Les auteurs ne ont rien à divulguer.

1. Préparation de verre Lamelles pour AAP <ol><li> Nettoyer les lamelles de 12 mm avec des lingettes charpie faibles. </li><li> Flamme les lamelles de 12 mm et le 14 mm lamelle dans la cupule de chaque verre plat en bas de 35 mm en les faisant passer à travers une flamme du brûleur Bunsen l&#39;aide de pinces. </li><li> Traiter les micropuits avec 200 ul de NaOH 0,1 N pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Aspirer et l&#39;air sec les puits pendant 30 min. </li><li> Traiter les micropuits avec 50 à 100 pl de 3-aminopropyltriméthoxysilane pendant 10 min à température ambiante dans la hotte. Ce produit chimique réagit avec du plastique; par conséquent, utiliser des pipettes en verre et ne remplissez pas complètement les puits pour éviter tout contact avec le plat en plastique. </li><li> Laver les puits avec de l&#39;eau ultra pure pendant environ 10 min jusqu&#39;à ce que le 3-aminopropyltriméthoxysilane devient clair. </li><li> Rincer les puits avec de l&#39;eau ultra pure deux fois en utilisant un flacon souple. </li><li> Laver les puits avec 2 ml d&#39;eau ultra-pure d&#39;unt la température ambiante sur une bascule réglé à une vitesse moyenne (~ 1 Hz) pendant 10 min. </li><li> Aspirer et l&#39;air sec les puits pendant 30 min. </li><li> Traiter les micropuits avec 2 ml de solution de glutaraldéhyde à 0,5% à température ambiante sur un agitateur réglé à une vitesse moyenne (~ 1 Hz) pendant 30 min. </li><li> Laver les micropuits avec 2 ml d&#39;eau ultra pure à la température ambiante sur une bascule fixé à vitesse moyenne (~ 1 Hz) pendant 10 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 30 min. </li><li> Micropuits sécher à un angle raide (60 ° ou plus) pendant 30 min. Remarque: Les plats peuvent être stockés pendant deux mois dans un dessiccateur. </li></ol> 2. Préparation des AAP pour invadopodes dosages <ol><li> Pour une solution de l&#39;AAP douce (8% d&#39;acrylamide et 0,05% BIS) 1 ml, mélanger 200 pi de 40% d&#39;acrylamide, 25 ul de 2% BIS, et 574 pi d&#39;eau ultra-pure (tableau 1). </li><li> Pour une solution de l&#39;AAP dur (8% d&#39;acrylamide et 0,35% BIS) 1 ml, mélanger 200 pi de 40% d&#39;acrylamide, 175 &amp; #181; l de 2% BIS, et 409 pi d&#39;eau ultra pure (tableau 1). </li><li> Pour une solution de PAA-rigide (12% d&#39;acrylamide et 0,60% BIS) 1 ml, mélanger 300 pi de 40% d&#39;acrylamide, 300 ul de 2% BIS et 169 pi d&#39;eau ultra pure (tableau 1). </li><li> Dégazer la solution pendant 15 min. Ajouter 200, 215, et 230 ul de 1 mg / ml de fibronectine de plasma humain dans de l&#39;eau ultra-pure aux solutions de PAA tendres, dures et rigides, respectivement. Pour toutes les solutions, ajouter 1 pl de 10 mg / ml d&#39;acide acrylique de N-hydroxysuccinimide (NHS) ester, 5 ul de 100 mg / ml de persulfate d&#39;ammonium et 2 ul de N, N, N &#39;, N&#39;-tétraméthyléthylènediamine (TEMED ; Tableau 1). Mélanger avec pipetage doux et éviter de créer des bulles dans les solutions. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> AAP (1 ml) </td><td> 40% AA (Ul) </td><td> 2% (Ul) </td><td> Ultrapure Eau (Ul) </td><td> 1 mg / ml FN (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (Ul) </td><td> TEMED (Ul) </td><td> Élastique Module (Pa) </td></tr><tr><td> Doux </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 574 </td><td> 200 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Dur </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 409 </td><td> 215 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Rigide </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 169 </td><td> 230 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Ingrédient volumes et résultant modules élastique pour AAP tendres, dures et rigides utilisés dans les essais de invadopodes. AA = acrylamide, FN = fibronectine, APS = persulfate d&#39;ammonium. <ol start="5"><li> Pipeter 8,48 ul de la solution de PAA sur le centre de chaque micropuits. Remarque: Ce volume donne théoriquement une AAP de 75 um d&#39;épaisseur. </li><li> Abaissez doucement le côté flammé du 12 mm lamelle sur la goutte dans le micropuits l&#39;aide de pinces. </li><li> Laisser la solution de l&#39;AAP sandwich polymériser pendant 15-30 min. Vérifiez la polymérisation en cochant la solution restes. </li><li> Ajouter 2 ml de 1x PBS pour chaque plat et retirez les 12 mm lamelles avec des pincettes. Remarque: 10x PBS est réalisée dans le laboratoire et composée de 0,011 M de KH 2 PO 4, 1,54 M de NaCl, 0,056 M et Na 2 HPO 4. </li><li> Laver les puits avec 2 ml de 1 x PBS à température ambiante pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min. </li></ol> 3. Préparation du PAA pour la force de traction Essais <ol><li> Pour une solution de l&#39;AAP souple (8% d&#39;acrylamide et 0,05% de BIS) 1 ml, mélanger 200 pi de 40% d&#39;acrylamide, 25 ul de 2% BIS et 566 pi d&#39;eau ultra pure (tableau 2). </li><li> Pour une solution de l&#39;AAP dur (8% d&#39;acrylamide et 0,35% BIS) 1 ml, mélanger 200 pi de 40% d&#39;acrylamide, 175 ul de 2% BIS, et 401 pi d&#39;eau ultra-pure (tableau 2). </li><li> Pour une solution de l&#39;AAP rigide (12% d&#39;acrylamide et 0,60% BIS) 1 ml, mélanger 300 pi de 40% d&#39;acrylamide, 300 pi de 2% BIS, et 161 pi d&#39;eau ultra-pure (tableau 2). </li><li> Dégazer la solution pendant 15 min. Ajouter 200, 215, et 230 ul de 1 mg / ml de fibronectine plasmatique humaine à des solutions de PAA tendres, dures et rigides, respectivement. Soniquer 8 pi de 200 nm microsphères fluorescentes rouges (excitation / émission de 580/605 nm) pendant 30 secondes. Pour chaque solution, ajouter 8 200 pi de microsphères fluorescentes rouges nm,1 ul d&#39;acide acrylique 10 mg / ml de NHS ester, 5 ul de 100 mg / ml de persulfate d&#39;ammonium, et 2 pi de TEMED (tableau 2). Mélanger avec pipetage doux et éviter de créer des bulles dans les solutions. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td style="width:40px"> AAP (1 ml) </td><td> 40% AA (Ul) </td><td> 2% BIS (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> Ultrapure Eau (Ul) </td><td> 1 mg / ml FN (Ul) </td><td> Micro-sphères (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (Ul) </td><td> TEMED (Ul) </td><td> Élastique Module (Pa) </td></tr><tr><td> Doux </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 566 </td><td> 200 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Dur </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 401 </td><td> 215 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Rigide </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 161 </td><td> 230 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> Tableau 2:. Volumes d&#39;ingrédients et résultant modules élastique pour AAP tendres, dures et rigides utilisés dans les tests de force de traction AA = acrylamide, FN = fibronectine, APS = persulfate d&#39;ammonium. <ol start="5"><li> Pipeter 8,48 ul de la solution de PAA sur le centre de chaque micropuits. Remarque: Ce volume donne théoriquement une AAP de 75 um d&#39;épaisseur. </li><li> Abaissez doucement le côté flambé de ee 12 mm lamelle sur la goutte dans le micropuits l&#39;aide de pinces. </li><li> Laisser la solution de l&#39;AAP sandwich polymériser pendant 15-30 min. Vérifiez la polymérisation en cochant solution restes. </li><li> Ajouter 2 ml de 1x PBS pour chaque plat et retirez les 12 mm lamelles avec des pincettes. </li><li> Laver les puits avec 2 ml de 1 x PBS à température ambiante pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min. </li></ol> 4. Préparation de l&#39;ECM pour invadopodes dosages <ol><li> Chauffer la solution de gélatine (1% de gélatine et de 1% de saccharose) à 37 ° C. </li><li> Traiter les PAA avec 150 pi de la solution de gélatine pendant 1 min puis soigneusement aspiration du fond de la cupule lors de la tenue des plats à fond de verre à un angle de 45 °. </li><li> Séchez la mince couche restante de gélatine sur les AAP dans les micropuits à un angle raide (60 ° ou plus) pour optimiser le séchage pendant 60 min. </li><li> Traiter les micropuits avec 2 ml d&#39;une solution froide de glutaraldéhyde à 0,5% par rapport à iCE pendant 15 min suivie par la température ambiante pendant 30 min. </li><li> Laver les puits avec 2 ml d&#39;une 1x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min. </li><li> Traiter les micropuits avec 2 ml d&#39;une solution de borohydrure de sodium pendant 1 min. Tapoter doucement plats sur le banc pour éliminer les bulles qui se forment sur la surface de la gélatine. </li><li> Aspirer et laver les puits avec 2 ml d&#39;une 1x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min. </li><li> Diluer une solution de fibronectine plasmatique humaine marqué au FITC à 50 pg / ml avec PBS 1x et une centrifugation à 175 000 xg à 4 ° C pendant 15 min. Soit acheter disponible dans le commerce fibronectine marqué ou étiqueter comme suit: <ol><li> Dissolvez 5 mg de fibronectine dans 10 ml de tampon borate (170 mM métaborate de sodium tétrahydraté et 40 mM de NaCl) et le lieu dans un tube de dialyse. </li><li> Étiquette de la fibronectine en plaçant le tube dans 200 ml de tampon borate contenant 6 mg de FITC dissous à température ambiante sur un agitateur magnétiquefixé au niveau le plus bas pendant 1,5 heure dans l&#39;obscurité. </li><li> Dialyser avec 500 ml d&#39;une 1x PBS sur un agitateur magnétique réglé à la température minimum pendant 3 jours dans une pièce sombre et froide (4 ° C) avec deux volumes change un jour. </li><li> Concentration de fibronectine Calculer marqué au FITC en fonction de la densité optique des fractions aliquotes diluées (1: 200) à 280 nm et 493 nm, telle que [OD 280 - (0,36 x DO 493)] / 1,4 fois le facteur de dilution de 200 fois 2 (qui représente pour la concentration de la fibronectine glycérol dans l&#39;étape suivante) résultant en unités mg / ml. </li><li> Dialyser nuit dans une solution de glycérol de 50% sur un agitateur magnétique réglé à la position la plus basse durant la nuit dans une chambre froide obscurité à 4 ° C.) </li></ol></li><li> Traiter les micropuits avec 150 ul de la solution de fibronectine marqué au FITC à la température ambiante pendant 60 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Aspirer soigneusement la solution de fibronectine marqué FITC du fond de la cupule lors de la tenue des plats à fond de verre auun angle de 45 °, puis de remplir les boîtes à fond de verre avec une solution d&#39;éthanol à 70% à température ambiante pendant 10 minutes dans une hotte sombre de culture cellulaire pour la stérilisation. Remplissez également à fond de verre couvercles des capsules ou essuyer avec des lingettes de peluches bas trempés dans 70% d&#39;éthanol. </li><li> Lavez la vaisselle à fond de verre en les remplissant de 1x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus avec 2 ml de PBS 1x, pour un total de 15 min. </li></ol> 5. Préparation et imagerie de invadopodes dosages <ol><li> Ajouter 25,000 cellules cancéreuses dans 2 ml de milieu de invadopodes (1: 1 de DMEM et de milieu RPMI 1640 avec 5% de sérum faible teneur en protéines, le sérum de veau fœtal à 10%, et 20 ng / ml de fraîchement ajoutée facteur de croissance épidermique) aux plats à fond de verre et incuber une nuit. </li><li> Aspirer et traiter les micropuits avec 2 ml d&#39;une solution de paraformaldehyde à 3,7% à la température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 20 min pour fixer les cellules. </li><li> Après deux lavages rapides avec 2 ml de PBS 1x, traiter les puits avec 2 ml d&#39;un Triton X-100 solution à 0,1% à la chambre Temperature dans l&#39;obscurité pendant 5 min pour perméabiliser les cellules. </li><li> Après un lavage rapide avec 2 ml de PBS 1x, traiter les micropuits avec 3% d&#39;albumine de sérum bovin solution de blocage à la température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 60 min pour bloquer les cellules. </li><li> Incuber les puits avec 150 ul d&#39;anticorps de souris anti-cortactine (1: 750) en solution à température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 60 min blocage. </li><li> Laver les micropuits avec 2 ml de 1 x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min. </li><li> Incuber les puits avec 150 ul d&#39;anticorps de chèvre anti-souris 633 d&#39;anticorps (1: 500) et 546 phalloïdine (1: 750) en solution à température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 60 min blocage. </li><li> Laver les micropuits avec 2 ml de 1 x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min. </li><li> Ajouter six gouttes de milieu de montage pour remplir chaque puits et couvrir avec 22 x 22 lamelles. </li><li> Cortactine et l&#39;actine image pour identifier invadopodes utilisant excitation et d&#39;émission filtres de 632/647 nm et556/570 nm, respectivement, en utilisant un haut NA, 40X lentille à immersion d&#39;huile sur un large champ microscope inversé. De même, l&#39;image de la fibronectine à identifier la dégradation de l&#39;ECM en utilisant un filtre d&#39;excitation et d&#39;émission de 492/518 nm. </li></ol> 6. Préparation et imagerie de la force de traction Essais <ol><li> Ajouter 15,000 cellules cancéreuses dans 2 ml de milieu de invadopodes de la vaisselle à fond de verre et incuber pendant une nuit. </li><li> Support d&#39;Aspirer dans les boîtes à fond de verre et le remplacer par 2 ml de milieu L-15, avec les mêmes suppléments (5% de sérum faible teneur en protéines, le sérum de veau fœtal à 10% et 20 ng / ml de fraîchement ajoutée facteur de croissance épidermique), pré -warmed à 37 ° C. </li><li> Incuber les boîtes à fond de verre dans une chambre environnementale sur un microscope inversé pré-équilibrée à 37 ° C avec une humidité élevée pendant 1 heure. </li><li> Prendre quatre ensembles d&#39;images en utilisant une haute NA, 40X lentille sur un microscope inversé à grand champ avec une étape automatisée pour marquer les positions cellulaires: <ol><li> cellules image surp des AAP en utilisant le contraste de phase (de l&#39;image &quot;de phase&quot;). </li><li> Image microsphères fluorescentes utilisant excitation et d&#39;émission de 560/645 nm filtres en mettant l&#39;accent légèrement sous les cellules jusqu&#39;à ce que la première couche de microsphères en haut de l&#39;AAP est au point (&quot;souligné&quot; l&#39;image). </li><li> En outre, se concentrer sur le fond de l&#39;AAP (en utilisant les microsphères comme marqueurs) et prendre une image (&quot;bas&quot; image). Remarque: Le but de cette image est pour enregistrer la position z pour obtenir l&#39;épaisseur de l&#39;AAP réelle à chaque position pour le calcul de la force de traction comme décrit dans Les résultats représentatifs. </li><li> Après ces images ont été acquises à plusieurs positions, mélanger doucement dans 220 pi de solution à 10% de Triton-X pour enlever les cellules. microsphères de l&#39;image en haut de la PAA à chaque position comme décrit précédemment (image de &quot;null&quot;). </li></ol></li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. 1046, 171-189 (2013).</li><li>Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+moduli+of+normal+and+pathological+human+breast+tissues:+an+inversion-technique-based+investigation+of+169+samples).">Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples).</a> Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).</li><li>Wang, J. H., Lin, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+traction+force+and+measurement+methods.">Cell traction force and measurement methods.</a> Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).</li><li>Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+traction+stresses+exerted+by+locomoting+cells+with+the+elastic+substratum+method.">Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method.</a> Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).</li><li>Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+elasticity:+measurements+by+atomic+force+microscopy+and+its+influence+on+cell+differentiation.">Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation.</a> Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+toward+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).</li><li>Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+outgrowth+and+branching+of+PC12+cells+on+very+soft+substrates+sharply+decreases+below+a+threshold+of+substrate+rigidity.">Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity.</a> J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).</li><li>Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+stiffening+of+embryonic+tissues+via+microtubules,+RhoGEF+and+the+assembly+of+contractile+bundles+of+actomyosin.">Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin.</a> Development. 137, 2785-2794 (2010).</li><li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+cells+feel:+methods+for+thin+gels.">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> J Phys Condens Matter. 22, 194116 (2010).</li></ol>

Ce travail a été soutenu par le National Cancer Institute des National Institutes of Health en vertu Prix Nombre K25CA143412 (Parekh). Nous tenons à souligner que le soutien supplémentaire a été fourni par le Département d&#39;ORL. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

Nous présentons une méthode pour fabriquer AAP qui peuvent être utilisés comme base pour invadopodes et de la force de traction des essais de corréler les comportements cellulaires invasives et contractiles. Alors que PAA ont longtemps été utilisés pour examiner les effets de rigidité sur les cellules et calculer les forces de traction 18,24,27, ce protocole est le premier à développer des tests parallèles fondés sur PAA avec les mêmes rigidités de corréler les comportements cellulaires invasi...

La rigidité de l&#39;ECM associé à une tumeur a été identifiée comme un facteur important dans la conduite de comportement malin en augmentant la contractilité actomyosine 1-3. Bien que cet effet a principalement été mise en évidence avec des cellules de cancer du sein, de la matrice de rigidité se est avérée modifier les propriétés invasives de cellules dérivées d&#39;une variété de cancers 08.04 suggérant que la rigidité de la tumeur peut jouer un rôle dans d&#39;autres types de cancers. Pour pénétrer les tissus réticulés pendant la migration invasive, les cellules cancéreuses utilisent saillies adhésives actine riches appelés invadopodes que localiser protéases pour dégrader focalement l&#39;ECM neuf. Invadopodes sont considérées comme une caractéristique de cellules invasives et ont été impliqués dans l&#39;invasion des cellules tumorales et des métastases 10,11. Des travaux antérieurs ont montré que la matrice de rigidité peut réguler numéros de invadopodes et la dégradation de l&#39;ECM 4,12 associée par l&#39;activité myosine II et protéines mécanosensibles 12. Compte tenu ducorrélation entre la densité de la tumeur et l&#39;agressivité du cancer 13,14, ces résultats suggèrent un mécanisme par lequel les cellules cancéreuses peuvent répondre aux tissus tumoraux rigides à conduire invasion et métastases travers contractilité actomyosin. Il a été démontré in vitro ECM rigidité et de la densité des tissus in vivo pour réglementer le comportement invasif des cellules cancéreuses 1,15-17. Alors que actomyosine contractilité semble être important dans ce processus, les études actuelles conflit quant à savoir si la capacité métastatique est corrélée à une augmentation ou diminution de forces contractiles 6,18-20. En outre, il ne sait pas si ces forces médiation directement l&#39;activité de invadopodes 21. Nous avons récemment découvert que les forces de contraction des cellules cancéreuses étaient dépendants de la rigidité et la matrice étaient prédictifs de dégradation ECM par invadopodes 5. Ces résultats suggèrent que les forces cellulaires peuvent jouer un rôle important dans la progression du cancer par la médiation invadopodes activité en réponse aux propriétés mécaniques du micro-environnement de la tumeur. Afin de corréler propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses 5, nous avons modifié un protocole pour la création de PAA avec différentes rigidités qui a été précédemment utilisés pour enquêter sur les activités de invadopodes rigidité dépendante 4,12,22. Par réticulation chimique de la fibronectine de plasma humain à travers le FQA, ces hydrogels modifiés peuvent être utilisés comme base pour les deux dosages invadopodes et des forces de traction afin de se assurer que les cellules ont subi les mêmes rigidités dans les deux expériences 5. Dans les dosages de invadopodes, la fibronectine fournit un domaine de liaison naturel pour la gélatine pour lier l&#39;ECM superposée à l&#39;AAP pour détecter la dégradation de la matrice. Dans les essais de la force de traction, la fibronectine fournit un ligand pour l&#39;adhésion cellulaire direct à détecter des déplacements de microsphères utilisées dans le calcul des forces de traction cellulaires. Cette méthode aboutit à ce que nous avons appelé doux, dur,AAP et rigides qui sont liés à des plats à fond de verre et ont des modules élastiques, E, de 1023, 7307, et 22 692 Pa 5 qui couvrent la gamme de propriétés mécaniques rapportés pour les tissus normaux et cancéreux 23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-Aminopropyltrimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (40%)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic acid NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8060</td>
			<td>prepare fresh in fume hood 10 mg/ml in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 phalloidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A22283</td>
			<td>can also use rhodamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>prepare fresh 10% solution in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18606</td>
			<td>use six drops to fill microwells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS (2%)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>RPI</td>
			<td>A30075</td>
			<td>make 3% for blocking solution in 1X PBS and store in 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (12 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9777</td>
			<td>pre-equilibrate in borate buffer for 15-30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>use to make acrylic acid NHS ester solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>PHARMCO-AAPER</td>
			<td>E200</td>
			<td>dilute with ultrapure water to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>00639</td>
			<td>typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 &#176;C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes (35 mm coverslips)</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14-C</td>
			<td>coverslips are uncoated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (25%)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>01909</td>
			<td>dilute with 1X PBS to 0.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse Alexa Fluor 633 antibody&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human plasma fibronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>33016-015</td>
			<td>add 5 ml of ultrapure water to make 1 mg/ml; aliquot in volumes based on use to avoid excessive freezing and thawing cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>PX-1565-1</td>
			<td>use to make 10X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-cortactin 4F11 antibody&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>05-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX-0720-1</td>
			<td>use to make 10X PBS stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S23020</td>
			<td>use to make 10X PBS stock and borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (1 N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770</td>
			<td>dilute with ultrapure water to 0.1 N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu-Serum (low-protein serum)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>355500</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros</td>
			<td>416785000</td>
			<td>typically make 10% stock in 1X PBS, prepare in fume hood, and add a few ml of strong NaOH to dissolve paraformaldehyde easily then bring back to pH 7.4 with strong HCl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (sterile)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>use for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td>use to make invadopodia medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>prepare fresh in fume hood 1 mg/ml in 1X PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium metaborate tetrahydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0251</td>
			<td>use to make borate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S24060</td>
			<td>typically make 10 ml of 1%sucrose/1% gelatin solution in PBS and store at 4 &#176;C (preheat PBS to dissolve gelatin easily)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A16046</td>
			<td>make 10% stock in 1X PBS and use as is for cell removal in traction force assay or dilute with 1X PBS for staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polyacrylamide gels for invadopodia and traction force assays on cancer cells

Tissus tumoraux rigides ont été fortement impliqué dans la régulation de la migration cellulaire et l&#39;invasion du cancer. La migration invasive à travers les tissus réticulés est facilitée par des saillies d&#39;actine riches appelés invadopodes qui dégradent protéolytique la matrice extracellulaire (ECM). invadopodes activité a été démontré que la rigidité dépendante de l&#39;ECM et des cellules cancéreuses ce qui suggère que les forces de contraction des signaux de rigidité peuvent réguler ces structures sous-cellulaires à travers actomyosine contractilité. Propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses peuvent être corrélées in vitro en utilisant des tests de invadopodes et de la force de traction basés sur des gels de polyacrylamide (PaaS) de rigidités différentes. Propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses peuvent être corrélées in vitro en utilisant des tests de invadopodes et de la force de traction basés sur des gels de polyacrylamide (PaaS) de rigidités différentes. Bien qu&#39;il existe quelques différences entre les deux essais, le protocole présenté ici fournit un procédé pour créer FQA eà peut être utilisé dans les deux essais et sont facilement adaptables aux besoins biologiques et techniques spécifiques de l&#39;utilisateur.

Dans le test de invadopodes, invadopodes sont généralement identifié par colocalisation des marqueurs comme l&#39;actine et cortactine les structures ponctuées dans le corps cellulaire (figure 1). Les deux invadopodes dégrader activement et non dégradantes peut être compté et se différencient par le fait que ces structures sont colocalisés avec des zones dépourvues de noir dans le signal fluorescent fibronectine marqué au FITC (figure 1). Invadopodes sont comptées manuellem...

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Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Rigidité mécanique dans le microenvironnement de la tumeur joue un rôle crucial dans la conduite de comportement malin en augmentant l&#39;activité de invadopodes et contractilité actomyosin. En utilisant des gels de polyacrylamide (PaaS), invadopodes et de force de traction tests peuvent être utilisés pour étudier les propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses en réponse à la matrice de rigidité.

gels de polyacrylamide pour invadopodes et la force de traction Les essais sur les cellules cancéreuses

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.0K vues.  Vanderbilt University Medical Center.  Rigidité mécanique dans le microenvironnement de la tumeur joue un rôle crucial dans la conduite de comportement malin en augmentant l'activité de invadopodes et contractilité actomyosin. En utilisant des gels de polyacrylamide (PaaS), invadopodes et de force de traction tests peuvent être utilisés pour étudier les propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses en réponse à la matrice de rigidité. 

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Traitement des tissus de tumeur cérébrale primaire pour les essais sur les cellules souches et les flux de tri

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

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Médecine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l&#39;homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l&#39;aide de deux méthodes différentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

Formation de l&#39;épithélium de la prostate humaine utilisant la recombinaison des tissus de rongeurs urogénital Mesenchyme des sinus et des cellules souches humaines

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adaptation des semi-automatique de circulation des cellules tumorales (CTC) Essais pour les applications cliniques et précliniques de recherche

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profilage de microARN œstrogène réglementés dans les cellules du cancer du sein

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Méthode pour l&#39;obtention de cellules cancéreuses ovariennes primaires à partir d&#39;échantillons solides

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Enrichissement pour chimiorésistantes cancer de l&#39;ovaire des cellules souches à partir de lignées cellulaires humaines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Un système organotypiques à haut débit pour la caractérisation de la sensibilité des médicaments cellules du myélome multiple primaire

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...