L’objectif de cette vidéo est de démontrer un protocole normalisé pour l’isolement des cardiomyocytes adultes, la culture à long terme et la transfection. Isoler et cultiver les cardiomyocytes de souris ou de rats continue d’être une méthode essentielle pour étudier la biologie cellulaire autonome des cardiomyocytes dans le cœur sain et de la maladie. Il y a plusieurs questions auxquelles nous pouvons répondre à l’aide de cardiomyocytes isolés.
Comme le potentiel proliférant. Il y a des changements d’expression de gène ou des expressions spécifiques de cytokine sur la réponse de blessure. Malheureusement, les cardiomyocytes de souris ne survivent pas au-delà d’une semaine dans des conditions normales de culture.
Par conséquent, dans cette vidéo, nous décrivons une méthode optimisée pour isoler les cardiomyocytes adultes de souris, les transfixés et les avons cultivés bien au-delà de 21 jours, cette technique est d’abord difficile à maîtriser. Mais avec la pratique, on peut atteindre environ 80 à 90% survivre dans les cardiomyocytes après l’isolement et environ une efficacité de transfection à 100 pour cent. Et la plupart de ces cardiomyocytes dans des conditions correctes peuvent survivre au-delà de 20 jours.
Nettoyez et stérilisez vos instruments chirurgicaux en les trempant dans 70% d’alcool pendant 15 minutes et en les lavant par la suite avec de l’eau distillée double. Après l’eau, laisser sécher les outils dans l’air, nettoyer l’appareil de profusion en courant 70% d’alcool deux fois pendant cinq minutes chacun. L’augmentation du débit aidera à nettoyer le tube après que l’alcool rince tout alcool restant en faisant couler l’eau distillée double pendant 10 minutes.
mettre en place trois plats pour nettoyer le cœur après l’excision. Remplissez chacun des plats avec 20 millilitres de tampon de myocyte. Ajouter deux à trois gouttes d’héparine à chaque plat avec la pipette Pasteur et bien mélanger en pipetting de haut en bas plusieurs fois.
Prenez une seringue de 10 millilitres et remplissez-la d’un tampon de myocyte. Retirez l’une des bulles d’air de la seringue et placez-la dans le troisième plat en position inclinée, en la sécurisant avec du ruban adhésif. Préparer un nœud lâche avec suture chirurgicale et le placer autour de l’aiguille.
Injecter de l’héparine à la souris par injection IP 20 minutes avant l’anesthésie. Faites circuler le tampon de profusion de myocyte par l’appareil de profusion à une vitesse d’écoulement de trois millilitres par minute. Après cinq minutes, remplacer le tampon de profusion par une solution enzymatique, saturer la solution enzymatique avec de l’oxygène pendant le processus, encore une fois, définir la solution enzymatique à un débit de trois mLs par minute.
Confirmez l’anesthésie par pincement des pieds et placez la souris sur la plate-forme chirurgicale. Stériliser la peau avec 70% d’alcool. Ouvrez soigneusement la poitrine, exercez le cœur et mettez le cœur dans le premier plat.
Effacer le sang du cœur en serrant doucement, puis transférer le cœur dans le deuxième plat pour nettoyer davantage le sang du cœur et enlever les tissus non cardiaques. Transférer ensuite le cœur dans le troisième plat. Trouvez l’aorte et utilisez vos forceps pour le garder Peyton plus le placer autour de l’aiguille de cannulating.
Fixez-le en tirant vers le bas votre serrage pré serré noeud, puis faire un deuxième noeud. Pour plus de stabilité fixer l’ordre et le lieu à l’aide d’un clip. Coupez tout fil de suture excédentaire, et enfin commencer la profusion cardiaque en utilisant le tampon myocyte dans la seringue pour effacer tout le sang restant dans le cœur.
Retirez soigneusement l’aiguille de calcul de la seringue et accrochez-la à l’appareil de profusion. Essayez d’empêcher les bulles d’air d’entrer dans le cœur. Comme cela peut affecter le flux de la solution enzymatique et la digestion.
Déplacez la veste d’eau vers le haut, pour fournir un environnement homogène au coeur pendant la profusion. Laissez la solution enzymatique circuler à travers le cœur avec une vitesse de deux à trois mLs par minute. Laissez la solution enzymatique couler à travers le cœur pendant deux minutes.
À deux minutes, mélanger dans 40 microlitres d’une centaine de micromolaire solution de chlorure de calcium à la solution enzymatique. Laissez passer la solution enzymatique dans le cœur pendant encore 10 à 15 minutes. Une fois que le flux devient lisse et le cœur commence à regarder brun et doux, vous savez que vous avez une distribution égale de l’enzyme collagène pour atteindre une bonne digestion du cœur.
Lorsque vous pensez que votre digestion est terminée, prenez le cœur vers le bas du système de perfusion Langendorff et le mettre dans une boîte de 16 millimètres Petri rempli de cinq millilitres de solution enzymatique et l’emmener à un pied de biosécurité. Retirer délicatement les atrions et les tissus adipeux supplémentaires. Hacher le cœur en morceaux définis à l’aide de forceps.
Prenez une pipette Pasteur stérile et coupez sa pointe à 45 degrés. Utilisez la pipette Pasteur pour briser le tissu cardiaque en faisant de doux tuyaux de haut en bas. La digestion optimale fournit une suspension des cardiomyocytes unicellulaires après cela ajouter cinq millilitres de solution d’arrêt pour arrêter l’activité enzymatique pour éviter la sur digestion, Prendre un premier tube conique de 50 millilitres et placer une passoire stérile de cellules d’une centaine de microns sur elle.
Passez la suspension cardiomyocyte à travers la passoire cellulaire pour enlever tous les gros morceaux de tissu. Enfin laver la passoire avec la solution d’arrêt pour recueillir tous les restes de cardiomyocyte attachés. Centrifuger la suspension cellulaire à 20 GS pendant trois minutes et jeter le supernatant.
Suspendre à nouveau les cardiomyocytes et 10 millilitres de solution d’arrêt, à intervalles de trois minutes à 10 microlitres de solution de chlorure de calcium de 100 millimaux quatre fois et mélanger. Après la centrifugeuse quatrième édition, les cardiomyocytes nt suspendus à 20 GS pendant trois minutes et jettent le supernatant. Suspendre à nouveau les cardiomyocytes dans les supports de culture Pré plaquer les cellules dans un plat de 60 millimètres et mettre dans l’incubateur de CO2 pendant deux à trois heures.
Dans deux à trois heures. Les principaux types de cellules contaminantes comme les explosions de fibres seront respectés au service du plat, permettant un isolement pur des cardiomyocytes. Après cela, sortez le plat de l’incubateur et recueillez les cardiomyocytes flottants dans un tube conique et rejouez les cardiomyocytes dans une plaque de culture de 24 puits recouverte de laminine.
Quatre à six heures suffisent pour que les cardiomyocytes adhèrent à la surface. Ainsi, la transfection pourrait être effectuée à six heures après le placage. Le réaccent de transfection IMAX d’ARN a été employé pour transplanter des cardiomyocytes avec des siRNAs.
Le média de culture contient 25 micromolaires de sang Staten complété par 10%FBS, que nous avons trouvé est mieux adapté pour effectuer la culture cardiomyocyte à long terme et induire l’analyse de prolifération. Après la transfection, vous pouvez visualiser les cardiomyocytes par microscopie à l’aide d’un micro-incubateur pour savoir comment sont les cellules pour l’imagerie en accéléré. Ce sont des images brillantes de cardiomyocytes transfectés en forme de tige à grossissement faible et élevé.
Ici, vous pouvez voir l’imagerie de jour en jour, qui met en valeur les changements dans la morphologie cardiomyocyte souris adulte. Nous confirmons que les cardiomyocytes sont sains et contractiles aux points tôt de temps, aussi bien qu’après la différenciation de D et la culture à long terme. Voici un exemple de coloration immunofluorescente Ki67 démontrant la prolifération induite des cardiomyocytes adultes dans la culture après siARN, une transfection.
Comme vous pouvez le voir sur les résultats en utilisant cette technique, on peut obtenir des cardiomyocytes adultes en bonne santé de la souris et le rat et les culture pour l’étude à long terme. En conclusion, une fois maîtrisée, cette technique nous permettra d’étudier les cardiomyocytes bien au-delà des protocoles de culture actuels.
