We thank Dr. Gilles Dupuis for critical reading of the manuscript. 
Funding
This work was supported by the Canadian Institutes for Health Research, grant # MOP-126173. C.M.D is a member of the Fonds de la Recherche en Sant&#233; (FRSQ)-funded Centre de Recherche Clinique &#201;tienne LeBel.

1. Préparation des solutions pour cellulaire pH Calibration <ol><li> Ajouter les composés suivants à cinq tubes de 50 ml coniques distincts 5 pour préparer des solutions à utiliser pour l&#39;étalonnage: <ul><li> De NaCl (1 ml de NaCl 1 M) (1 M NaCl = 0,58 g dans 10 ml H 2 0) </li><li> KCl (6,75 ml de KCl 1 M) (1 M KCl = 0,75 g dans 10 ml H 2 0) </li><li> Glucose (1 ml de 1 M de D-glucose) (1M D-Glucose = 1,80 g dans 10 ml H 2 0) </li><li> MgS0 4 (0,05 ml de 1 M de MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1,20 g dans 10 ml H 2 0) </li><li> HEPES 20 mM (1 ml d&#39;HEPES 1M) (1 M HEPES = 2,38 g dans 10 ml H 2 0) </li><li> CaCl 2 (0,05 ml de CaCl2 1 M) (1 M CaCl2 = 1,47 g dans 10 ml H 2 0) Préparer toutes les solutions double distillée H 2 O (le trou DDH 2 O). </li></ul></li><li> Remplissez chaque solution avec 35 ml de ddH 2 O et mélanger avec un agitateur magnétique jusqu&#39;à sortelution est atteint. </li><li> Ajuster le pH de chaque solution de KOH 1 N ou HCl 1 N pour obtenir des valeurs de pH de 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 et 7,5. Ensuite, régler le volume avec de l&#39;eau déminéralisée à un volume final de 50 ml. </li><li> Mesure 5 mg de nigéricine et l&#39;ajouter à 670 pi d&#39;EtOH absolu pour préparer un 10 mM nigéricine solution stock. Attention: nigéricine est très toxique et doit être manipulé avec grand soin (gants, lunettes de protection et masque). Mélanger la solution par inversion jusqu&#39;à la nigéricine est complètement dissous. </li><li> Ajouter 0,05 ml de 10 mM de nigéricine (concentration finale de 10 pM) à chaque solution d&#39;étalonnage. Nigéricine est un ionophore qui augmente la perméabilité de la membrane cellulaire et provoque l&#39;équilibration du pH intracellulaire et extracellulaire en présence d&#39;une concentration de dépolarisation de K + extracellulaire. </li><li> Les solutions d&#39;étalonnage peuvent être stockés jusqu&#39;à 1 mois à 4 ° C </li></ol> 2. Préparation des cellules <ol><li> En vertu d&#39;un Safet biologiquey capot, des cellules de semences en 35 mm x boîtes de culture de 10 mm dans 2 ml de milieu de croissance supplémenté par 10% de sérum et d&#39;antibiotiques de veau fœtal. Utiliser la quantité de cellules nécessaire pour assurer environ 50% de confluence après 24 h. NOTE: Dans nos expériences, nous utilisons la lignée cellulaire HT-1080 et la plaque 1 x 10 5 cellules par boîte de culture. </li><li> Déterminer le nombre de boîtes de culture nécessaires pour l&#39;expérience et la plaque 5 boîtes de culture supplémentaires qui seront utilisés pour l&#39;étalonnage. </li><li> Plats place de la culture dans un C / 5% de CO 2 incubateur à 37 ° pendant au moins 24 heures. </li></ol> 3. Préparation des sondes de détection de pH <ol><li> Préparer une solution stock de 1M de la sonde de pH fluorescent 8 hydroxypyrène-1, 3,6 trisulfonique, sel trisodique (HHP / pyranine) dans le trou DDH 2 0. Cette solution doit être conservé à température ambiante et protégé de la lumière. </li><li> Préparer une solution stock de 1 mM 5 - (et 6)-carboxy seminaphthorhodafluor acétoxyméthylique ester acétate (C-SNARF-une heures; appelé Thereafter SNARF-1) en dissolvant 1 mg de SNARF-1 dans 1,76 ml de DMSO. Bien mélanger par pipetage répété. SNARF-1 solution doit être conservé à -20 ° C et protégé de la lumière. </li></ol> 4. Portable étiquetage <ol><li> Seize heures avant imagerie des cellules vivantes, ajouter 2 pi de 1M HPTS solution stock (concentration finale 1 mM) à chaque boîte de culture contenant 2 ml de milieu complet. </li><li> Retour des boîtes de culture à l&#39;incubateur. La sonde est HPTS cellulaire imperméant, donc étiquette organites la sonde doit être prise par pinocytose. Cette condition exige que les incubations de cellules avec HPTS sont effectuées dans un milieu de culture additionné de sérum. </li><li> Après incubation avec HPTS, laver les cellules deux fois avec du PBS stérile et ajouter 2 ml de milieu exempt de sérum pendant au moins 2 heures. L&#39;incubation avec SNARF-1 doit être effectuée dans un milieu sans sérum, car le sérum peut empêcher l&#39;absorption de la sonde. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;une SNARF-1 solution 1 mM pour obtenir afconcentration inal de 5 uM et permettent aux cellules incuber pendant 20 min à 37 ° C, sous une lumière faible. C-SNARF-1 et de concentration temps d&#39;incubation peuvent varier en fonction du type de cellule. </li><li> A la fin de l&#39;incubation, laver les cellules deux fois dans du PBS stérile et ajouter 2 ml de milieu sans sérum. </li></ol> 5. Ajout de pH modulateurs <ol><li> Pour évaluer si la méthode peut détecter des changements de pH dans les cellules, les différents réactifs qui modulent le pH intracellulaire peuvent être utilisés: <ul><li> Bafilomycine A1, un inhibiteur spécifique de la V-ATPase 5 </li><li> Na + / H + échangeur isoforme 1 (NHE-1) 6 </li><li> NH 4 Cl, une base faible qui augmente le pH intracellulaire 7 </li></ul><ol><li> Préparer des solutions de des réactifs mentionnés ci-dessus: <ul><li> Bafilomycine A1: ajouter 10 pg de bafilomycine A1 160 ul de DMSO pour obtenir une solution stock de 100 um </li><li> IEAP: ajouter 25 mg de l&#39;IEAP à 1,67 ml de méthanol à obtena concentration finale de 50 mM </li><li> NH 4 Cl: dissoudre 0,53 g de chlorure d&#39;ammonium dans 10 ml de trou DDH 2 O pour obtenir une concentration finale de 1 mM. </li></ul> Remarque: Toutes les solutions mères doivent être conservés à 4 ° C sauf pour bafilomycine A1 qui doit être conservé à -20 ° C et protégé de la lumière. </li><li> Dans des cultures distinctes, ajouter l&#39;un des réactifs tels que décrits ci-dessous: <ul><li> 2 pl de 100 uM bafilomycine A1 (concentration finale de 100 nM) </li><li> 1 pl de l&#39;IEAP 50 mM (concentration finale de 25 uM) </li><li> 40 pl de 1 M de NH 4 Cl (concentration finale 20 mM) </li></ul></li><li> Incuber les cellules pendant 30 min à 37 ° C. </li></ol></li><li> Procéder à l&#39;acquisition de l&#39;image. </li></ol> 6. Spécifications du microscope d&#39;imagerie des cellules vivantes et des paramètres d&#39;acquisition <ol><li> Effectuer imagerie des cellules vivantes en utilisant un objectif 40x monté sur un balayage inversé microsco confocale spectralepe équipé d&#39;une platine XY motorisée, une chambre pouvant accueillir des plats de verre de la culture de fond dans un (température, humidité, CO 2) incubateur à environnement contrôlé de phase. </li><li> L&#39;instrument confocal (Olympus FV1000) utilisé ici est équipé de: <ul><li> Un laser à diode de 405 nm </li><li> A 40 mW laser argon (458 nm, 488 nm, 515 nm) </li><li> Un laser hélium néon (543 nm) </li><li> Objectif fluorite 10X, NA0.4 </li><li> Un objectif LUCPLFLN 40X, NA0.60 </li><li> Un objectif de l&#39;huile PLAPONSC PLAN APO 60X, NA1.4 </li><li> Un miroir dichroïque DM 405/458/488/543 </li><li> Un SDM 560 et un SDM 640 filtres dichroïques </li><li> Un filtre de barrière BA655-755 </li><li> Un BS20/80 de diviseur de faisceau </li><li> logiciel d&#39;analyse de données pour l&#39;acquisition et l&#39;analyse d&#39;images, </li></ul></li><li> Une fois l&#39;incubateur d&#39;étape a réchauffé à 37 ° C et le microscope est mis en place, placer une boîte de culture préalablement incubé avec HHP et SNARF-1 dans la chambre d&#39;imagerie confocale stade. </li><li> Après avoir localiser une zone d&#39;intérêt, régler les paramètres d&#39;acquisition de logiciels Figure 1. <ul><li> Mettre en place deux ensembles de canaux virtuels. </li><li> Initier la première phase qui correspond à HPTS excitation à 405 nm et la collecte d&#39;émission à 505-525 nm et SNARF-1 excitation à 543 nm et la collecte d&#39;émission à 570-600 nm. </li><li> Lancer la deuxième phase qui correspond à HPTS excitation à 458 nm et la collecte d&#39;émission à 505-525 nm et SNARF-1 excitation à 543 nm et la collecte d&#39;émission à 640-650 nm. </li><li> L&#39;ouverture confocale est fixé à 175 um par défaut et l&#39;ouverture optimale doit être réglé manuellement à 300 um. </li><li> Prenez l&#39;image par l&#39;empilement des sections optiques horizontales série (800 x 800 pixels) de 0,4 um d&#39;épaisseur. </li></ul></li></ol> NOTE: Un objectif 40X est utile d&#39;observer plusieurs cellules simultanément et fonctionne bien pour organite visualisation. Cependant, la résolution spatiale et de l&#39;intensité du signal sont better obtenue en utilisant un objectif 60x huile. En outre, il n&#39;y a pas d&#39;excitation ou d&#39;émission de la diaphonie entre les deux colorants. 7. Étalonnage de sondes pH-détection <ol><li> Avant l&#39;étalonnage, éliminer le milieu de la boîte de culture préalablement incubé avec HHP et SNARF-1, laver deux fois avec du PBS stérile, puis ajouter 2 ml d&#39;une des solutions d&#39;étalonnage cinq. </li><li> Placez la boîte de culture dans la chambre de stade confocale. </li><li> Procéder à une acquisition d&#39;image temps-lapse selon les paramètres suivants: <ol><li> Définissez le nombre d&#39;images et de durées d&#39;intervalle pour l&#39;expérience. NOTE: Nous utilisons généralement un intervalle de 1 min entre les images pour un maximum de 30 minutes. </li><li> Programmer le déclencheur pour fermer entre l&#39;acquisition de chaque image. </li></ol></li><li> Enregistrer l&#39;intensité de fluorescence par minute dans un logiciel de feuille de calcul et de déterminer le moment où l&#39;intensité de fluorescence est stable. PH intracellulaire est généralement stable après le 15 - 20 min. </li><li> REPEAT les étapes 7.1 à 7.4 en utilisant une nouvelle boîte de culture pour chaque solution d&#39;étalonnage restant. </li></ol> 8. D&#39;acquisition de données <ol><li> Une fois le calibrage a été fait, l&#39;acquisition de données de l&#39;échantillon 4-5 champs choisis au hasard contenant 15-20 cellules par champ. Deux images sont obtenues pour chaque domaine: l&#39;un pour l&#39;étiquetage HPTS (vésicules) et le second pour SNARF-1 étiquetage (cytosol). </li><li> Fluorescence de fond (zone extracellulaire) est numériquement soustrait des images fluorescentes de deux sondes. Vésicules marquées et cytosol de leurs images stockées respectives sont sélectionnés à l&#39;aide d&#39;un masque binaire. Pour chaque sonde pH-détection, les intensités de fluorescence sont mesurées sur une échelle numérique (0-4,095 échelle de niveaux de gris). Une intensité moyenne de tous les pixels dans le cytoplasme ou organelle est calculée et les valeurs sont utilisées pour calculer les rapports de fluorescence. </li></ol> 9. Analyse des données <ol><li> Divers logiciels sont disponibles dans le commerce pour l&#39;analyse des données. DireFluoview logiciel. </li><li> Dans une feuille de calcul, valeurs de l&#39;enregistrement et le calcul des ratios de fluorescence comme suit: Dans le cas de HPTS, R = (F 458 nm / F 405 nm) et, dans le cas de SNARF-1, R = (F 644 nm / F 584 nm ). </li><li> Tracer les données en utilisant un logiciel graphique scientifique comme GraphPad Prism. La parcelle doit présenter des ratios de fluorescence (axe Y) en fonction du pH (axe X). d&#39;ajustement de courbe est réalisé en utilisant une régression non linéaire. </li><li> Recueillir les intensités de fluorescence des échantillons de la manière décrite dans l&#39;étape 8.2 et de calculer les rapports de fluorescence. Utilisation des courbes d&#39;étalonnage pour transformer en ratios des valeurs de pH. </li></ol>

<ol>
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No conflict of interest declared.

Mesure du pH quantitative en imagerie des cellules vivantes de différents compartiments cellulaires est nécessaire de mesurer avec précision les variations de pH dans les réponses cellulaires aux défis extérieurs. Cependant, l&#39;un des principaux obstacles qui reste est de cibler facilement et précisément compartiments cellulaires. A cet égard, un certain nombre d&#39;études ont mis en évidence l&#39;utilisation de HPTS comme indicateur de pH intracellulaire introduit dans les cellules par électroporation ...

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">Solutions for calibration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">L-11621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M-12445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">D-Glucose (dextrose)</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">HEPES</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M-1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Deionized water</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Nigericin</td>
			<td style="width:136px;">Calbiochem</td>
			<td align="right" style="width:119px;">481990</td>
			<td>Toxic by inhalation or in contact with skin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:315px;">Keep protected from the light at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Culture dishes &#8709; 35mm</td>
			<td style="width:136px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">354456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">pH-sensing probes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS)</td>
			<td style="width:136px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">H-348</td>
			<td>Keep away from the light at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">5-(and-6)-Carboxy SNARF&#174;-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate</td>
			<td style="width:136px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">C-1271</td>
			<td>Keep away from the light and humidity at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Dimethyl Sufoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">BP231-1&#160;</td>
			<td>Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">Phosphate buffered saline (PBS) 100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">M-12445</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">S369-1</td>
			<td>115 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:136px;">J.T Baker</td>
			<td style="width:119px;">3246-01</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Deionized water</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Autoclave and adjust pH to 7.4</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">Phosphate buffered saline (PBS) 1X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">PBS 100X</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">L-11621</td>
			<td>40,5 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Deoinized water</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Bring to 5 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;width:872px;">pH modulators</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">&#160;Bafilomycin A1</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B-1793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA)</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fischer</td>
			<td style="width:119px;">A649-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous ph measurement in endocytic and cytosolic compartments in living cells using confocal microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Pour la mesure simultanée du pH intracellulaire dans les deux compartiments de la cellule et endosomal / lysosomal, les sondes fluorescentes pH détection ratiométrique SNARF-1 et HPTS ont été utilisés. SNARF-1 est limitée au compartiment cytosolique tandis HPTS permet la mesure ratiométrique de pH du compartiment endosomal / lysosomal. Cellule de chargement avec HPTS pour 16 heures permet sa localisation sélective dans les endosomes / lysosomes 4. Un exemple typique de fluorescence enregistrée à pa...

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Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

Mesure simultanée du pH dans endocytose et cytosoliques compartiments dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.9K vues.  Université de Sherbrooke. Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells. 