Nous tenons à remercier les professeurs. Huibert Mansvelder et Bert Sakmann pour un large soutien, le Dr Marcel Oberlaender pour des discussions fructueuses et fournir traçage neuronal, et Brendan Lodder pour l&#39;assistance technique. Les données ont été acquises en utilisant la ntrode VI pour LabView, généreusement offert par R. Bruno (Columbia Univ., NY, USA). Cette recherche a été financée par la Société Max Planck et le Centre Bernstein for Computational Neuroscience, Tübingen (financé par le Ministère fédéral allemand de l&#39;Éducation et de la Recherche (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Centre pour Neurogenomics et la recherche cognitive (CNCR) , Neuroscience Campus Amsterdam (NCA), le financement de CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 et ENC-réseau # p3-c3) et l&#39;Université VU d&#39;Amsterdam.

Une. Préparation de l&#39;animal Toutes les procédures expérimentales sont menées en conformité avec la loi néerlandaise et après évaluation par un comité d&#39;éthique local à l&#39;Université VU d&#39;Amsterdam, aux Pays-Bas. <ol><li> Anesthésier un rat Wistar (P25-P45, ♂ / ♀) avec de l&#39;isoflurane (2-3% dans de l&#39;oxygène) et ensuite avec de l&#39;uréthane (20% dans 0,9% de NaCl, 1.6 à 1.7 g / kg) par injection intrapéritonéale. Évaluer la profondeur de l&#39;anesthésie en surveillant pincée retrait, les réflexes des paupières, et les mouvements vibrisses. </li><li> Administrer une dose supplémentaire d&#39;uréthane (10% de la dose initiale) dans le cas où l&#39;animal ne parvient pas à la profondeur de l&#39;anesthésie suffisante ou lorsque des secousses vibrisses sont observées au cours de l&#39;expérience. </li><li> Placer l&#39;animal anesthésié sur le cadre stéréotaxique équipé d&#39;un patin chauffant, à insérer une sonde de température rectale et à maintenir la température du corps de l&#39;animal à 37,5 ± 0,5 ° C par une couverture chauffante. </li><li&gt; position de la tête de l&#39;animal dans le cadre stéréotaxique; couper les cheveux sur le dessus de la tête à l&#39;aide des ciseaux pour rendre la peau visible. </li><li> Injecter 100 ul de lidocaïne à 1% (dans du NaCl 0,9%), sous-cutanée pour l&#39;anesthésie locale au site d&#39;opération et d&#39;attendre 3 à 5 min. Retirez la peau qui recouvre la surface du crâne en coupant dans le sens caudal à rostral et nettoyer le tissu restant. </li><li> Nettoyez le crâne largement avec 0,9% de NaCl et tampons absorbants. </li><li> Déterminer les coordonnées de la zone cible sur l&#39;hémisphère gauche (pour cortex somatosensoriel primaire (S1): 2,5 mm et 5,5 mm postérieur au bregma latéral). Marquez l&#39;emplacement sur le crâne avec un marqueur de la peau chirurgicale. </li><li> Racler l&#39;os doucement par une fraise dentaire à partir de la région d&#39;intérêt jusqu&#39;à ce que l&#39;os devient transparent et les vaisseaux sanguins sont clairement visibles. </li><li> Ajouter un 0,5 mm x 0,5 mm craniotomie par découpage d&#39;une fenêtre dans le crâne amincie avec un scalpel (n ° 11), en évitant d&#39;endommager la dure-mèreet les vaisseaux sanguins. En option: marquer les bords de la craniotomie en utilisant un marqueur de la peau chirurgicale pour améliorer la visibilité. </li><li> Appliquez une fine couche de colle sur le crâne sec et ciment dentaire pour construire une salle de bain (c&#39;est à dire de la chambre d&#39;enregistrement) entourant la craniotomie. </li><li> Coupez les moustaches du côté controlatéral à exactement 5 mm du follicule moustache. Facultatif: mettre en évidence les moustaches taillées avec mascara noir. </li></ol> 2. Juxtasomal Recordings et Biocytin étiquetage <ol><li> Assurez-pipettes de patch du verre borosilicate avec un diamètre de pointe à l&#39;intérieur de ~ 1 pm pour obtenir électrodes avec 3-5 résistance de MQ. Remarque: La morphologie de la pipette idéal pour l&#39;enregistrement de juxtasomal est un cône progressif mince, un angle de cône faible, et un ~ 1 um bout (figure 1). </li><li> En fonction de la profondeur d&#39;enregistrement (par rapport à la surface de la pie-mère), les dimensions de cône de l&#39;électrode d&#39;enregistrement doivent être ajustées. Critique important est que til cône diamètre doit être inférieure à 75 pm au point d&#39;entrée dans le cerveau pour éviter les dommages mécaniques ou de stress à la zone d&#39;enregistrement. Ceci indique que, pour des enregistrements corticales superficielles, un cône de 300 à 500 um avec un diamètre extérieur d&#39;au maximum 75 um est nécessaire (figure 1A), alors que les enregistrements de couches corticales relativement profonds nécessitent une conicité plus de 1,500-1,800 pm, de nouveau avec extérieur maximal diamètre de 75 pm (1,800 um à partir de la pointe d&#39;électrode). </li><li> Chargez la pipette de patch avec la sonnerie de rat normal (IRB) additionné de 2% biocytine (voir le tableau 1 pour les solutions et réactifs) et monter la pipette de patch sur une scène de tête fixé à un micromanipulateur. </li><li> Régler l&#39;angle du support d&#39;électrode à 34 ° par rapport au plan sagittal de cibler spécifiquement la colonne D2 de rat S1. </li><li> Connectez le stade de la tête à un amplificateur à pont-mode (c.-à-pince de courant). </li><li> Placez le patchpipette à proximité de la craniotomie. Remplir la baignoire avec 0,9% de NaCl et de déterminer la résistance de l&#39;électrode qui doit être comprise entre 3-5 MQ, évalués en appliquant une impulsion carrée avec injection de courant positif (1 nA, 200 ms on / off). </li><li> Établir surpression de 100-150 mbar et faire progresser la pipette de patch dans une um étapes tout en appliquant un courant positif impulsions carrées (1 nA, 200 ms on / off). Suivre l&#39;évolution de la résistance solide à établir le contact avec la dure-mère. À ce stade, de définir les coordonnées du micromanipulateur à «zéro» pour permettre des mesures précises de profondeur. </li><li> Avancez dans 1 um étape-mode jusqu&#39;à ce que la pipette de patch pénètre la dure-mère indiquée par une chute soudaine de la résistance de l&#39;électrode. Retirer la pression de maintien de la pipette. </li><li> Rechercher des unités simples tout en avançant dans une um étapes. Surveillance de la résistance de l&#39;électrode en continu en appliquant 200 ms on / off impulsions. Une augmentation de la résistance électrode typicallié indique la proximité d&#39;un seul neurone. Avancez jusqu&#39;à ce que l&#39;électrode potentiel d&#39;action positive (AP) des formes d&#39;onde de ~ 2 mV sont enregistrées (Figures 2A et 2B). </li><li> Facultatif: Enregistrez le modèle de dopage spontanée du neurone et déterminer moustache évoqués dopage, par exemple, de déviation caudale moustaches individuels pour 200 ms à un angle de 3,3 ° en utilisant un dispositif piézo-électrique 18. </li><li> Avancer l&#39;électrode jusqu&#39;à ce que la résistance est 25-35 MQ et les pointes ont des amplitudes de 3-8 mV pour obtenir des conditions optimales de remplissage de juxtasomal. Commencez le remplissage de juxtasomal en appliquant des impulsions carrées de courant positif (1 nA, 200 ms on / off). Lentement et progressivement augmenter le courant par pas de 0,1 nA tout en surveillant la forme d&#39;onde de l&#39;AP et de la fréquence (figures 2A et 2B). </li><li> Surveillance de l&#39;ouverture de la membrane comme une nette augmentation de la fréquence AP au cours de la sur-phase de l&#39;impulsion de bloc (figure 2C </strong&gt;). La forme d&#39;onde de pic pendant le remplissage montre une augmentation de la largeur et réduite après-hyperpolarisation (figures 2C et 2D). Paramètres supplémentaires comprennent une augmentation du bruit ou un petit (1-5 mV) négatif décalage DC. </li><li> Augmenter ou diminuer le courant (1 nA) pendant le remplissage afin de maintenir la perfusion de biocytine stable. Réduire ou d&#39;arrêter les impulsions de courant lors d&#39;une augmentation brusque de la fréquence AP pour éviter la toxicité par excès afflux d&#39;ions extracellulaires, tels que des ions sodium. Remarque: chaque neurone réagit différemment à l&#39;injection de courant et juxtasomal paramètres d&#39;étiquetage doivent être ajustés en fonction des conditions d&#39;enregistrement individuels. </li><li> Suivre de près le signal après l&#39;arrêt de l&#39;injection de courant. La forme d&#39;onde de pic après une séance de remplissage est généralement élargie et montre une forte réduction après hyperpolarisation. Attendre la récupération du neurone, ce qui est évident lorsque la forme d&#39;onde de transitoire revient à ses propriétés d&#39;origine (c&#39;est à dire la présence d&#39;normale après-hyperpolarisation, figure 2). </li><li> Répétez biocytine remplissage sessions après la récupération complète du neurone à augmenter la charge biocytine pour une meilleure qualité de la coloration. </li><li> Rétracter la pipette de patch par pas de 1 pm jusqu&#39;à ce que l&#39;amplitude de crête diminue pour réduire toute contrainte mécanique de la cellule. Attendez au moins 1 heure pour la biocytine à diffuser intracellulaire tout en surveillant étroitement la température du corps de l&#39;animal et de la respiration. </li></ol> 3. Perfusion de l&#39;animal et retrait du cerveau <ol><li> Préparer la mise en place de la perfusion, rincer, et précharger le tube avec 0,9% de NaCl. </li><li> Placez l&#39;animal sur un plateau chirurgical et fixer avec une bande d&#39;étiquetage standard. Assurer une profondeur suffisante de l&#39;anesthésie; pincée de pied et les réflexes des paupières doivent être absents. </li><li> Faire une incision dedans en dehors (5-6 cm) à travers la paroi abdominale juste en dessous de la cage thoracique et continuer en direction postéro-antérieure à exposer le sternum.Tirez le sternum en avant et bien séparer le foie de la membrane. </li><li> Faire une petite incision dans la membrane, couper à travers les côtes inférieures et continuer l&#39;incision le long de toute la longueur de la cavité abdominale pour exposer le coeur. </li><li> Retirez le péricarde. </li><li> Insérez l&#39;aiguille dans le ventricule gauche et faire une incision dans l&#39;oreillette droite. Perfuse avec du NaCl 0,9% (~ 8 ml / min) jusqu&#39;à ce que la décoloration du foie est terminée. </li><li> Mettez la perfusion à 4% de paraformaldéhyde (PFA) jusqu&#39;à ce que la rigidité de l&#39;avant patte et la mâchoire inférieure est apparente. </li><li> Décapite les rats en utilisant une paire de ciseaux </li><li> Retirez les muscles du cou restants et exposer le crâne complètement. </li><li> Positionner les ciseaux dans le tronc cérébral sur la face dorsale et couper l&#39;os avec soin le long de la suture sagittale, en maintenant la position dorsale. </li><li> Retirer les os de part et d&#39;autre de la suture sagittale pour exposer le cerveau en utilisant une pince. Retirez délicatement la durée pour éviter dAmage. </li><li> Insérez délicatement une spatule mousse à la face ventrale du cerveau et enlever délicatement le cerveau. </li><li> Post-fixer l&#39;ensemble de la nuit de cerveau en PFA à 4 ° C. Mettez le cerveau à 0,05 M de tampon phosphate (PB) et stocker à 4 ° C. </li></ol> 4. Couper en tranches le cerveau dans les sections tangentielles <ol><li> Prenez le cerveau de l&#39;0,05 M PB et le mettre sur un papier filtre face antérieure. Utilisez une lame de rasoir pour couper le cervelet dans le plan coronal et séparer les hémisphères en coupant le long du plan sagittal milieu. </li><li> Appliquer colle sur la plate-forme de montage et monter l&#39;hémisphère gauche de son plan sagittal avec antérieure vers la droite. Fixez la plate-forme de montage à un angle de 45 ° sur un vibratome et plonger le cerveau dans 0,05 M PB. </li><li> Fixer une lame de rasoir sur le vibratome et faire en sorte que le premier contact avec la surface du cerveau se trouve au milieu du plan antéro-postérieur de l&#39;hémisphère. Couper 24 100 umsections et les recueillir dans une plaque de 24 puits contenant 0,05 M de PB. </li></ol> 5. Procédures histologiques <ol><li> Effectuer des protocoles pour la coloration histologique cytochrome oxydase et 24 la biotine-peroxydase-avidine Procédé selon l&#39;une des méthodes 25 décrites précédemment. Facultatif: visualiser biocytine utilisant des conjugués fluorescents avidine / streptavidine-Alexa. Cela permet en outre double coloration avec des techniques de traçage rétrograde ou antérograde. </li><li> Laver les sections 5 x 5 min avec 0,05 M de PB et préparer le tétrachlorhydrate de 3, 3&#39;-diaminobenzidine (DAB) solution pour la coloration de la cytochrome oxydase pour visualiser les fûts dans la couche 4 (L4) de S1-contenant (voir le tableau 2 pour les solutions et réactifs). Incuber sections 6-12 de la pie dans la solution préchauffé pendant 30-45 min à 37 ° C. </li><li> Rincer les sections avec 0,05 M PB pour 6 x 5 min et éteindre l&#39;activité de la peroxydase endogène en incubant les sections dans 3% de H 2 </sub&gt; O 2 à 0,05 M de PB pendant 20 min à température ambiante (RT). </li><li> Rincer les sections avec 0,05 M PB pour 5 x 10 min. Incuber les coupes dans ABC-solution (voir le tableau 3 pour les solutions et réactifs) pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Rincer sections avec 0,05 M de PB à 5 x 10 min et préparer la solution-DAB pour visualiser le neurone de biocytine-remplie (voir tableau 4 pour les solutions et les réactifs). Incuber les coupes dans la solution filtrée pendant 45-60 min à température ambiante. </li><li> Rincer les sections avec 0,05 M PB pour 5 x 10 min. Sections de montage sur des lames de microscope et lamelles à l&#39;aide Mowiol (voir le tableau 5 pour des solutions et réactifs). </li><li> Déterminer la qualité de l&#39;étiquetage par microscopie optique. </li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+high-frequency+action+potential+spiking+in+the+prefrontal+cortex+of+awake+rats.">Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats.</a> Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).</li><li>Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmitted+light+brightfield+mosaic+microscopy+for+three-dimensional+tracing+of+single+neuron+morphology.">Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology.</a> J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).</li><li>Boudewijns, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+three-dimensional+reconstructions+of+individual+neurons+reveal+cell+type-specific+circuits+in+cortex.">Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex.</a> Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).</li><li>Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+experience+alters+specific+branches+of+individual+corticocortical+axons+during+development.">Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development.</a> J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).</li><li>Schubert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+without+disturbing:+how+different+cortical+neuron+classes+represent+tactile+stimuli.">Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli.</a> J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).</li><li>Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+electroporative+delivery+of+drugs+and+genes).">Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes).</a> Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).</li></ol>

Les authros n&#39;ont rien à divulguer.

La méthode de juxtasomal permet d&#39;enregistrer dans l&#39;action in vivo dopage potentiel des unités simples dans des conditions de comportement (anesthésiés, éveillé tête fixe ou mobile librement) avec l&#39;option de biocytine-étiquetage du neurone enregistré pour la classification post hoc de type cellulaire et / ou la reconstruction 3D. L&#39;avantage majeur est d&#39;obtenir des paramètres physiologiques de la configuration extracellulaire (donc non invasif), tout en étant c...

Les réseaux de neurones sont constitués de plusieurs types de cellules, caractérisé par les propriétés morphologiques et physiologiques très spécifiques 7.1. En conséquence, les types de cellules individuelles des tâches spécialisées à l&#39;intérieur du réseau (voir par exemple Gentet et al. 8 et Burgalossi et al. 9). Nous commençons seulement à comprendre les fonctions spécifiques de type cellulaire à travers les réseaux neuronaux et beaucoup reste à découvrir. A cette fin, de nombreux laboratoires mettent en œuvre des approches expérimentales qui permettent l&#39;analyse des propriétés morphologiques de la même population neuronale à partir de laquelle les paramètres physiologiques ont été obtenus 1,10-15. Ici, nous démontrons la technique de marquage de juxtasomal 16,17 qui implique des enregistrements électrophysiologiques en utilisant des pipettes de patch classiques dans la configuration extracellulaire (donc non invasif) en combinaison avec l&#39;électroporation du neurone enregistré avec biocytine. Laavantage majeur de cette approche est que la nature non invasive permet de s&#39;assurer que l&#39;action de dopage potentiel de neurones individuels est enregistrée sans modifier (par exemple, la dialyse), la teneur intracellulaire de la cellule. Suivi par électroporation, l&#39;approche de juxtasomal offre la possibilité d&#39;identification et de reconstruction post-hoc cellule de lier la fonction (physiologie) à la structure (morphologie). Typiquement, la reconstruction comprend la reconstruction morphologique de morphologie dendritique et axonale qui peut être étendue à la quantification de la colonne vertébrale et / ou des densités Bouton ou encore la reconstruction de la morphologie neuronale à une résolution nanométrique en utilisant la microscopie électronique. La technique d&#39;enregistrement de juxtasomal peut être utilisé pour des enregistrements in vivo de divers types de cellules à travers les couches corticales ou dans les zones sous-corticales dans une gamme d&#39;espèces, bien que la plupart des études ont appliqué la technique dans les petits rongeurs tels que les souris ou les rats. Notre recherche se concentre sur l&#39;enregistrement et l&#39;étiquetage des neuronesde rat primaire cortex somatosensoriel (S1) et implique l&#39;identification visuelle des neurones enregistrés 18, reconstructions dendritiques en combinaison avec un enregistrement précis dans un cadre de référence normalisé de désosser réseaux corticaux 4,19 et reconstruction détaillée de l&#39;architecture axonale à caractériser locale spécifique du type de cellule et projection à long terme cible 20. Par rapport à vivo des techniques alternatives dans d&#39;enregistrement (intracellulaires ou de cellules entières), les enregistrements juxtasomal sont relativement stables et peuvent donc être appliquées dans tous les États de comportement, y compris anesthésiés 21,22, sédation 14, éveillé animaux de la tête fixe 23, ou même librement mobiles 9 . Ici, nous montrons l&#39;étiquetage juxtasomal dans S1 d&#39;un rat d&#39;uréthane anesthésiés, mais nous insistons sur l&#39;applicabilité générale de cette technique à de nombreuses préparations de choix.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:224px;">SM-6 control system</td>
			<td style="width:275px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:224px;">LN- Mini 23 XYZ</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LN- Mini 55 Manipulatorblock X2</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Lynx-8 amplifier</td>
			<td style="width:275px;">Neuralynx</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Axoclamp-2B amplifier</td>
			<td style="width:275px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Osada model EXL-M40</td>
			<td style="width:275px;">Osada, inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Piezoelectric device</td>
			<td style="width:275px;">Physik Instrumente</td>
			<td style="width:119px;">PL140.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Labview</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Ntrode Virtual Instrument&#160;</td>
			<td>R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">(Labview acq. software)</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Sugi absorbent swabs</td>
			<td style="width:275px;">Kettenbach</td>
			<td style="width:119px;">30601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Cytochrome C from equine heart</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Catalase from bovine liver</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">DAB</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">H2O2</td>
			<td style="width:275px;">Boom</td>
			<td style="width:119px;">7047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Vectastain standard ABC-kit</td>
			<td style="width:275px;">Vector</td>
			<td style="width:119px;">PK6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Triton X100</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Urethane</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:275px;">Pharmachemie</td>
			<td style="width:119px;">45.112.110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Lidocaine</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L5647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Simplex rapid dental cement</td>
			<td style="width:275px;">Kemdent</td>
			<td>ACR308/ACR924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Biocytin</td>
			<td style="width:275px;">Molekula</td>
			<td style="width:119px;">36219518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">PFA</td>
			<td style="width:275px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">8187151000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Trizma base</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T4661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:275px;">Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Analytical grade glycerol</td>
			<td style="width:275px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">HEPES</td>
			<td style="width:275px;">Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">NaCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">KCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CaCl</td>
			<td style="width:275px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">22,350-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">MgCl2</td>
			<td style="width:275px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">63072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

juxtasomal biocytin labeling to study the structure-function relationship of individual cortical neurons

Le cortex cérébral est caractérisé par de multiples couches et de nombreux types cellulaires distincts qui, ensemble, en tant que réseau sont responsables de nombreuses fonctions cognitives supérieures, y compris la prise de décisions, le comportement sensori-guidée ou de la mémoire. Pour comprendre comment ces réseaux neuronaux complexes effectuer des tâches, une étape cruciale consiste à déterminer la fonction (ou l&#39;activité électrique) de types de cellules individuelles au sein du réseau, de préférence lorsque l&#39;animal exécute une tâche cognitive pertinente. En outre, il est également important de déterminer la structure anatomique du réseau et l&#39;architecture morphologique des neurones individuels pour permettre l&#39;ingénierie inverse du réseau cortical. Percées techniques disponibles aujourd&#39;hui permettent d&#39;enregistrer l&#39;activité cellulaire en éveil, se comporter animaux avec l&#39;option précieuse de post hoc identifier les neurones enregistrés. Ici, nous démontrons la technique de marquage juxtasomal de biocytine, qui implique l&#39;action d&#39;enregistrement potentiomètreal dopage dans le extracellulaire (ou loose-patch) configuration à l&#39;aide de pipettes de patch classiques. La configuration de l&#39;enregistrement de juxtasomal est relativement stable et applicables à l&#39;ensemble des conditions de comportement, y compris anesthésiés, sédation, éveillé tête fixe, et même dans l&#39;animal se déplacer librement. Ainsi, ce procédé permet d&#39;associer un type de cellule spécifique dopage potentiel d&#39;action au cours de comportement de l&#39;animal à la reconstruction des neurones individuels et finalement, l&#39;ensemble du microcircuit cortical. Dans cette vidéo, manuscrit, nous montrons comment les neurones individuels dans la configuration de juxtasomal peuvent être étiquetés avec biocytine chez le rat anesthésié uréthane pour l&#39;identification et la reconstruction post-hoc morphologique.

La connaissance détaillée de la structure 3D de neurones individuels est cruciale pour élucider les principes d&#39;organisation des réseaux de neurones. Notre méthode consiste à un pipeline pour atteindre la haute qualité de l&#39;étiquetage biocytine partir d&#39;une préparation in vivo, ce qui permet la classification neuronale après hoc et la reconstruction détaillée de l&#39;architecture dendritique et axonale des neurones isolés à haute résolution. En fonction de la qualité de l&#...

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Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

Pour comprendre la structure des réseaux neuronaux, la caractérisation fonctionnelle et morphologique des neurones individuels est une nécessité. Ici, nous démontrons juxtasomal étiquetage biocytine, qui permet des enregistrements électrophysiologiques dans la configuration extracellulaire, tout en conservant la capacité d&#39;étiqueter intracellulaire du neurone pour la reconstruction post-hoc de l&#39;architecture dendritique et axonale.

Juxtasomal Biocytin étiquetage pour étudier la structure-fonction de relation corticale individuelle neurones

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

juxtasomal-biocytin-labeling-to-study-structure-function-relationship

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.5K vues.  VU University Amsterdam.  Pour comprendre la structure des réseaux neuronaux, la caractérisation fonctionnelle et morphologique des neurones individuels est une nécessité. Ici, nous démontrons juxtasomal étiquetage biocytine, qui permet des enregistrements électrophysiologiques dans la configuration extracellulaire, tout en conservant la capacité d'étiqueter intracellulaire du neurone pour la reconstruction post-hoc de l'architecture dendritique et axonale. 

Vidéo: Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Microdissection laser des Drosophile Neurones périphériques

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

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Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Didermique co-culture de neurones de rat corticale primaire et des cellules gliales

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DII-étiquetage des neurones DRG pour l&#39;étude de branchement axonal dans une préparation Mont entiers de souris embryonnaires de la moelle épinière

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Une méthode pour High Fidelity optogénétiques contrôle de Pyramidal neurones individuels<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Étiquetage différentiel de surface cellulaire et intériorisé protéines après Anticorps alimentation de Live de culture neurones

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Microdissection laser - une démonstration de l&#39;isolement de la dopamine neurones individuels et de l&#39;Espace ventrale tegmentale entière

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Immunohistochimie et d&#39;étiquetage multiple avec des anticorps de l&#39;espèce hôte mêmes pour l&#39;étude des adultes hippocampe neurogenèse

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Quantification des filamenteuses Actine (F-actine) punctas chez le rat neurones corticaux

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...