この作品は、自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）とクローン病とカナダの大腸炎財団（CCFC）からKJに動作する補助金によって支えられている。 VMがCFRIフェローシップおよびGB保健研究のためのカナダの研究所（CIHR）からの大学院学生の身分によってサポートされています。 BAVは、腸や肝臓障害小児消化器KJ小児IBDの研究とカナダの研究の椅子の財団（子）議長が子供や子ども家庭総合研究所（CFRI）臨床医の科学者賞プログラムでサポートされている主任臨床医科学者である子どもである、ブリティッシュコロンビア大学。

動物を対象とする手順は、ブリティッシュ·コロンビア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって概説動物管理のガイドラインに従ってください。 代表的な結果は、Sprague-Dawleyラットから提示される一方、このプロトコルに記載された手順は、ラットとマウスの両方について説明する。 1。 DNBSおよび直腸内投与の準備<ol><li>ラットでのDNBSの直腸点滴のために、新たに50％エタノールのDNBS/250μlを15〜30ミリグラムを準備します。マウスの場合、50％エタノールのDNBS/100μLの2-6ミリグラムを準備します。注：各施設で投与すべき正確なDNBS濃度を最適化します。雄Sprague-Dawleyラット、およびC57BL / 6マウスが、他のマウスおよびラットの系統を使用することができる、DNBS大腸炎の誘発のために好ましい。対照群しかしながらつは、OMIをすることができるエタノールの影響を与えられた軽度または不在でのみ50％エタノールで処理したマウスおよびラットを使用することができる研究のための12本の群の包含はt。 </li><li>その端部に固定ポリエチレンカテーテル（マウス - - ラットまたはPE-50 PE-90）を持つ19のG針に1ミリリットルの注射器を取り付けます。 </li><li>軽く加熱パッド上のラットまたはマウスの休憩麻酔（ノーズコーンを経由して1.5％イソフルランを投与することにより、 たとえば 、動物がまだ点滅し、嚥下反射神経を持っており、定期的な呼吸が表示されるはずです）。乾燥の目を避けるために、その目には涙のゲルを適用します。 </li><li>穏やかに遠位結腸に存在する可能性のある糞便を除去するために、動物の後端に指先で圧力を加える。 </li><li>優しくカテーテルがラット肛門、またはマウス3〜4 cmの約8センチの近位に達すると、直腸内にカテーテルを挿入します。容易な挿入を可能にする、潤滑するためにカテーテルを挿入しながら、少量の溶液を注入する。注意：カテーテルを挿入しながら、任意の抵抗を感じている場合、これは穿孔につながる可能性として挿入していきません腸壁。カテーテルを外し、静かに再挿​​入しようとすると、再び先に進むように、コロンの潤滑。 </li><li>ゆっくりと250（ラット）または100（マウス）DNBSμlの、または対照のために等量の50％エタノールを注入する。 DNBSを注入した後、DNBSの損失を避けるために90秒のための動物のヘッドダウンを配置。 </li><li> DNBS投与後、最初の週の間の脱水を防ぐために、0.2％の食塩水に動物を8％ショ糖水を供給する。 </li><li>慎重に体重減少と実験期間脱水や苦痛の徴候を毎日監視して、動物を観察します。注：重量損失が急激に最大許容重量損失のCCAC勧告に近づくことができる。これは主に脱水に由来するので、体重減少、脱水を制限するために、乳酸加リンゲル液を投与するための指標として使用されるべきである。必要に応じて、健康問題でのファシリティ獣医師に相談するようにしてください。 </li></ol> 2。 CO組織をllectingとDNBSチャレンジしたマウスにおける組織学的損傷の評価<ol><li> DNBSでの攻撃後に所望の時点で、十分な酸素を補給し、麻酔室にイソフルランで過剰投与により動物を安楽死させる。全く上昇や胸の落下が見られなくなるまで動物を観察し、触知可能なハートビートがありません。確定した動物は正常に頸椎脱臼に続いてつま先のピンチや角膜の感動的に反応し、存在しないことによって安楽死させてきた。 </li><li>腹腔を開き、全体の大腸を削除します。縦方向に腸を開き、巨視的粘膜潰瘍がラットで、コロン（マウス2-3 CM）の先端から約5〜6センチの近位を観察する必要があります。注：必要に応じて、大腸を除去した後、肉眼的損傷のスコアを評価します。対照動物から解剖学的位置の対応から、大腸のセグメントを収集します。注：個人が巨視的な損傷スコアのために組織をスコアする必要があり治療群の正体を知らされていないこと。下記または同様の基準を用いて組織切片をスコア：下痢の存在下または非存在についてスコア（0または1）、癒着（0,1,2）と最大結腸壁の厚さと合計潰瘍（0-10）の重症度および程度、ミリメートル11。 </li><li>最大巨視的損傷部位の近位0.5センチメートルセクションを集める。スナップ保存ミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性（好中球浸潤の尺度）を評価し、組織学的分析のために10％中性緩衝ホルマリン中の他のセクションを配置するために液体窒素に1 0.5センチメートル部をフリーズ。注：ミエロペルオキシダーゼアッセイのためのスナップ凍結した組織は、最大1ヶ月間-80℃で保存することができる。 </li><li>ステップ2.3に組織学的分析のために採取した組織は一夜ホルマリンに固定し、その後、70％エタノールで洗浄することができます。パラフィンに組織を埋め込み、所望の厚さ（3〜5ミクロン）、組織学的スコアリングヘマトキシリン​​およびエオシン（HE）で染色さにカット。 </li&gt; <li>二人の観察者が各グループの組織学的損傷スコアを決定するために、光学顕微鏡下で各動物から少なくとも三つの組織切片のスコア有する。注：組織学的損傷スコアのために組織をスコア個人が治療群の正体を知らされなければならない。炎症細胞浸潤の程度（0 =なし、3 =貫）、粘膜構造の損失（0 =なし、3 =重度）、プレゼンスや陰窩膿瘍が存在しない場合（0-1）：次または同様の基準を用いて組織切片のスコア、および杯細胞の減少（0-3）。これらのスコア11の合計として組織学的損傷スコアを決定します。 </li></ol> 3。腸組織をチャレンジドDNBSにミエロ（MPO）アッセイを実施<ol><li>ステップ2.3で得られた0.5センチメートル結腸セグメントにおけるアッセイMPO活性。 50mgの結腸segmeを得MPOホモジナイズ緩衝液（50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）中0.5％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド）で組織をホモジナイズNT / mlの均質化緩衝液懸濁液。 </li><li>万X gで2分間4℃で1ずつ遠心に均質化されたソリューションを分取。 </li><li> O-dianisidinedihydrochlorideの0.167 mg / mlのキュベット中の0.0005％の過酸化水素を含む2.9ミリリットルの50mMリン酸緩衝液（pH6.0）で各アリコートを100μlを混合します。 </li><li> 460nmで分光光度計を用いて吸光度の割合を測定します。注：MPO活性は、室温で、H 2 OとH 2 O 2の1モル/分を分解する酵素の量として定義され、組織当たりのmg単位で表される。 </li></ol>

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	<li>Per&#353;e, M., Cerar, A., Biotechnol, J. .. . B. i. o. m. e. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. , (2012).</li><li>Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Deng, Y., Verdu, E., Khan, W., Collins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+inflammatory+bowel+disease+in+a+mouse+model+of+depression.">Reactivation of inflammatory bowel disease in a mouse model of depression.</a> Gastroenterology. 136 (7), 2280-2288 (2009).</li><li>Reber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+and+animal+models+of+inflammatory+bowel+disease-an+update+on+the+role+of+the+hypothalamo-pituitary-adrenal+axis.">Stress and animal models of inflammatory bowel disease-an update on the role of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (1), 1-19 (2012).</li><li>Qiu, B., Vallance, B., Blennerhassett, P., Collins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CD4++lymphocytes+in+the+susceptibility+of+mice+to+stress-induced+reactivation+of+experimental+colitis.">The role of CD4+ lymphocytes in the susceptibility of mice to stress-induced reactivation of experimental colitis.</a> Nat. 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Basic Clin. 124 (1-2), 56-68 (2006).</li><li>Cuzzocrea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain+inhibitor+I+reduces+colon+injury+caused+by+dinitrobenzene+sulphonic+acid+in+the+rat.">Calpain inhibitor I reduces colon injury caused by dinitrobenzene sulphonic acid in the rat.</a> Gut. 48 (4), 478-488 (2001).</li><li>Cuzzocrea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+reduces+dinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis.">Melatonin reduces dinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis.</a> J. Pineal Res. 30 (1), 1-12 (2001).</li><li>Innis, S., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+lipids+in+early+development+and+intestinal+inflammatory+disease.">Dietary lipids in early development and intestinal inflammatory disease.</a> Nutr. Rev. 65, S188-S193 (2007).</li><li>Innis, S. M., de La Presa Owens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fatty+acid+composition+in+pregnancy+alters+neurite+membrane+fatty+acids+and+dopamine+in+newborn+rat+brain.">Dietary fatty acid composition in pregnancy alters neurite membrane fatty acids and dopamine in newborn rat brain.</a> J. 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A., Ribeiro, M. L., Gambero, A., Carvalho, P. O., Nascimento, C. M., Silveira, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soybean+and+fish+oil+mixture+increases+IL-10,+protects+against+DNA+damage+and+decreases+colonic+inflammation+in+rats+with+dextran+sulfate+sodium+(DSS)+colitis.">Soybean and fish oil mixture increases IL-10, protects against DNA damage and decreases colonic inflammation in rats with dextran sulfate sodium (DSS) colitis.</a> Lipids Health Dis. 9, 68 (2010).</li><li>Hekmatdoost, A., Wu, X., Morampudi, V., Innis, S. M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+oils+modify+the+host+immune+response+and+colonic+tissue+damage+following+Citrobacter+rodentium+infection+in+mice.">Dietary oils modify the host immune response and colonic tissue damage following Citrobacter rodentium infection in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 304 (10), 917-928 (2013).</li><li>Innis, S. M., Dai, C., Wu, X., Buchan, A. M., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+lipid+nutrition+alters+early+intestinal+development+and+programs+the+response+to+experimental+colitis+in+young+adult+rats.">Perinatal lipid nutrition alters early intestinal development and programs the response to experimental colitis in young adult rats.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299 (6), 1376-1385 (1152).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

このプロトコルに記載DNBSモデルは、IBDの様々な側面を研究するために利用することができる、貴重な安価で、かつ再現性の大腸炎モデルである。ラットやマウスに直腸内投与した場合、DNBSは多核白血球の経壁浸潤および主要なNF-κB依存性のTh1活性化を含めた様々な組織学的特徴の面で人間のクローン病に似た、結腸内の炎症および組織損傷の実質的な程度を誘導する。 ...

炎症性腸疾患（IBD）は、下痢、体重減少、腹痛の症状をもたらす、胃腸（GI）管における慢性再発性炎症を特徴とする。潰瘍性大腸炎（UC）およびクローン病（CD）は、IBDの2つの主要な形態であり、GI管内の炎症の位置によって区別す​​ることができる。 UC患者では、炎症は通常、直腸を伴い、うわべだけの粘膜に影響を与える変数エクステントのコロンまで連続して伸びている。それは主に回腸および盲腸に影響を与えるが、これとは対照的に、CDは、GI管の任意の部分に影響を与えることができる。貫​​炎症は、多くの場合、肉芽腫と関連し、（瘻孔）疾患をstricturing（fibrostenotic）および/または貫通に至るようにCDが頻繁に現れる。 IBDの病因はとらえどころのないままであるが、それはよく、IBDはホストの免疫システム、遺伝的感受性と責任の間で相互作用を伴う、多因子性であることが認められている環境や微生物因子に対するSES。 現在までに、IBDの異なるモデルが様々な臨床、組織学的およびUCおよびCDの特徴的な免疫応答を示すことが提案されている。最も一般的に使用されるモデルは、遺伝子改変マウス（IL-2、IL-10、SAMP / YIT）、感染誘発されたモデル（ シトロバクター·ローデン 、 ネズミチフス菌 ）、養子移入モデル（CD45 + RB高、SCIDマウスへのCD62L +細胞移入）を含むと化学的に誘導された大腸炎モデル（デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）、トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）、及びジニトロベンゼンスルホン酸（DNBS））。それらの低コストおよび疾患の迅速な開始のために、化学モデルは、IBDの様々な態様の研究に非常に貴重と考えられている。記載されている化学的大腸炎モデルのそれぞれは、IBDに対する、臨床免疫学的および組織病理学的関連性のいくつかの局面において利点だけでなく、制限があります。 DSSは、大腸菌を誘導するために使用される最も一般的な化学的方法の一つであるげっ歯類1 TIS。 3〜10％のDSS（分子量：42 kDa）の物を投与したマウスの飲料水に7〜10日間には、症状や体重減少、血液と下痢、結腸の短縮、粘膜潰瘍および好中球の浸潤を含む大腸炎の兆候を誘導することができる。このモデルは、薬剤スクリーニングの研究だけでなく、上皮再生、粘膜恒常性に対する自然免疫の影響、および腸の異形成と腺癌の開発を促進する上で炎症の役割のメカニズムを探求するために特に有用である。そこしかしながらDSSの濃度の変化を含むDSSモデルへのいくつかの欠点が、範囲、程度のばらつきが生じる、異なる動物施設、ならびにマウスによって失わ水の取り込みおよびDSSに従って一貫性のない露光における大腸炎を誘発するために必要とされると結腸内の粘膜損傷および潰瘍の分布。これらすべての機能は、結果の不均一性につながり、研究のFR間で結果を比較する能力を制限するオム異なる研究グループ。 DSSモデルへの代替手段はハプテン誘発性DNBSや大腸炎のTNBSモデルです。このモデルは、エタノールの様々な濃度に希釈した薬剤のDNBSまたはTNBSを、増粘膜の直腸点滴を採用しています。エタノールの投与は粘膜固有層にDNBSまたはTNBSの浸透を可能にするために結腸粘膜バリアを破るの前提条件です。 DNBS / TNBSは、それによってホスト自然免疫と獲得免疫応答をトリガーする、免疫原性になるためにローカライズされた結腸と腸微生物タンパク質をハプテン化します。一般に、このモデルは、重度の、時には出血性下痢、体重減少および腸壁肥厚しかしながら、症状が用いられる齧歯動物の種類、並びにタイミング、用量およびDNBSへの曝露またはTNBSで使用さの程度に依存して変化と関連している研究。ラットとマウスの間には重要な違いは、低購入し、ボードのコストだけでなく、ロウの利点で、注意すべきであるインビボでの治療の動物あたりのコストを下げるために体重をrは。これはより脆弱で応答性の動物はすぐに人道的エンドポイントに達する可能性があり、マウスにおける大腸炎のより迅速かつ厳しいもちろん、反対に設定する必要があります。 腸の炎症は、最初に増加し、上皮透過性、粘膜への微生物の侵入、宿主タンパク質のハプテン、損傷を受けた粘膜への好中球、マクロファージおよびTh1 Tリンパ球の浸潤をもたらすこのすべてをもたらす、腸上皮細胞へのエタノール誘発損傷から生じる。 DNBSと比較して、TNBSは、ナトリウムおよび水酸化カリウムなどの塩基と接触すると爆発の危険をもたらすことができ、その酸化力の高い性質に起因する有害な化学物質として考えられている。したがってDNBSは現在、大腸炎を誘発するTNBS以上の化学物質の好ましい選択とみなされている。げっ歯類では、DNBS性大腸炎は、folloを研究するための最も便利な方法の一つとして考えられている病気の翼IBD関連する修飾子： <ol><li>うつ病および大腸の再活性化：これは、IBD患者におけるストレス、不安およびうつ病が頻繁に疾患再発に関連していることが示されている。 DNBS大腸炎は、マウスでは大腸の再活性化にうつ病とその結果の役割を研究するのに適したモデルです。この方法は、一般的に6〜8週間のマウスを残すことによって、大腸炎の決議に続いDNBSによる大腸炎の初期誘導を伴う。次いで、マウスをDNBS 2のsubcolitic用量でのチャレンジを通じて大腸の再活性化のためにそれらをテストすることによって、その後うつ病を誘発するためにこのようなレセルピンなどのうつ病の原因薬剤または嗅球摘除により投与される。 </li><li>ストレスや大腸の再活性化：ストレスは、IBDの病因に関連している他の一般的な環境要因である。慢性的なストレスや齧歯類におけるUCとCDの症状の発症との間に強い関連性を示唆する証拠が増えて体があるヒトとヒト以外の霊長類3中のSだけでなく、。 DNBS性大腸炎は、マウスおよびラットの両方で大腸炎のストレス関連の再活性化を研究するための優れたモデルである。うつ病の場所を除いて、うつ病のために上述したような方法は、通常、同様の方法で用いられ、動物は、例えば、音波や拘束ストレス4とストレッサーに曝される。 </li><li>神経性炎症：多数の研究が、動物モデルからIBD患者からの組織サンプルに見られるように、腸管神経系（ENS）の構造および機能に一時的または永久的な変化のいずれかを記載している。 DNBSはENS 5上の炎症の影響を調査し、ノルアドレナリン作動性およびコリン作動性神経経路6の両方を研究するための優れたモデルである。 </li><li>損傷修復メカニズム：IBDの病因の間、そのような活性酸素種（ROS）のような宿主由来の傷害のメディエーター、酸化窒素（NO）、細胞間接着分子-3（ICAM-3）、およびP-セレクチンは、全てのpに示されている腸上皮の破壊に関与して横たわっていた。 DNBSは、選択的な薬や阻害剤7,8を使用することによって調節されているこれらのメディエーターの上方制御だけでなく、修復メカニズムに起因する負傷を研究するための優れたモデルです。 </li><li>貫​​壁性炎症：DNBSの上述の用途に加えて、モデルはまた、腸の貫壁性炎症、CDを有する患者において見出さ古典的な特徴を研究するために適用することができる。 DNBSおよびTNBS誘導性大腸炎の両方がT細胞依存性免疫機構を研究するこれらのモデルは、特に有用なものと大腸粘膜に、リンパ球の著しい浸潤と関連している。 </li></ol> DSSモデルと比較して、DNBSおよびTNBS誘導大腸炎の利点は、低コスト、大腸炎の急速な発展（通常は再現性の潰瘍や炎症を表示するために1-3日を要する）と遠位結腸への一貫したローカライズ損傷も含まれます。しかし欠点はのための要件である技術的専門知識、DNBS / TNBS投与量の最適化、および直腸投与のための麻酔の必要性の高いレベル。 この方法論的研究では、（SO）植物油のサフラワー油を使用したラットでDNBS誘発性大腸炎の大腸粘膜応答を変える上のn-6およびn-3多価不飽和脂肪酸の様々な濃度の影響を研究し、キャノーラ油（CO） 、および魚油（FO）。それは、n-6およびn-3脂肪酸は、細胞膜phosopholipids 9のアシル部分としての役割を介して腸の炎症性疾患の重要なメディエーターであることが示されている。十分に高い吸気のn-6脂肪酸の炎症誘発電位とは対照的に、n-3脂肪酸は、潜在的に強力な抗炎症剤である。 n-3脂肪酸の抗炎症作用は、proinflの変化を介して間接的にアラキドン酸代謝とを阻害する、エイコサノイド基質としてアラキドン酸の代わりを通して直接媒介されるammatory遺伝子発現および細胞シグナリング。 n-3脂肪酸はまた、レゾルビン、抗炎症性メディエーターのファミリーを生じさせる。 n-3脂肪酸の高摂取は、炎症誘発性エイコサノイド、サイトカイン、ケモカイン、反応性酸素種および接着分子の発現の産生の減少と関連している。本研究では、ラットを用いて、脂肪酸を除くすべての栄養素が同一の自由摂取飼料を与えた脂肪、20％のSO、20％CO、18％の魚油を加えた2％のベニバナ油（FO）10-11からのパーセントエネルギーとして。日々のエネルギーの割合として、SO食は15％のリノール酸（LA）を提供し、&lt;0.06％のα-リノレン酸（ALA）と無エイコサペンタエン酸（EPA）やドコサヘキサエン酸（DHA）と、COの食事は4.2を持っていた％のLa 1.9％ALAなしのEPAまたはDHAとし、FO食は1.4％のEPA、4.9％のDHA、0.32％のLa、および0.12％のALAを提供した。三週間脂質食餌の開始後に、マウスを直腸内DNBS又は50％エタノールを投与し、5日後に屠殺した。 INFLammatory応答は、体重減少、組織学的損傷スコアおよび組織ミエロペルオキシダーゼ活性の評価により評価した。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">19 gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE-50</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>427517</td>
			<td>for intra-rectal administration in mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE-90</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>427519</td>
			<td>for intra-rectal administration in rat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNBS</td>
			<td>MP Bio</td>
			<td>150959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tear gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>63601662596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5F93-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">warming pad</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>TPZ-0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A-962.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hexadecyltrimethyl-ammonium bromide</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium phosphate buffer solution</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>79628-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">O-dianisidine dihydrochloride</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">30% H2O2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>31642</td>
			<td>hydrogen peroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>Benchmarker Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Image.Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Data analysis software program </td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;"> GraphPad Prism Software Version 4.00 </td>
			<td><a href="http://www.graphpad.com/">San Diego California USA, www.graphpad.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dnbs/tnbs colitis models: providing insights into inflammatory bowel disease and effects of dietary fat

クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患（IBD）は、長い遺伝的基礎に関連して、最近、微生物及び環境因子に対する免疫応答をホストしている。ジニトロベンゼンスルホン酸（DNBS）誘発性大腸炎は、1がそのようなストレスや食生活、潜在的な治療法の効果、およびメカニズム基盤となる腸の炎症や粘膜損傷などのIBDに伴う環境のトリガーの病因を研究することができます。本論文では、ラットにおいてDNBS誘発性大腸炎に対する大腸粘膜の炎症反応に対する食餌のn-3およびn-6脂肪酸の効果を検討した。すべてのラットは、前の直腸内DNBSへの曝露に3週間脂肪酸〔サフラワー油（SO）、キャノーラ油（CO）、又は魚油（FO）】異なるタイプのを除いて同一の食餌を与えた。直腸内エタノール与えられた対照ラットはDNBS投与ラットのに対し、供給脂質の食事をすべてLOS、5日の研究の上に体重が増え続けFOとCO与えたラットは、48時間および72時間でのSO与えたラットで有意な体重減少を示すと、Tの重み。重量増加は72時間後DNBS後に再開し、5日後DNBSによって、FO基はSOまたはCO基よりも高い体重であった。結腸のセクションでは、5日後にDNBS処理が焦点潰瘍、陰窩破壊、杯細胞の枯渇、および食群の中で重要度が異なっていた両方の急性および慢性の炎症性細胞の粘膜浸潤を示した収集。 SO供給グループは、COが続き、最も深刻な被害を示し、FOは組織損傷の最も穏やかな程度を示したグループを供給した。同様に、結腸ミ​​エロ（MPO）活性は、好中球活性のマーカーは、FO与えたラットは、有意に低いMPO活性を持つ、SO、CO給餌ラットが続く中で有意に高かった。 IBDの病因に食生活の影響を判断するために、このプロトコルに概説されているようこれらの結果は、DNBS誘発性大腸炎の使用を示す。

DNBSラット（スプラーグドーリー）またはマウス（C57BL / 6）の課題は、典型的には、時々、便中の血液に存在すると、一過性の体重減少および下痢を​​もたらす。しかし、このような遺伝学、食事や腸の細菌叢などの要因がDNBS誘発性大腸炎に対する感受性を変更することができます。そのため、実験に含めた動物は、ローカルに由来するか1動物のサプライヤーから注文さのどちらか、同じ...

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DNBS/TNBS Colitis Models: Providing Insights Into Inflammatory Bowel Disease and Effects of Dietary Fat

DNBS / TNBS誘発性大腸炎は炎症性腸疾患の病理生物学を研究するための代替手段で安価な方法を提供しています。このホワイトペーパーで説明プロトコルは、マウスとラットで大腸炎を誘発することがDNBSの成功したアプリケーションの概要を説明し、1は完全に宿主媒介腸の応答を研究することができます。

DNBS / TNBS大腸炎モデル：食事脂肪の炎症性腸疾患への洞察とエフェクトを提供

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

46.8K ビュー.  BC Children's Hospital.  DNBS / TNBS誘発性大腸炎は炎症性腸疾患の病理生物学を研究するための代替手段で安価な方法を提供しています。このホワイトペーパーで説明プロトコルは、マウスとラットで大腸炎を誘発することがDNBSの成功したアプリケーションの概要を説明し、1は完全に宿主媒介腸の応答を研究することができます。 

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Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

全血刺激のためのアッセイを用いて炎症性サイトカインIL -1βの正確かつ簡単に測定

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

医学

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

X線CTを用いたマウス肥満モデルにおけるセグメンテーションおよびFATボリュームの測定

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson&#039;s Disease

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

パーキンソン病における感受性メカニズムのマスク解除を行う遺伝子環境相互作用モデル

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

腫瘍増殖を研究するためにマウスの乳房脂肪パッド中に乳癌細胞の同所注入。

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

マイクロコンピュータ断層撮影とヌードマウスへのヒト脂肪注入の生存率の評価

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Therapeutic Effectiveness of a Dietary Supplement for Management of Halitosis in Dogs

Halitosis is a common complaint involving social and communicational problems in humans and also affects the pet-owner relationship. In this randomized placebo-controlled crossover clinical evaluation, we assessed&#160;the effectiveness of a dedicated dietary supplement to improve chronic halitosis in 32 dogs of different breeds and ages. This protocol describes how to evalute the presence of oral volatile suphur compunds, e.g. methyl mercaptan, hydrogen sulfide and dimethyl sulfide, by means of a portable gas chromatograph device coupled with a syringe, which was used to collect the breath, and a dedicated software, which allows the operator to monitor each compound concentration during each measurement, in a relatively short time (8 min).
A significant modification of halitosis parameters was observed after 30 days since the beginning of treatment (p &#60;0.05), while a long-lasting effect was still observed even 20 days after the suspension of the treatment. Portable gas chromatograph, which is also widely used in clinical practice, can be therefore used to confirm&#160;and control halitosis in humans and animals. Even though human and animal species present some differences,&#160;this innovative and alternative therapy for halitosis management might be extended to human clinical practice as an adjuvant dietary approach.

We describe a simple approach for diagnosis of halitosis in dogs as well as a dietary approach for its management. This protocol may be extended to the management of halitosis in humans in the near future.

犬の口臭の管理のための栄養補助食品の治療有効性

Halitosis is a common complaint involving social and communicational problems in humans and also affects the pet-owner relationship. In this randomized ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett&#8217;s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett&#8217;s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

マウスを用いた胃食道逆流の外科モデル

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying tissue compartments, restricting the transport of smaller molecules across the epithelium and almost completely prohibiting epithelial macromolecular transport. This selectivity is determined by the mucous gel layer, which limits the transport of lipophilic molecules and both the apical receptors and tight junctional protein complexes of the epithelium. In vitro cell culture models of the epithelium are convenient, but as a model, they lack the complexity of interactions between the microbiota, mucous-gel, epithelium and immune system. On the other hand, in vivo assessment of intestinal absorption or permeability may be performed, but these assays measure overall gastrointestinal absorption, with no indication of site specificity. Ex vivo permeability assays using &#34;intestinal sacs&#34; are a rapid and sensitive method of measuring either overall intestinal integrity or comparative transport of a specific molecule, with the added advantage of intestinal site specificity. Here we describe the preparation of intestinal sacs for permeability studies and the calculation of the apparent permeability (Papp) of a molecule across the intestinal barrier. This technique may be used as a method of assessing drug absorption, or to examine regional epithelial barrier dysfunction in animal models of gastrointestinal disease.

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or "intestinal sacs" as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

ex vivoで腸嚢は、胃腸疾患のモデルに粘膜透過性を評価するために

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

We describe an ovarian fad pad transplantation assay suitable for studies of normal and transformed epithelia of the female reproductive tract. The mouse fat pad allows transplantation of large tissue fragments, is easily accessible for surgery and imaging, and provides the most favorable native environment for tissues of M&#252;llerian origin.

マウスの卵巣脂肪パッドに移植

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

実験的大腸炎の間、腸上皮バリア機能に栄養補助食品の有益な効果を分析

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...