39;épuisement des cellules à mucus, et la muqueuse infiltration de deux cellules inflammatoires aigus et chroniques qui diffèrent en gravité parmi les groupes alimentaires. Le groupe SO nourris a montré les dégâts les plus graves suivie par le CO, et FO alimenté groupes qui ont montré le degré le plus doux de la lésion tissulaire. De même, la myéloperoxydase colique (MPO), un marqueur de l&#39;activité des neutrophiles était significativement plus élevée chez les rats SO suivie CO alimentés, des rats nourris avec FO ayant une activité nettement plus faible MPO. Ces résultats démontrent l&#39;utilisation de la colite induite DNBS, comme indiqué dans ce protocole, afin de déterminer l&#39;impact de l&#39;alimentation dans la pathogenèse des MICI.

Défi de rats (Sprague-Dawley) ou des souris (C57BL / 6) avec DNBS se traduit généralement par une perte de poids transitoire et de la diarrhée, parfois avec le sang présents dans les selles. Cependant, des facteurs tels que la génétique, l&#39;alimentation et les microbiote intestinal peuvent modifier la sensibilité à la colite induite DNBS. Par conséquent, les animaux inclus dans les expériences doivent être de la même institution, soit dérivé localement ou commandé à partir d&#39;un fournisseur de l&#...

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DNBS/TNBS Colitis Models: Providing Insights Into Inflammatory Bowel Disease and Effects of Dietary Fat

DNBS / TNBS colite induite propose une méthode alternative et peu coûteuse pour étudier la pathobiologie de la maladie inflammatoire de l&#39;intestin. Le protocole décrit dans ce document décrit l&#39;application réussie de DNBS pour induire la colite chez les souris et les rats et permet d&#39;étudier en profondeur les réponses intestinales médiés par l&#39;hôte.

Modèles DNBS / TNBS colite: Fournir connaissances sur les maladies inflammatoires de l&#39;intestin et des effets de graisses alimentaires

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently ...

dnbstnbs-colitis-models-providing-insights-into-inflammatory-bowel

Research

JoVE Journal

Medicine

46.8K vues.  BC Children's Hospital.  DNBS / TNBS colite induite propose une méthode alternative et peu coûteuse pour étudier la pathobiologie de la maladie inflammatoire de l'intestin. Le protocole décrit dans ce document décrit l'application réussie de DNBS pour induire la colite chez les souris et les rats et permet d'étudier en profondeur les réponses intestinales médiés par l'hôte. 

Vidéo: DNBS/TNBS Colitis Models: Providing Insights Into Inflammatory Bowel Disease and Effects of Dietary Fat

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

Mesure précise et simple de la cytokine pro-inflammatoire IL-1β en utilisant un dosage de sang total Stimulation

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Recherche

Médecine

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

Segmentation et évaluation des volumes FAT dans les modèles murins d&#39;obésité Utilisation de X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson&#039;s Disease

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

Modèles d’interaction gène-environnement pour démasquer les mécanismes de susceptibilité dans la maladie de Parkinson

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

Évaluation de la viabilité de la graisse humaine injection dans des souris nude avec Micro-tomodensitométrie

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Therapeutic Effectiveness of a Dietary Supplement for Management of Halitosis in Dogs

Halitosis is a common complaint involving social and communicational problems in humans and also affects the pet-owner relationship. In this randomized placebo-controlled crossover clinical evaluation, we assessed&#160;the effectiveness of a dedicated dietary supplement to improve chronic halitosis in 32 dogs of different breeds and ages. This protocol describes how to evalute the presence of oral volatile suphur compunds, e.g. methyl mercaptan, hydrogen sulfide and dimethyl sulfide, by means of a portable gas chromatograph device coupled with a syringe, which was used to collect the breath, and a dedicated software, which allows the operator to monitor each compound concentration during each measurement, in a relatively short time (8 min).
A significant modification of halitosis parameters was observed after 30 days since the beginning of treatment (p &#60;0.05), while a long-lasting effect was still observed even 20 days after the suspension of the treatment. Portable gas chromatograph, which is also widely used in clinical practice, can be therefore used to confirm&#160;and control halitosis in humans and animals. Even though human and animal species present some differences,&#160;this innovative and alternative therapy for halitosis management might be extended to human clinical practice as an adjuvant dietary approach.

We describe a simple approach for diagnosis of halitosis in dogs as well as a dietary approach for its management. This protocol may be extended to the management of halitosis in humans in the near future.

L&#39;efficacité thérapeutique d&#39;un complément alimentaire pour la gestion de l&#39;halitose chez les chiens

Halitosis is a common complaint involving social and communicational problems in humans and also affects the pet-owner relationship. In this randomized ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett&#8217;s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett&#8217;s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

Les modèles de chirurgie de reflux gastro-œsophagien avec des souris

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying tissue compartments, restricting the transport of smaller molecules across the epithelium and almost completely prohibiting epithelial macromolecular transport. This selectivity is determined by the mucous gel layer, which limits the transport of lipophilic molecules and both the apical receptors and tight junctional protein complexes of the epithelium. In vitro cell culture models of the epithelium are convenient, but as a model, they lack the complexity of interactions between the microbiota, mucous-gel, epithelium and immune system. On the other hand, in vivo assessment of intestinal absorption or permeability may be performed, but these assays measure overall gastrointestinal absorption, with no indication of site specificity. Ex vivo permeability assays using &#34;intestinal sacs&#34; are a rapid and sensitive method of measuring either overall intestinal integrity or comparative transport of a specific molecule, with the added advantage of intestinal site specificity. Here we describe the preparation of intestinal sacs for permeability studies and the calculation of the apparent permeability (Papp) of a molecule across the intestinal barrier. This technique may be used as a method of assessing drug absorption, or to examine regional epithelial barrier dysfunction in animal models of gastrointestinal disease.

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or "intestinal sacs" as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

Ex Vivo intestinale Sacs pour évaluer la perméabilité de la muqueuse dans les modèles de maladies gastro-intestinales

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

We describe an ovarian fad pad transplantation assay suitable for studies of normal and transformed epithelia of the female reproductive tract. The mouse fat pad allows transplantation of large tissue fragments, is easily accessible for surgery and imaging, and provides the most favorable native environment for tissues of M&#252;llerian origin.

Transplantation Dans le tapis de souris ovarien Fat

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

Analyse Effets bénéfiques des suppléments nutritionnels sur les fonctions épithéliales intestinales barrière Pendant Experimental Colite

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...