L’analyse systématique de notation est une technique pour évaluer des dommages muqueux, facilitant l’interprétation histologique qui peut être exécutée par des chercheurs formés. Les principaux avantages de cette méthode est qu’elle est gratuite et facile à utiliser. Il permet une analyse quantitative des données histologiques obtenues à partir des intestins des souris atteintes de colite.
Ce protocole fournit un moyen rapide et reproductible d’interpréter la gravité de la maladie de l’ensemble du côlon, ce qui est nécessaire pour comparer la maladie d’animaux de différents milieux génétiques. Pour la préparation des tissus, il est important d’organiser tous les reagents et matériaux. Commencez par placer une souris euthanasiée sur un tampon de dissecting dans une position supine et immobiliser les extrémités de la souris à l’aide d’aiguilles de calibre 1,5 pouce de calibre 20.
À l’aide de forceps et de ciseaux, faire une petite incision sur la peau abdominale et la tirer sur le côté pour exposer le péritoine, puis ouvrir la cavité abdominale avec une incision de midline dans le péritoine de l’os pubien aux côtés de l’abdomen. Retirez soigneusement les tissus et les organes jusqu’à ce que le gros intestin soit visualisé. Couper l’os pelvien des deux côtés du côlon pour visualiser complètement l’organe, s’étendant de l’anus vers le cécu.
Retirez doucement la graisse, les petites veines et les artères attachées au côlon tout en disséquant soigneusement l’organe, en coupant juste proximal à l’anus et distal au cécage. Rincer soigneusement le côlon avec du PBS pour enlever le contenu fécal à l’aide d’une aiguille de gavage en plastique souple insérée dans l’anus. Placez le côlon en ligne droite et ouvrez longitudilement le long de l’artère mésentérique.
Couper le côlon longitudinellement du distal à l’extrémité proximale. Utilisez la moitié du tissu pour l’analyse histologique et l’autre moitié pour la tache occidentale, PCR, ou roulé dans un deuxième rouleau suisse pour la microscopie d’immunofluorescence fraîchement congelée. Couper les tissus supplémentaires du côlon proximal à l’aide d’une lame de rasoir jusqu’à ce qu’environ la même largeur le long de la longueur du côlon entier soit obtenue.
Aligner le côlon pour exposer le lumen et aplatir complètement le tissu à l’aide d’une aiguille de gavage flexible. Ajouter plus de PBS si nécessaire pour garder le tissu humide tout au long de la procédure. Retirer l’excès de PBS à l’aide d’un lingette en papier.
À l’aide d’une seringue et d’une aiguille de gavage, ajouter une solution formaline tamponnée neutre à 10 % pendant deux à trois minutes pour fixer et aplatir le tissu, puis utiliser des forceps droits pour saisir l’extrémité du côlon distal et tordre le côlon en cercles concentriques de l’extrémité distale à l’extrémité proximale. Insérez une aiguille de calibre 27 pour épingler le côlon au milieu et maintenir sa forme de rouleau suisse, puis placez le rouleau suisse dans une cassette d’intégration à l’intérieur d’un récipient de spécimen histologique orientant le tissu en parallèle par rapport à la cassette. Fixer le tissu dans 10% neutre tamponné solution formaline nuit à quatre degrés Celsius.
Après la fixation de nuit, laver le tissu trois fois avec PBS. Ajouter 70 % d’éthanol avant le processus d’intégration de la paraffine et retirer l’aiguille du rouleau suisse avant de procéder. Le tissu peut être stocké dans de l’éthanol à température ambiante jusqu’à ce que la paraffine soit enseilée.
Après avoir ouvert les images numérisées dans le logiciel de traitement d’image, vérifiez que l’ensemble du côlon est visible et qu’il n’y a pas de zones manquantes de l’échantillon. Activez l’imageur d’étiquettes et les outils de barre d’échelle pour identifier correctement les diapositives numérisées en cliquant sur l’imageur d’étiquette. Ouvrez l’outil annotations en cliquant sur annotations et créez trois couches différentes en cliquant sur une nouvelle couche pour quantifier la longueur totale du rouleau suisse, l’inflammation ou les blessures, et l’érosion ou l’ulcération.
Choisissez une couleur différente pour chaque couche en cliquant sur la couleur de la couche. Mesurez la longueur de chaque couche ou catégorie en cliquant sur l’outil de stylet pour tracer une ligne suivant la muqueuse muscularis, en déplaçant le pointeur au besoin pour visualiser la zone adjacente pour analyse. Visualisez l’image à 400 micromètres de zoom pour faciliter une visualisation adéquate de la muqueuse muscularis.
Chaque fois que le stylet est arrêté, une petite nouvelle couche de région sera générée. Il peut être visualisé et modifié avec l’onglet régions de couche. Examinez la longueur totale, l’inflammation ou les blessures, ainsi que l’érosion ou l’ulcération mesurée à l’aide de la muqueuse muscularis comme référence.
Une fois que toutes les couches sont définies, exportez les données à l’aide de la grille d’exportation vers le bouton fichier texte à l’intérieur des options de régions de couche. Ouvrez les fichiers texte et copiez les données sur un logiciel de feuille de calcul. Totalez tous les segments de chaque région et calculez le pourcentage de blessures et d’ulcération par rapport à la longueur totale.
Considérez trois caractéristiques principales pour calculer le score histologique de colite et pour évaluer la sévérité de la maladie. Vérifiez la santé de la muqueuse intestinale, qui se caractérise par des cellules épithéliales organisées dans l’axe luminaire de la crypte, des propria lamina avec peu de cellules immunitaires et des muqueuses muscularis sous-jacentes. Ensuite, vérifiez l’inflammation ou les blessures, qui se caractérisent par des cryptes épithéliales atténuées ou partiellement manquantes et une inflammation muqueuse avec infiltration de neutrophiles dans les cryptes.
Enfin, vérifiez la présence d’érosion ou d’ulcération, qui se caractérise par des zones dépourvues d’épithélium de surface ou des zones dépourvues complètement de cryptes d’épithélium avec ou sans leucocytes associés. Pour illustrer la fiabilité de cette analyse histologique de score de colite dans le contexte des dommages muqueux, 2.5%DSS a été administré dans l’eau potable de huit souris sauvages de type C57BL6 pendant cinq jours, suivie d’une période de rétablissement avec l’eau régulière pendant cinq jours. Le poids corporel est resté constant pendant l’administration aiguë de DSS, mais a considérablement diminué quand les souris ont commencé à boire l’eau régulière du robinet.
Le sang et les selles molles sont apparus après trois jours d’administration du DSS et se sont poursuivis jusqu’au huitième jour de l’expérience. Ces observations ont suggéré que les effets les plus préjudiciables de l’exposition au DSS aient été observés pendant la période de rétablissement entre les jours cinq et huit. La mesure de la longueur du côlon le jour 10 a confirmé un raccourcissement significatif à la fin de l’expérience.
Les colons ont été récoltés aux jours zéro, deux, cinq, sept, huit et dix pour faire des rouleaux suisses de paraffine. Le tissu a été taché avec H&E et des balayages de haute définition ont été analysés pour calculer le score histologique de colite et le pourcentage de dommages et d’ulcération. L’architecture normale de crypte a été observée chez les souris non traitées.
Après deux jours d’administration de DSS, le recrutement de cellules immunitaires a été observé. Le cinquième jour, les cellules épithéliales semblent endommagées et il y avait une infiltration des neutrophiles à travers l’épithélium lié aux dommages épithéliales. Du cinquième au huit jour, des secteurs de perte épithéliale avec l’inflammation et l’ulcération ont été observés.
Le jour 10, les cellules épithéliales ont commencé à se régénérer et à repeupler les zones ulcérées, rétablissant lentement la muqueuse du côlon. Lorsque vous essayez ce protocole, il est important de créer un rouleau suisse bien orienté et bien conservé, ainsi que d’identifier correctement l’inflammation muqueuse ou les blessures et l’ulcération ou l’érosion. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer quantitativement les blessures sur toute la longueur de la muqueuse du côlon dans d’autres modèles de colite, tels que tms ou modèle de transfert de cellules T.
