Ce travail a été soutenu par National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL-36573. Nous remercions M. David Sowa pour l&#39;édition de ce manuscrit.

Toutes les recherches sur des souris a été fait selon les procédures et les lignes directrices des Instituts nationaux de la santé, et les protocoles ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université de Toledo, Collège de médecine et de sciences de la vie. 1. Préparation système de perfusion <ol><li> La veille de l&#39;isolement, de remplir le système de perfusion entier (y compris les réservoirs) avec une solution de détergent sans résidus alcaline rapide. Laisser la solution de pénétrer dans le système pendant quelques heures ou toute la nuit. </li><li> Le lendemain matin, régler la température de cyclage thermique à 37 ° C et laissez la solution se réchauffer. Retirer la solution de détergent et rincer soigneusement le système avec de l&#39;eau distillée stérilisée. Ne pas oublier toutes les branches latérales. </li><li> Remplir le système de tampon de perfusion via une pompe péristaltique constante et d&#39;en tirer les bulles d&#39;air hors de la chambre de l&#39;aorte (piège à bulles) avec une seringue latéral pour protégerau cœur de l&#39;occlusion coronaire. Le débit de la pompe péristaltique de débit doit être vérifié régulièrement. </li></ol> 2. Préparation de tampons, milieux de culture, et plats <ol><li> Perfusion tampon: Faire 500 ml de tampon de perfusion 1x avant utilisation. Ce tampon sans calcium contient 113 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 0,6 mM KH 2 PO 4, 0,6 mM Na 2 HPO 4, 1,2 mM MgSO 4, 10 mM de Na-HEPES, 12 mM NaHCO 3, 10 mM KHCO3, 0,032 phénol mM rouge, 30 mM taurine, mM BDM 10, et 5,5 mM de glucose. Ajuster le pH à 7,0 avec HCl 2 M et filtrer à travers un filtre de 0,2 um, conserver à 4 ° C. Note: a) La solution de perfusion doit être préparé le jour même où elle est utilisée. Dans certains cas, il est acceptable pour stocker la solution pendant moins de 3 jours à 4 ° C. b) Ce tampon a une concentration élevée en potassium à 15,3 mM, qui peut garder les cardiomyocytes de repos, réduire ATP consommation et augmenter le Ca 2 + capacité tolérant. </li><li> Digestion Buffer (300 U / ml de 25-50 ml / coeur): préparer juste avant la perfusion. Peser 15 000 U de l&#39;activité totale de collagénase de type II, dissoudre dans 50 ml de tampon de perfusion dans la culture capot. Ajouter 25 ul de 100 mM de CaCl2 (solution de stock, filtre stérilisé) pour rendre la concentration de calcium finale 50 uM. Réchauffer le tampon à 37 ° C lorsqu&#39;il est prêt à l&#39;isolement. Contrairement à la trypsine, la collagénase fonctionne mieux en présence de 50-100 pM Ca 2 +. </li><li> Stop Buffer (50 ml / coeur): Utiliser la culture capot. Mélanger 45 ml de tampon de perfusion avec 5 ml de FBS stérile. <ol><li> Ca 2 + solution I (12,5 uM de Ca 2 +): Ajouter 2,5 pi de 100 mM de CaCl 2 à 20 ml de tampon d&#39;arrêt et mélanger. </li><li> Ca 2 + solution II (100 uM de Ca 2 +): Ajouter 10 ul de 100 mM de CaCl 2 à 10 ml de tampon d&#39;arrêt et mélanger. </li><li> Ca 2 + solution III (400 uM de Ca 2 +): Ajouter 40 ul de 100 mM de CaCl 2 à 10 ml de tampon d&#39;arrêt et mélanger. </li><li> Ca 2 + solution IV (900 uM de Ca 2 +): Ajouter 90 ul de 100 mM de CaCl 2 à 10 ml de tampon d&#39;arrêt et mélanger. </li></ol></li><li> Placage moyen (50 ml / coeur): Transfert 43 ml de MEM contenant 2 mM de L-glutamine et 1,26 mM de CaCl2 dans un tube conique de 50 ml stérile dans la culture capot et ajouter 5 ml de FBS, 1 ml de solution stock BDM ( 500 mM, stérilisée par filtration), et 0,5 ml de pénicilline / streptomycine (10 000 U / ml). Mélanger et équilibrer pendant 2 à 3 heures avant l&#39;isolement des myocytes dans 2% de CO2, 37 ° C incubateur avec les bouchons en vrac. Juste avant myocytes placage, ajouter 0,5 ml de 200 mM d&#39;ATP (pH 7.2, solution de stock, filtre stérilisé) dans le milieu. </li><li> Le milieu de culture (50 ml / coeur): Transfert de 48 ml de MEM contenant 2 mM de L-glutamine et 1,26 mM de CaCl2 dans un tube conique de 50 ml stérile dans la culture capot et ajouter 1 ml de solution stock BDM (500 mM, filter stérilisé), et 0,5 ml de pénicilline / streptomycine (10 000 U / ml). Mélanger et s&#39;équilibrer dans 2% de CO2, 37 ° C incubateur avant l&#39;isolement des myocytes. Avant l&#39;utilisation, ajouter 0,5 ml de 100 mg / ml de BSA (filtre stérilisé) dans le milieu. Remarque: L&#39;utilisation d&#39;un incubateur à CO2 de 2% facilite maintenant le milieu de culture à pH 6,9-7,0, ce qui aide les myoctyes conservent leur morphologie en forme de tige jusqu&#39;à 24 h. </li><li> Laminine (1-2 mg / cm 2) plats revêtus ou plaques: Transfert 200 pi de 1 mg / ml de laminine de souris naturel à 20 ml de PBS stérile (w / o calcium et magnésium) et mélanger. Ajouter 1 ml de boîtes de 35 mm, 2,5 ml aux plats de 60 mm, ou 5 ml de plats de 100 mm, agiter pour couvrir uniformément les surfaces, et le lieu dans 2% de CO 2, 37 ° C incubateur jusqu&#39;à myocytes placage. Remarque: Si la vaisselle ou les plaques ne sont pas utilisés sur la journée couché, ils peuvent être scellés avec du Parafilm et conservés à 4 ° C pendant la nuit (de revêtement lent). L&#39;étanchéité est requIRED pour éviter l&#39;évaporation et la contamination. Des plaques revêtues peuvent être conservés à 4 ° C pendant 1 semaine. </li></ol> 3. Retrait de souris de coeur et Canulation <ol><li> Faire tremper les ciseaux et des pinces dans 70% d&#39;éthanol pendant 30 minutes et laissez-les sécher. </li><li> Peser la souris à 0,1 gramme près. Enregistrer son poids corporel, la souche, le sexe et la date de naissance. </li><li> Injecter 200 ul de l&#39;héparine (100 IU / souris) ip 10 min avant l&#39;anesthésie pour empêcher la coagulation du sang dans les artères coronaires. Anesthésier les souris avec 200 mg / kg de poids corporel de kétamine et 10 mg / kg de poids corporel de xylazine par injection ip et attendre 5 à 10 min jusqu&#39;à ce que la souris ne répond plus à pincées queue / d&#39;orteil. </li><li> Fixez la souris en position couchée en fixant délicatement les pattes de devant et pattes arrière sur une surface de travail pinnable (c.-à-styromousse) sur un plateau de chirurgie animale ou une table banc près le système de perfusion. </li><li> Essuyez la poitrine et l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol. Faire une ligne médiane peau incision de la mi abdomen à la membrane avec une paire de ciseaux chirurgicaux. </li><li> Couper le diaphragme avec un autre ciseaux chirurgicaux et maintenez le sternum avec des pinces dentelées courbes. Couper bilatérale et Retroflect cage thoracique pour exposer le coeur. </li><li> Soulevez le coeur légèrement à l&#39;aide de fines pinces dentelées et atraumatiques courbes et disséquer le cœur de la cavité thoracique aussi proche que possible de la paroi thoracique dorsale. </li><li> Transférer le cœur à une boîte de 100 mm contenant un tampon de perfusion froide. Couper avec précaution loin les tissus conjonctifs tels que les poumons, le thymus, et des bronches. </li><li> Identifier l&#39;aorte et de ses branches crâniens, qui sont habituellement dissimulés par le thymus et coussinet adipeux. Coupez l&#39;aorte en dessous de sa première branche 13, saisir la paroi aortique, soulever le cœur, et légèrement glisser sur la canule aortique de perfusion remplie de liquide (1,0 mm OD canule en acier inoxydable avec pointe émoussée / plat et encoches 1 et 2 mm au-dessus la pointe, ou une aiguille 22 G d&#39;alimentation réutilisable) en utilisant deux ultra fine pointe forceps. Remarque: a) Le liquide de perfusion doit être ruisselant pendant la canulation coeur pour empêcher les bulles de gaz de pénétrer dans les artères coronaires; b) Garder la pointe de la canule juste au-dessus de la valve aortique. </li><li> Fixer l&#39;aorte à la canule et ligaturer l&#39;aorte à la canule de soie 6-0 chirurgicale. L&#39;ensemble canule devrait prendre moins de 120 secondes. </li></ol> 4. Coeur perfusion et digestion <ol><li> Perfuser le coeur avec le tampon de perfusion exempte de calcium à raison de 4 ml / min environ 4-5 min jusqu&#39;à ce que les effluents deviennent claires, puis passer à un tampon de digestion contenant 50 uM CaCl2 et perfuser pour 3,5 à 20 min selon la souche de souris, la pression de perfusion et de l&#39;activité de la collagénase. Le cas échéant, augmenter la pression de l&#39;aorte à 70-80 mmHg lors de la digestion. Si nécessaire, enzyme de perfusion peut être recyclé pour la digestion. Typiquement, le tampon 300 U / ml d&#39;enzyme va digérer un coeur en 10 à 12 min à un débit de 4 ml / min de débit;Si l&#39;application de la pression de la post-charge à 70 mmHg, 300 U / ml auront seulement 3,5-5,5 min à une vitesse de 4 ml / min. </li><li> Arrêtez la digestion quand le coeur devient légèrement pâle et flasque. Il devrait être spongieux lorsqu&#39;on la pince doucement. </li></ol> 5. Cellules dissociation et de calcium réintroduction <ol><li> Tirez l&#39;aorte de la canule avec 70% d&#39;éthanol forceps trempé et mettre le cœur dans un plat stérile de 60 mm contenant 2,5 ml de tampon de digestion. Déplacer dans la hotte de culture en utilisant des fournitures stériles, rester conscient de techniques stériles pour cela et des mesures de suivi. </li><li> Retirer aorte, oreillettes, et des gros vaisseaux avec des ciseaux chirurgicaux fines. Doucement taquiner le ventricule en 10-12 petits morceaux avec deux pinces à pointe fine. </li><li> Pipette délicatement les morceaux de coeur et les cellules de haut en bas ~ 10x avec une pipette de transfert de 10 ml et transférer dans un tube conique en polypropylène de 15 ml. Rincer le plat avec 7,5 ml de solution de calcium I contenant 12,5 uM CaCl 2 et le transfertce dans le tube, résultant en un volume final de 10 ml. </li><li> Pipette doucement la suspension de cellules de haut en bas à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert fine pointe pour disperser les gros morceaux de tissu cardiaque. </li><li> Puis centrifuger pendant 3 min à 20 xg de séparer les petites cellules non-myocytes, tels que des cellules endotheliales et des fibroblastes. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre le culot de myocytes dans 10 ml de solution de calcium je avec un supplément de 100 pi de 200 mM d&#39;ATP (pH 7.2, solution de stock, filtre stérilisé). Laisser le tube dans la hotte pour 3-5 min. </li><li> Transfert dupliquer des aliquotes de 10 pi à un hématimètre pour compter les myocytes en forme de tige et rond. Calculer le nombre total de myocytes et de calculer le pourcentage de myocytes en forme de tige. </li><li> Centrifuger les myocytes de 3 min à 20 x g. Enlever le surnageant et remettre en suspension les pastilles dans 10 ml calcium solution II contenant 100 uM CaCl 2. Disperser les myocytes avec la pointe fine pipette de transfert par aspirationde haut en bas. </li><li> Répéter l&#39;étape ci-dessus (5,8) en utilisant une solution de calcium III (400 uM de CaCl2) et IV (900 uM de CaCl2), respectivement. </li><li> Pour la culture primaire des myocytes de la souris, remettre en suspension la pastille finale de myocytes dans 5 ml de milieu d&#39;étalement. Compter le nombre total de myocytes et de calculer le pourcentage de myocytes en forme de tige. </li></ol> 6. Culture cellulaire <ol><li> Ajuster la concentration des myocytes en forme de tige à 25 000 en forme de tige myocytes / ml dans un tube de 50 ml. Pipette doucement les myocytes en utilisant une pipette de 10 ml pour les suspendre bien. Éviter la sédimentation des cellules dans la pipette et le tube pour assurer l&#39;égalité de la densité cellulaire pour chaque plat ou une assiette. </li><li> Après aspiration de la solution de revêtement de la laminine, plaquer les myocytes dans les plats ou assiettes. Faites glisser délicatement les plats ou assiettes à terme et trois à quatre fois en amont et secondaires à côté dans un motif en forme de croix sur la surface de la hotte de culture. </li><li> Placez les plats ou assiettes dans un 2% de CO2 étuve à 37 ° C. Incuber pendant 1 à 3 heures pour permettre la fixation de myocytes à une vitesse d&#39;environ 80%. </li><li> Après fixation, aspirer doucement le milieu contenant les myocytes seules et les débris cellulaires. Ajouter doucement le milieu de culture pour les côtés des boîtes ou des plaques. Effectuer ce changement moyen un par un. Remettre immédiatement les plats ou assiettes à l&#39;incubateur. </li><li> Après O / N culture, les myocytes peuvent être modifiés dans le même milieu sans BDM avant que les études de la signalisation cellulaire à court terme. Gardez la BDM dans la culture à long terme pour les essais hypertrophiques ou apoptose. Remarque: BDM (2,3-butanedione monoxime) peut inhiber la myosine-ATPase et de prévenir la contraction. Son inhibition de la contraction base myosine est facilement réversible. Il est rapporté que BDM peut avoir des effets secondaires potentiels, tels que agissant comme une phosphatase non spécifique, l&#39;augmentation de la libération de calcium à partir de SR, et la modification de la concentration de calcium libre et prope électrique cellulaireles parties prenantes, donc avant le traitement, la BDM doit être supprimée. En outre, dans certains cas, un inhibiteur spécifique de la myosine II blebbistatin pourrait être un autre médicament pour inhiber la contraction des cardiomyocytes 8,9. Cependant, dans nos cas, BDM est mieux que blebbistatin pour le bien de la qualité et la quantité des cardiomyocytes. </li></ol>

<ol>
	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).</li><li>Gross, D. R., Gross, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).</li><li>Schl&#252;ter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+ventricular+cardiomyocytes.">Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 557-567 (2005).</li><li>O&#39;Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+cardiac+myocytes+for+signaling+studies.">Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies.</a> AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).</li><li>O&#39;Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C., Vivanco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 35, 271-296 (2007).</li><li>Nilolskaya, A., Sharma, V., Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+and+methods.">Cell culture models and methods.</a> Cardiac Electrophysiology Methods and Models. , 213-235 (2010).</li><li>Merx, M. W., Schrader, M., Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+working+heart.">The working heart.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 173-189 (2005).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamic+instability+and+wavelength+in+arrhythmia+maintenance+as+revealed+by+panoramic+imaging+with+blebbistatin+vs.+2,3-butanedione+monoxime.">The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).</li><li>Liu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+Na/K-ATPase+potentiates+Marinobufagenin-induced+cardiac+dysfunction+and+myocyte+apoptosis.">Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+the+cardiac+Na+/Ca2+-exchanger+in+ouabain-induced+inotropy,+cell+signaling,+and+hypertrophy.">Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).</li><li>Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+PI3K-AKT+signaling+pathway+with+digitalis-induced+hypertrophy+of+cardiac+myocytes.">Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Pour la meilleure préparation, les étapes les plus importantes sont: 1) l&#39;accrochage rapidement le cœur de la souris à la canule après l&#39;excision; 2) la perfusion cardiaque approprié. Notez également que la qualité de l&#39;eau, température de perfusion, le pH du tampon, la stérilisation, la pureté chimique, et propre, des tubes et des chambres non-contaminés sont également des facteurs importants. 18.2 mQ biologie moléculaire de qualité H 2 O est fortement recommandé pour la préparation de tampon. Le pH ...

Les cardiomyocytes sont pas proliférative. Il existe certaines lignées de cellules cardiomyocytes auriculaires, telles que HL-1 et les cellules AT-1 dérivées de tumeurs de souris atriaux; cependant, il n&#39;y a pas de lignées cellulaires de cardiomyocytes ventriculaires adultes disponibles pour la recherche. Cultures de cellules primaires de cardiomyocytes de souris adultes fournissent un modèle puissant pour la recherche cardiaque au niveau cellulaire et moléculaire. À ce jour, ils ont été largement utilisés pour biochimique, physiologique et pharmacologique recherche 1. En outre, l&#39;utilisation fréquente de souris génétiquement modifiées a nécessité des méthodes efficaces d&#39;isolement des cardiomyocytes. Culture pure permet des conditions libres de l&#39;interaction avec d&#39;autres organes et la circulation systémique, par exemple par des facteurs neuro-hormonaux et hormone-like endogènes 2,3. Cependant, l&#39;isolement de succès des cardiomyocytes peut être difficile. Le protocole que nous présentons ici sont basées sur nos expériences avec cardiomyocyt de rat adultees et la méthode décrite par O&#39;Connell et al 4,5. Surtout en 2007 5, ils ont décrit des techniques détaillées à partir de préparations de tampons à la culture de cellules et analyse fonctionnelle. Etant donné que les myocytes de souris sont très sensibles à la contracture par rapport aux cardiomyocytes de rats, des tampons ou des milieux utilisés pour la perfusion, la digestion, la Ca 2 + tolérance, le placage et la culture dans le protocole de la souris sont complétées avec un inhibiteur de couplage excitation-contraction non spécifique, 2, 3 Butanedione monoxime (BDM) pour inhiber leur contraction spontanée, donc la viabilité et le rendement des myocytes en forme de tige d&#39;améliorer de manière significative. Dans le protocole présenté ici, les myocytes sont séparées dans un tampon à haute teneur en potassium du coeur isolé par perfusion de Langendorff modifié avec de la collagénase de type II. Collagénase II rompt effectivement vers le bas la matrice intercellulaire et cellules libère. La solution de perfusion conserve également le métabolisme cellulaire à un faible niveau 6. En additi, le système cardiaque isolé de Harvard Apparatus, nous avons utilisé ici est bien conçu pour une température précise et un contrôle permanent de la pression 7. Cette approche fournit des préparations hautement reproductibles et des populations uniformes de type cellulaire unique, qui peut être utilisé dans la culture pendant une nuit pour la mesure de protéines de signalisation ou de la culture de 2-3 jours pour les dosages hypertrophiques cardiaques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:257px;">Isolated heart system for small rodent</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">IHSR-mouse 73-4019</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">73-2816</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11294-00</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight sharp serrated scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">14070-12</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11050-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Curved, serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11052-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight Mini Serrefines clamps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">18054-28</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">MEM</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:99px;">11575-032</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">4176</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mucosal universal detergent</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">Z637181</td>
			<td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

Les progrès technologiques ont fait des souris génétiquement modifiées, y compris les souris transgéniques et knock-out de gène, un outil essentiel dans de nombreux domaines de recherche. Cardiomyocytes adultes sont largement acceptés comme un bon modèle pour la physiologie cellulaire cardiaque et la physiopathologie, ainsi que de l&#39;intervention pharmaceutique. Les souris génétiquement modifiées interdisent la nécessité de processus d&#39;infection des cardiomyocytes complexes pour générer le génotype désiré, qui sont inefficaces en raison de la différenciation terminale des cardiomyocytes. Isolement et culture de haute qualité et de quantité des cardiomyocytes fonctionnels seront considérablement profit de la recherche cardiovasculaire et de fournir un outil important pour la recherche sur la transduction de la signalisation cellulaire et le développement de médicaments. Ici, nous décrivons une méthode bien établie pour l&#39;isolement des cardiomyocytes de souris adultes qui peuvent être mises en œuvre avec peu de formation. Le cœur de la souris est excisé et une canule à un système de cœur isolé, alors perfusé avec un sans calcium et de haute potassium tampon suivie par collagénase de type II digestion en mode perfusion rétrograde de Langendorff. Ce protocole donne un résultat uniforme pour la collecte des cardiomyocytes fonctionnels de souris adulte à partir d&#39;une variété de souris génétiquement modifiées.

1. Isolation réussie Quantification Deux critères sont utilisés pour quantifier le succès de l&#39;isolation: d&#39;abord, le nombre total des cardiomyocytes isolés, et d&#39;autre part, le rapport des myocytes non tolérants au calcium tolérant pour arrondir en forme de tige. En général, ce protocole prend environ 75-90 min de l&#39;enlèvement de coeur de myocytes placage et des rendements d&#39;environ 1 million de cardiomyocytes en forme de tige (70-90% du total des myocytes récolt...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Nous décrivons une méthode fiable pour l&#39;isolement des cardiomyocytes de souris adultes. Ce protocole donne un résultat cohérent pour la culture des cardiomyocytes adultes fonctionnels à partir d&#39;une variété de souris génétiquement modifiées.

Isolement et culture de cardiomyocytes adultes de souris pour Signalisation cellulaire et<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrophie cardiaque

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

isolation-culture-adult-mouse-cardiomyocytes-for-cell-signaling-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

47.3K vues.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences.  Nous décrivons une méthode fiable pour l'isolement des cardiomyocytes de souris adultes. Ce protocole donne un résultat cohérent pour la culture des cardiomyocytes adultes fonctionnels à partir d'une variété de souris génétiquement modifiées. 

Vidéo: Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

L&#39;isolement et la manipulation génétique des adultes pour les myocytes cardiaques imagerie confocale

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Recherche

Biologie

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Profilage Single Cell transcriptionnelle des cardiomyocytes de souris adultes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolement et culture des fibres musculaires individuelles et de leurs cellules satellites du muscle squelettique adulte

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolement et culture de cardiomyocytes de souris néonatales

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes Cardiomyoctyes souris

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

L&#39;isolement et l&#39;analyse physiologique de cardiomyocytes de souris

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales dentaire de l&#39;adulte de souris Incisive

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

L&#39;isolement, la culture et la transduction des adultes cardiomyocytes souris

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolation et culture des kératinocytes de la souris primaire de la peau de souris néonatale et adulte

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Isolement des kératinocytes épidermiques de souris et de leur culture clonogène in vitro

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...