Nous sommes reconnaissants envers le professeur émérite Jean-Claude Perriard et Evelyn Perriard (Institut fédéral suisse de technologie, Suisse) pour l&#39;introduction dans les techniques d&#39;isolation pour rat nouveau-né et les cardiomyocytes de souris. Nous tenons à remercier le professeur Chen Ju et le professeur Sylvia Evans (UCSD, USA) pour leur soutien. Le travail dans le laboratoire de l&#39;EE a été financé par une subvention d&#39;établissement de la MRC de carrière. SL est soutenu par une voie K99/R00 à l&#39;octroi de l&#39;indépendance du NIH / NHLBI (HL107744). TMM a été soutenue par une bourse de recherche postdoctorale de l&#39;American Heart Association (11POST7310066).

La procédure qui suit décrit un protocole de 16,17 à deux jours pour l&#39;isolement et la culture des cardiomyocytes de souris néonatales. Toutes les solutions sont stériles ou stérilisées par filtration. Tous les outils sont stérilisés par stérilisation de surface avec 75% d&#39;éthanol. À l&#39;exception de l&#39;extraction initiale du tissu, toutes les étapes sont réalisées dans une cellule à flux laminaire culture hotte stérile. Ce protocole est destiné à l&#39;isolation des coeurs de souris néonatales une à deux litière (s) - environ 5-14 chiots, mais peut être adapté pour les grandes tailles de litière et rat cardiomyocytes néonataux. l&#39;utilisation des médias de l&#39;échelle / enzyme, le cas échéant. Pour les travaux de rongeurs nouveau-nés, reportez-vous à vos directives et les règles de l&#39;université locale énoncées par les programmes de protection des animaux législatif et / ou, et adhérer à votre protocole animale institutionnel approuvé. Toutes les méthodes décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle UC San Diego (IACUC), et adhérer à federal et règlements étatiques. Jour 1. Une. Isolation du tissu cardiaque de souris néonatale <ol><li> Préparer 50 ml de 1 x PBS (sans Ca 2 +, Mg 2 +) supplémenté avec 20 mM BDM 6-8, et à disperser en deux plats bactériennes stériles placés sur de la glace. </li><li> Préparer 10 ml de milieu d&#39;isolement dans 50 ml de tubes de Falcon conique stérile. Gardez toutes les solutions sur la glace. Stériliser ciseaux (une courbe; une droite), et des pinces (courbes, Dumont n ° 7). </li><li> Souris nouveau-nées âgées de 1-3 jours sont rincées rapidement dans une solution d&#39;éthanol à 75% pour la stérilisation de la surface. Les chiots sont décapités à l&#39;aide de ciseaux stériles (de droite), et le coffre est ouvert le long du sternum pour permettre l&#39;accès à la cavité de la poitrine et le cœur (figure 1A, film supplémentaire S1). Commentaire technique: souris néonatales de plus de 3 jours peut être utilisé, mais le résultat en moins de cellules viables 2. </li><li> Les coeurs sont extraites dele corps avec des ciseaux courbes et transféré immédiatement dans la capsule bactérienne contenant 1 x PBS (sans Ca 2 +, Mg 2 +) avec 20 mM BDM, sur de la glace. Toutes les étapes suivantes sont effectuées sous la hotte de culture cellulaire stérile. </li><li> Retirer le tissu pulmonaire, les grands navires (et oreillettes, si vous le souhaitez). Coeurs lavage dans la solution PBS 1x (sans Ca 2 +, Mg 2 +) mM BDM 20 (sur la glace) pour enlever le sang. Transfert lavé cœur du premier plat dans le second plat bactérienne contient 1x PBS (sans Ca 2 +, Mg 2 +) mM BDM 20 (sur la glace) en utilisant une pince ou une cuillère perforée (figure 1B). </li><li> Transfert nettoyé / lavé coeurs dans une goutte de milieu d&#39;isolement (environ 250 pi; figure 1C) dans un troisième plat bactérienne (sur la glace) et utiliser les ciseaux courbes pour hacher coeurs en petits morceaux (environ 0,5-1 mm 3, ou plus petites; Figure 1D, 1E). </li><li> Transfert coeurs hachées dans une coniquetube contenant 10 ml de milieu d&#39;isolement (sur de la glace), et incuber sous agitation douce à 4 ° C pendant une nuit. </li></ol> Jour 2. 2. Tissue digestion enzymatique et placage de cellules <ol><li> Peser 15 mg de mélange collagénase / dispase (Roche), et dissoudre le mélange d&#39;enzymes dans 10 ml L15-5 milieu supplémenté avec 20 mM BDM (milieu de digestion). Filtre stérile du milieu de digestion dans la hotte de culture cellulaire dans un nouveau 50 ml tube Falcon stérile. </li><li> Préparer 30 ml de milieu L-15 supplémenté avec 20 mM BDM, et moyen de placage. </li><li> Manteau de plaques de culture cellulaire avec une solution de collagène (Sigma C-8919) pour un minimum de 1 heure. Retirer la solution de collagène (peut être réutilisé) et revêtues de collagène plats de culture cellulaire sec en écoulement laminaire stérile hotte de culture cellulaire. </li><li> Retirer le tube conique contenant le cœur prédigéré de 4 ° C. fragments de tissus doivent être regroupées (figure 1G). Laissez les fragments de tissus coulentle fond du tube et retirer le surnageant (assurez-vous de ne pas perdre des fragments de tissus;. normalement, environ 1 ml de milieu d&#39;isolement peuvent rester dans le tube). Ajouter 5 ml de milieu de digestion et de 5 ml de L-15 supplémenté avec 20 mM BDM de fragments de tissus et de suspension à l&#39;aide de composés oxygénés de l&#39;oxygène ou de l&#39;air pendant 1 min. </li><li> Transférer le tube conique scellée contenant les fragments de tissus cardiaques dans du milieu de digestion à 37 ° C bain d&#39;eau pendant environ 2 min pour ajuster la température de la solution de digestion. </li><li> Incuber des fragments de tissus cardiaques à 37 ° C avec agitation douce pendant 20-30 min (par exemple agitateur à 37 ° C, mis à pas plus de 60rpm). temps de digestion peuvent dépendre fortement de mélange d&#39;enzymes et le numéro de lot. Attention: les périodes d&#39;incubation plus longues ou des concentrations d&#39;enzymes plus élevées peuvent réduire la viabilité cellulaire. </li></ol> Commentaire technique: Nous recommandons l&#39;utilisation d&#39;un mélange de collagénase / dispase de Roche (Cat.No.: 10269638001) qui a très peu de variabilité de lot à lot. L&#39;enzyme classique pour l&#39;isolement des cardiomyocytes de souris est la trypsine et / ou de la collagénase de type II 3,16-20 disponible auprès de Worthington (Cat n ° CLS-2). Cependant, les performances de la collagénase II pourra différer sensiblement de lot à lot. Worthington permet généralement à l&#39;essai de plusieurs lots collagénase d&#39;optimiser les temps de digestion enzymatique et l&#39;utilisation. Sinon, Worthington vend un kit d&#39;isolement des cardiomyocytes avec un mélange d&#39;enzymes pré-testé inclus qui peuvent être adaptés pour l&#39;isolement des cardiomyocytes de souris 17 (Cat n °: NCIS). <ol start="7"><li> Placez cellule-filtre stérile (40-100 um de maille de nylon) en frais stériles de 50 ml tube conique faucon. Tamis cellulaire pré-humide avec 5 ml de L-15 complété par mM BDM 20. Fragments de tissus délicatement triturer l&#39;aide d&#39;un pré-mouillé 10 ml de culture cellulaire pipette pour environ 10-20 fois. Les fragments de tissus devraient principalement disperser au cours de cette étape, la libération des cellules en suspension (figure 1H). </li><li> Laissez fragments de tissus plus grands sédiments et surnageant de transfert contenant des cellules en suspension dans le tube conique frais à travers la cellule-filtre (figure 1I). </li><li> Re-suspendre les fragments de tissus digérés dans 5 ml de milieu de digestion et incuber pendant 5-10 min de plus un à 37 ° C avec agitation douce. </li><li> Après digestion continue de fragments de tissus restants, triturer doucement tissu pour 10-20 fois et ajouter aux cellules du tube contenant coniques de la première digérer par tamis cellulaire. Rincer la cellule-filtre avec 5 ml de L-15 supplémenté avec 20 mM BDM pour permettre le passage de toutes les cellules digérées. </li><li> Tube conique centrifugée contenant les cardiomyocytes en suspension pendant 5 min à 300 rpm (env. 50-100 xg). Eliminer le surnageant (contenant principalement des fibroblastes et des cellules endotheliales) et remettre en suspension culot cellulaire dans 10 ml de milieu de placage. </li><li> Cellules de la plaque dans 10 cm boîte de culture cellulaire (figure 2A) et incuber pendant 1-3 Heures en cellule incubateur de culture. Cette étape de pré-placage supprime les fibroblastes et les cellules endotheliales (Figure 2B), qui adhère à la boîte de culture cellulaire non revêtu (Figure 2C). </li><li> Après incubation, laver les cardiomyocytes non adhérentes à partir de 10 plat cm de culture (cellules remettre en suspension en pipetant à plusieurs reprises le milieu de plaquage sur le plat), et les cellules remises en suspension de transfert à un tube Falcon de centrifugation conique stérile (15 ml ou 50 ml). Facultatif: Répétez l&#39;étape de pré-dépôt de supprimer les fibroblastes supplémentaires de suspension cellulaire. Si on le souhaite, les cellules endothéliales et de fibroblastes adhérentes peuvent être ensuite mis en culture. </li><li> Compter les cellules (par exemple en utilisant Neubauer hématimètre, exclusion du bleu Trypan coloration 21). </li><li> cellules dans revêtues de collagène des boîtes de culture cellulaire avec une densité d&#39;environ 1,5 x 10 5 cellules par cm 2 (figure 2D plaque; voir également les commentaires au tableau 1 de placageet revêtement). Placez les plats dans la cellule incubateur de culture et laisser reposer pendant 12-18 heures pour permettre l&#39;adhésion et la diffusion des cardiomyocytes. </li></ol> Jour 3 - Culture des cardiomyocytes néonataux <ol><li> Préparer un milieu d&#39;entretien et préchauffer à 37 ° C bain d&#39;eau. Reportez-vous au tableau 1 pour l&#39;addition d&#39;inhibiteurs de prolifération ou agents chronotropes, ou la procédure pour la transfection liposomale de cardiomyocytes de souris néonatales. </li><li> Un jour après l&#39;étalement, cardiomyocytes auraient adhéré à la boîte de culture cellulaire et de façon optimale commencer spontanément à se contracter (figure 2E, 2F; supplémentaire Film S2; reportez-vous au tableau 2 pour des problèmes communs au cours de la procédure d&#39;isolement / culture). Remplacer milieu d&#39;étalement avec le milieu de la maintenance et de la culture pour d&#39;autres 1-5 jours. Changer le milieu comme nécessaire. </li></ol>

L&#39;utilisation de modèles animaux pour étudier les maladies cardiaques est devenu un standard dans la recherche cardiovasculaire. La caractérisation biochimique rapprocher de ces modèles (c.-à étudier les réponses directes des cellules cardiaques à des stimuli biochimiques ou biomécaniques) nécessite généralement l&#39;isolement des tissus cardiaques ou cardiomyocytes. Les études portant sur ​​les réactions physiologiques du cœur ex vivo (par exemple à l&#39;acétylcholine 4...

Les premiers rapports de la dissociation de succès et de la culture de cellules cardiaques de rongeurs remonte au 1960 1,2. Même alors, Harary et Farley ont remarqué que des cardiomyocytes cultivés &quot;peuvent fournir un système unique pour l&#39;étude des exigences de la contractilité périodique [, et peuvent] fournir un moyen de déterminer la contribution des différentes voies métaboliques pour la [battre] processus». Bien Harary et Farley cardiomyocytes isolés et cultivés de jeunes rats, et le protocole original a été adapté et modifié par de nombreux scientifiques au cours des années, l&#39;isolement et la culture procédure générale n&#39;a pas beaucoup changé. Cependant, l&#39;amélioration des enzymes, des solutions standardisées 3 4,5, et l&#39;addition de la chaîne et un inhibiteur réversible de la myosine ATPase BDM à protéger les cellules au cours de la procédure d&#39;isolement 6-9 a considérablement amélioré le rendement de cellules et la viabilité. Adulte vs cardiomyo néonatalecytes Cardiomyocytes isolés et cultivés à partir de souris ou de rats nouveau-nés ont plusieurs avantages par rapport à des cultures de cardiomyocytes adultes. Tout d&#39;abord, la procédure d&#39;isolement de rat ou de souris néonatales coeurs est plus facile et moins coûteux, par rapport à l&#39;isolement des cardiomyocytes à partir de souris ou de rat adulte 10. Cardiomyocytes néonataux sont beaucoup moins sensibles à la réintroduction dans un milieu contenant du calcium après dissociation, augmentant considérablement cellule rendement. Un autre grand avantage est que les cardiomyocytes de souris néonatales subissent une dédifférenciation plus rapide - cycle de redifférenciation qui se traduit généralement par battant spontanément cellules 20 heures après l&#39;étalement, tout en cardiomyocytes adultes ont généralement besoin de stimulation pour induire la contraction. Cardiomyocytes néonataux sont également plus facilement transfectable avec des méthodes de transfection liposomale, alors que les cardiomyocytes adultes exigent des vecteurs viraux pour la livraison réussie de l&#39;ADN transgénique. Contrairement aux cardiomyocytes néonatauxs, la culture de cardiomyocytes de rongeurs adultes de 11 à 13 permet à des investigations de la dégradation myofibrillaire et rétablissement éventuel de l&#39;appareil contractile. Ces changements morphologiques caractéristiques de cardiomyocytes adultes se produisent sur des périodes de 1-2 semaines. La dédifférenciation - cycle de re-différenciation s&#39;accompagne de réexpression du programme de gène foetal, mimant ainsi les changements pathologiques observées dans les cardiomyopathies humaines 14. Un autre avantage de cardiomyocytes de rats adultes de plus la culture de cardiomyocytes néonataux est la capacité de la culture de ces cellules pendant de longues périodes de temps. Rat vs cardiomyocytes de souris L&#39;isolement et la culture des cardiomyocytes néonataux de rat a quelques avantages par rapport à celle des cardiomyocytes néonataux de souris, y compris des rendements plus élevés de cellules viables et une augmentation des taux de transfection. Cependant, la large utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées pour les maladies cardiaques (par exemple &lt;/ Em&gt; la lim de protéines musculaires souris knock-out comme modèle pour la cardiomyopathie dilatée 15) a conduit à l&#39;adaptation de la procédure d&#39;isolement pour les cardiomyocytes dérivés de souris néonatales. Bien que les protocoles utilisés pour isoler des cardiomyocytes de rat et de souris néonatales sont presque identiques, plus il faut prendre soin dans le choix d&#39;un mélange d&#39;enzyme approprié pour celui-ci. En effet, les cardiomyocytes de souris néonatales sont généralement plus sensibles à une digestion excessive, résultant dans une cellule-rendement et la viabilité réduite. En outre, la densité de placage doit être ajusté, cardiomyocytes, car dérivées de souris néonatale sont un peu plus petite par rapport à des cellules dérivées de coeurs de rats nouveau-nés. Avec beaucoup d&#39;utilisations pour l&#39;enquête de paramètres morphologiques, électrophysiologiques, biochimiques, cellulaires biologiques et biomécaniques ainsi que pour le processus de myofibrillogenesis, cardiomyocytes néonataux de culture sont devenus l&#39;un des systèmes les plus polyvalents pour l&#39;étude deles fonctions des cellules cardiaques in vitro. Toutefois, la première étape d&#39;un essai réussi dépend d&#39;une méthodologie simple et fiable pour isoler les cardiomyocytes de souris néonatales. Notre protocole tire sa méthodologie de nombreuses sources et a été optimisée pour la reproductibilité et la robustesse. Nous discutons des facteurs qui influent sur cardiomyocytes rendement et la viabilité, et offrons une variété d&#39;options pour l&#39;optimisation des conditions d&#39;isolement et de culture.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0753</td>
			<td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 &deg;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II3</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>e,g, cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank's balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-199</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-030-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-155</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-045-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6126</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-6501</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% collagen solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8919</td>
			<td>extracellular matrix for coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td>alternative to Sigma collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td>appropriate filter size:40 &mu;m-100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2 &mu;m</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>for sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight scissors</td>
			<td>e.g. Fine Sciences Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved scissors</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91461-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 7 forceps</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated spoon</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td>optional, for transfer of heart tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>e.g. Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>live cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>e.g. Prosource Scientific</td>
			<td>3500</td>
			<td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>14-432-23</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringe</td>
			<td>e.g. BD Medical</td>
			<td>14-820-19</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml serological pipette</td>
			<td>e.g. Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>for standard culture of cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>for live cell imaging with inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>172958</td>
			<td>for preplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escort III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3037</td>
			<td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td>substitute for Escort III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers and media: 
			<ul>
				<li>Isolation medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				0.0125% trypsin 
				in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)</li>
				<li>Digestion medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix 
				in L15 medium</li>
				<li>Plating medium 
				65% DMEM high glucose 
				19% M-199 
				10% horse serum 
				5% fetal calf serum 
				1% penicillin/streptomycin</li>
				<li>Maintenance medium 
				78% DMEM high glucose 
				17% M-199 
				4% horse serum 
				1% penicillin/streptomycin 
				optional: 
				1 &mu;M AraC 
				1 &mu;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine</li>
			</ul>
			The plating and maintenance medium can be stored at 4 &deg;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

Cardiomyocytes néonataux en culture ont longtemps été utilisés pour étudier myofibrillogenesis et fonctions myofibrillaires. Cardiomyocytes cultivés permettent d&#39;enquête facile et la manipulation des voies biochimiques, et leur effet sur les propriétés biomécaniques de battre cardiomyocytes spontanément. Le protocole 2 jours suivant décrit l&#39;isolement et la culture de cardiomyocytes de souris néonatales. Nous montrons comment disséquer facilement cœur de nouveau-nés, dissocier le tissu cardiaque et d&#39;enrichir les cardiomyocytes de la cellule-population cardiaque. Nous discutons de l&#39;utilisation de différents mélanges d&#39;enzymes pour dissociation des cellules, et leurs effets sur les cellules-viabilité. Les cardiomyocytes isolés peuvent ensuite être utilisés pour une variété d&#39;analyses morphologiques, biochimiques, électrophysiologiques de cellules biologiques ou biomécanique. Nous avons optimisé le protocole pour la robustesse et la reproductibilité, en utilisant des solutions seulement disponibles dans le commerce et l&#39;enzyme mélanges que show peu de variabilité de lot à lot. Nous abordons également les problèmes courants liés à l&#39;isolement et la culture des cardiomyocytes, et offrons une variété d&#39;options pour l&#39;optimisation des conditions d&#39;isolement et de culture.

En utilisant ce protocole, nous avons isolé les cœurs de 8 âge d&#39;un jour souriceaux nouveau-nés (figures 1A, 1B, film supplémentaire S1). Après lavage et hacher les coeurs avec des ciseaux (figures 1C-1F), des fragments de tissus ont été prédigérés en milieu d&#39;isolement pendant une nuit à 4 ° C sous agitation douce. À la suite de prédigestion (Figure 1G), on a transféré les fragments de tissus fraîchement préparé en milieu de digestion, et on...

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Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultures de cardiomyocytes de souris primaires sont un des outils les pivots de l&#39;enquête de l&#39;organisation et de la fonction myofibrillaire. Le protocole suivant décrit l&#39;isolement et la culture des cardiomyocytes primaires de coeurs de souris néonatales. Les cultures de cardiomyocytes résultants peuvent être ensuite utilisés pour une variété de tests biomécaniques, biochimiques et cellulaires biologiques.

Isolement et culture de cardiomyocytes de souris néonatales

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

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Research

JoVE Journal

Biology

62.0K vues.  King’s College London.  Cultures de cardiomyocytes de souris primaires sont un des outils les pivots de l'enquête de l'organisation et de la fonction myofibrillaire. Le protocole suivant décrit l'isolement et la culture des cardiomyocytes primaires de coeurs de souris néonatales. Les cultures de cardiomyocytes résultants peuvent être ensuite utilisés pour une variété de tests biomécaniques, biochimiques et cellulaires biologiques. 

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Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Recherche

Biologie

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolement et enregistrements Chaîne Kv en cardiomyocytes murins auriculaire et ventriculaire

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes Cardiomyoctyes souris

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

L&#39;isolement et l&#39;analyse physiologique de cardiomyocytes de souris

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolement et culture de cardiomyocytes adultes de souris pour Signalisation cellulaire et<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrophie cardiaque

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolation des néonatale extrahépatique cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

L&#39;isolement, la culture et la transduction des adultes cardiomyocytes souris

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolation et culture des kératinocytes de la souris primaire de la peau de souris néonatale et adulte

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...