Les auteurs tiennent à remercier l&#39;assistance technique de C. Zambataro pendant le tournage de ce protocole. Nous remercions chaleureusement le soutien de la Fondation Glenn pour la recherche médicale (SM), la fondation Hillblom, et le National Institutes of Health pour un prix de Nathan Centre Choc (P30AG025708) et PO1AG025901. JMF a été soutenue par T32AG000266 décerné à l&#39;Institut Buck pour la recherche sur le vieillissement.

<ol>
	<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst.">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li><li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li><li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR.">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse.">The Anatomy of the Laboratory Mouse.</a> Informatics. , (1965).</li><li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aorta.">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li><li>St&#229;hlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling:+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations.">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li><li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li><li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart.">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li><li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature,+nurture,+or+chance:+stochastic+gene+expression+and+its+consequences.">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li><li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Accès libre et la production de cette de cet article est sponsorisé Sigma-Aldrich.</p

Cette méthode a la possibilité de générer des cardiomyocytes pour un certain nombre de fonctions ainsi que les études d&#39;expression génique. L&#39;examen des cellules individuelles est une région en plein essor dans l&#39;analyse de l&#39;expression génique. L&#39;avantage de l&#39;examen de niveau transcriptionnel au niveau de la cellule unique est qu&#39;il permet l&#39;examen d&#39;une population cellulaire pure, qui n&#39;est pas possible à partir des préparations de tissus ensemble. De plus, l&#39;analyse seule cellule permet à l&#39;examen de la variation stochastique des taux d&#39;ARNm dans des cellules individuelles pour définir les populations de cellules qui étaient auparavant considérés comme homogènes 8,9. En plus d&#39;identifier les gènes qui sont potentiellement stochastique dans leur expression des gènes 10,11,12, la méthode permet aussi l&#39;identification des populations de cellules rares définies par leurs profils d&#39;expression génique. Bien que cette méthode fournit un certain nombre de passionnantes utilisations potentielles dans l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes, il ya des some mises en garde et considérations dans l&#39;utilisation des cellules individuelles. La principale limitation à l&#39;analyse unicellulaire, est la collecte de suffisamment de cellules dans l&#39;expérience pour atteindre une signification statistique en ce qui concerne la métrique d&#39;intérêt, de la variance par exemple. Dans le cas où le nombre de cellules isolées à partir du tissu d&#39;intérêt n&#39;est pas une limitation, on peut examiner des centaines de cellules par groupe, en utilisant des approches telles que séquençage de nouvelle génération, ou des tableaux nanofluidique. Toutefois, dans certains cas, il peut y avoir des difficultés à obtenir suffisamment de cellules du tissu d&#39;intérêt. Cela peut être en partie causée par le temps des procédures idiosyncratiques intensif pour la collection du type de cellules ciblées. Cependant, une planification minutieuse et la préparation avant de procéder à la collecte seule cellule peut encore permettre une analyse rigoureuse de cellule unique avec une erreur technique limitée. Lorsque l&#39;on examine les résultats, il doit être considéré que, même si cette procédure pour isoler les cellules a été utilisé dans de nombreux Studies (y compris la microscopie, l&#39;électrophysiologie, etc), l&#39;isolement se pourrait potentiellement effet l&#39;expression des gènes. Comme avec n&#39;importe quelle méthode qui manipule des échantillons biologiques, les résultats de vos résultats devraient être soigneusement validé pour garantir l&#39;expression cellule unique est représentatif du tissu lui-même et un biais non pas technique. Des méthodes telles que l&#39;hybridation in situ peut s&#39;avérer utile de vérifier ces résultats dans le tissu intact. Enfin, il est essentiel de s&#39;assurer que les données générées sont soigneusement vérifiées pour le contrôle qualité. Les données présentées dans la figure 8 montre que les dosages qPCR peut être très robustes dans leur spécificité, comme test n ° 13 (A13) ou ont un niveau élevé de variabilité qui peut conduire à la variance techniques telles que le dosage n ° 34 (A34).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide pyruvique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 monobasique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Protéase, type XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collaoxygénase, Type I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon 1x suspension l&#39;ADN (10 mM Tris, pH 8,0, EDTA 0,1 mM) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital sodique </td><td> Henry Schein Vet. * Alimentation </td><td> Contacter avec le fournisseur pour commander </td><td> * Doit être procuré par un vétérinaire ou un laboratoire animalier professionnel </td></tr><tr><td> IT ExoSAP </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x Mix Rxn </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> SuperScript III Platinum Taq Mix RT </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> Mélange d&#39;amorces de RT-STA </td><td> IDT </td><td> Personnalisé </td><td></td></tr><tr><td> Nucléase l&#39;eau libre </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> Kit QIAquick PCR Purification </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrophotomètre NanoDrop </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer DNA kit 7500 </td><td> Agilent </td><td> 7500 Kit </td><td></td></tr><tr><td> Un kit de marquage couleur </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus musculus 12x135k array </td><td> Roche-NimbleGen </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Scanner </td><td> Molecular Devices </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> Transplex Complete kit complet d&#39;amplification du transcriptome (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes

Alors que de nombreuses études ont examiné les changements d&#39;expression génique à partir des homogénats de tissu cardiaque, ce qui empêche l&#39;étude de la variation stochastique inhérente entre les cellules dans un tissu. L&#39;isolement des populations pures cardiomyocyte à travers une perfusion de collagénase des cœurs de souris facilite la génération de puces à cellule unique pour l&#39;expression génique toute transcriptome, ou qPCR d&#39;objectifs spécifiques en utilisant des tableaux nanofluidique. Nous décrivons ici une procédure pour examiner les profils de simples cellules d&#39;expression génétique des cardiomyocytes isolés du coeur. Ce paradigme permet l&#39;évaluation des mesures d&#39;intérêt qui ne sont pas dépendants de la moyenne (par exemple pour la variance entre les cellules dans un tissu) qui n&#39;est pas possible lors de l&#39;utilisation traditionnelle des workflows tissu entier pour l&#39;évaluation de l&#39;expression génique (figure 1). Nous avons réalisé l&#39;amplification robuste du transcriptome des cellules microgrammes seule cession d&#39;ADNc double brin qui facilite l&#39;utilisation de puces sur les iertaines cellules. Dans la procédure que nous décrivons l&#39;utilisation de tableaux de NimbleGen, qui ont été sélectionnés pour leur facilité d&#39;utilisation et de possibilité de personnaliser leur conception. Alternativement, une transcriptase inverse - amplification de la cible spécifiques (RT-STA) de réaction, permet de qPCR de centaines de cibles en nanofluidique PCR. En utilisant une de ces approches, il est possible d&#39;examiner la variabilité d&#39;expression entre les cellules, ainsi que l&#39;examen des profils d&#39;expression de types de cellules rares à partir d&#39;un tissu. Globalement, l&#39;approche cellule unique permet l&#39;expression des gènes à la génération de données qui peuvent permettre de définir des profils d&#39;expression idiosyncrasique qui sont généralement en moyenne à l&#39;examen d&#39;expression de millions de cellules à partir d&#39;homogénats typiques générés à partir des tissus ensemble.

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Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Simple cellule de profilage de l&#39;expression génique permet l&#39;analyse détaillée d&#39;expression des cellules individuelles. Nous décrivons des méthodes pour l&#39;isolement des cardiomyocytes, et la préparation des lysats résultant soit pour tout ou biopuces transcriptome qPCR d&#39;objectifs spécifiques.

Profilage Single Cell transcriptionnelle des cardiomyocytes de souris adultes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

single-cell-transcriptional-profiling-of-adult-mouse-cardiomyocytes

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Biology

17.2K vues.  Buck Institute for Research on Aging. Simple cellule de profilage de l'expression génique permet l'analyse détaillée d'expression des cellules individuelles. Nous décrivons des méthodes pour l'isolement des cardiomyocytes, et la préparation des lysats résultant soit pour tout ou biopuces transcriptome qPCR d'objectifs spécifiques.