L’amas de récepteurs est omniprésent et souvent nécessaire pour signaler une activation en cascade. Cependant, peu de méthodes sont disponibles pour mesurer le degré de regroupement. Nous utilisons la fluorescence de réflexion interne totale, microscopie TIRF, pour suivre la diffusion des molécules FGFR1-mEGFP dans la membrane plasmatique des cellules vivantes.
Ensuite, nous appliquons la luminosité des nombres, l’analyse N & B, pour décrire la dynamique de clustering des récepteurs stimulés. Tirf est idéal pour l’imagerie temporelle rapide des événements moléculaires qui se produisent près de la surface cellulaire, tandis que N & B détermine l’état oligomérique moyen des molécules fluorescentes en fonction de l’endroit où la diffusion dans et hors du volume d’éclairage du microscope. En effet, il s’agit d’un outil pour relier l’organisation temporelle spatiale des récepteurs à la surface de la cellule où ils signalent.
N&B n’a besoin que d’un microscope avec un module d’acquisition rapide. Vous pouvez analyser une grande surface de cellules vivantes ayant juste la connaissance de base des méthodes de fluctuation de fluorescence. Cette méthode peut être appliquée aux protéines qui forment des dimers ou des grappes et peuvent être stoichiométriquement étiquetées avec le colorant fluorescent.
Si les protéines se trouvent dans des compartiments intracellulaires, d’autres types de microscopes sont utilisés pour l’acquisition des images. Il est important de préparer une construction qui exprime la forme monomère du fluorophore pour mesurer dans des conditions expérimentales la luminosité monomérique pure comme un contrôle. Le premier jour, les cellules HeLa semer dans 1,5 millilitres de milieu complet à une concentration de 100.000 à 200.000 cellules par millilitre dans les plats à fond de verre.
Graines six à huit reproduire les plats, et incuber dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Le deuxième ou le troisième jour, les cellules ont atteint la sous-confluence. Ajouter le milieu sans sérum avec le plasmide protéique à la moitié des plats, et ajouter des plasmides de référence avec le monomère et le dimère à la deuxième moitié des plats pour transfecter les cellules.
Après une journée, vérifiez que les cellules transfectées adhèrent au fond de la vaisselle et que la membrane cellulaire est fluorescente. Jeter les plats avec des cellules envahies ou avec une fluorescence très faible. Quatre heures avant l’expérience, activez l’incubateur de température du microscope à 37 degrés Celsius.
Allumez le microscope, les ordinateurs et les caméras, et attendez que les caméras atteignent la température de travail appropriée de moins 75 degrés Celsius. Placez une petite goutte d’huile sur la lentille objective. Mettez un échantillon de plat dans l’incubateur du microscope, et fermez les portes de l’incubateur pour laisser la température du plat équilibrer pendant 10 minutes.
Allumez la lampe d’épifluorescence et le laser de 488 nanomètres. Sélectionnez le mode de contraste d’épifluorescence pour explorer l’échantillon, en fouillant une cellule pour se concentrer à partir de la lentille oculaire. Sélectionnez le filtre approprié pour recueillir l’émission verte à travers la caméra microscope avec bandpass Ex 490/20 500 et bandpass Em 525/50 ou similaire.
Passez de l’oculaire au rapport de came en mode épifluorescence. Affinez la mise au point et changez en mode TIRF. Activez ensuite l’alignement automatique suivant les instructions du microscope TIRF.
Choisissez une profondeur d’éclairage appropriée et optimisez la direction du champ évanescent. Passez à une deuxième caméra. Définissez une région d’intérêt d’au moins 256 par 256 pixels.
Réglez l’exposition à une milliseconde et le gain em à 1000. Réglez la puissance laser à 0,5 milliwatts. Il est nécessaire d’avoir quelques informations sur le coefficient de diffusion de la protéine parce que le temps d’exposition doit être plus court que le temps moyen passé par les molécules fluorescentes dans le volume luminé.
Exécutez une première séquence d’essai dans des conditions initiales et estimez approximativement la valeur du signal au bruit. Les conditions sont acceptables au signal-au-bruit égal à deux à trois ou plus tel que mesuré dans la première série de temps. Utilisez ensuite le curseur du système de fractionnement des émissions reliant la caméra numéro deux au microscope pour masquer un côté de l’image.
Sélectionnez l’option d’arrêt automatique du fichier de la caméra. Commencez l’acquisition de la série d’images pour un minimum de 700 images à un rapport signal-bruit minimum de deux. Sans sortir le plat du microscope, ajouter le ligand.
Sélectionnez une cellule avec une membrane de fluorescence brillante, et démarrez rapidement la première série de temps de la course cinétique. Rechercher une deuxième cellule, et d’acquérir le deuxième point de temps de la cinétique. Capturez une nouvelle cellule pour chaque point de temps de la course cinétique.
Pour chaque nouveau plat, répétez l’alignement de la ligne laser et l’optimisation de l’éclairage TIRF. Maintenant convertir et enregistrer les fichiers d’image acquis avec le logiciel de la caméra que les fichiers tif. Importer des fichiers tif dans la routine logicielle d’analyse en activant l’utilisateur graphique N&B interphase MATLAB.
Série de rejets pour laquelle le profil d’intensité moyenne montre plus de 10% de photobleaching et de séries dans lesquelles il y a eu une distorsion ou une traduction évidente de la membrane cellulaire lors de l’acquisition. Cadres de cultures qui sont évidemment hors de discussion. Gardez pour l’analyse uniquement les séries avec au moins 500 délais.
Déterminez d’abord les paramètres de la caméra. Activez la caméra de calibre de routine. Sélectionnez une zone d’au moins 20 x 50 pixels dans la région du bruit du détecteur.
Dans la fréquence du journal par rapport à l’intrigue numérique, déplacez le curseur rouge linéaire pour délimiter le Gaussian dans la partie linéaire de la courbe. Activez la clé B. Appliquer un binning minimum de 2,2 pour réduire la dispersion des données et pour générer l’histogramme B-I.
Utilisez le curseur carré itératif pour inspecter l’histogramme B-I. Sélectionnez un roi carré pour l’analyse et générez la carte B du retour sur investissement sélectionné. Enregistrez ensuite le fichier ASCII des valeurs B associées à la sélection.
Importer l’ASCII dans un logiciel graphique pour calculer la distribution des fréquences des données et obtenir la valeur B moyenne plus ou moins S.E.Appliquer l’équation d’epsilon pour obtenir la luminosité moyenne pour chaque cellule à chaque point de temps de la course cinétique. Normaliser les données en fonction de l’équation de normalisation, où B’t est la valeur moyenne B mesurée à l’époque t après l’addition ligand et B'0 est la valeur moyenne B mesurée à l’époque t égale zéro, qui est de 10 à 20 secondes après ligand additino. Tracez la luminosité moyenne normalisée par rapport au temps d’acquisition pour construire la course cinétique.
Dans cette étude, les résultats représentatifs de deux cellules HeLa dans le même plat exprimant mEGFP-FGR1 capturés à l’époque zéro et sept, après ajout de 20 nanogrammes par millilitre de FGF2, sont montrés ici. Par rapport aux constructions de référence, GPI-mEGFP et GPI-mEGFP-mEGFP dimimer, l’ensemble de la séquence d’analyse montre l’intensité moyenne de la série de temps. Parcelle de toutes les valeurs B.
Histogramme B-I. Carte B du roi choisi. Et l’histogramme associé à la distribution B.
Après stimulation avec 20 nanogrammes par millilitre de FGF2, les courses cinétiques représentatives montrant la luminosité moyenne en fonction du temps décrivent le processus lent de dimérisation qui persiste pendant plusieurs minutes à la surface de la cellule. Lorsqu’il est stimulé par 50 microgrammes par millilitre de NCAM-Fc, le profil cinétique révèle des transitions rapides et cycliques du récepteur dans les mélanges oligomériques, qui atteint également des valeurs de luminosité supérieures à celle du dimère. Une valeur moyenne normalisée de trois est observée à plusieurs reprises.
Il est important de minimiser les variantes supplémentaires en raison de l’aucune fluctuation moléculaire et le blanchiment. Et les cellules doivent être bien adhérés au plat à fond de verre, pas envahis, et ne pas s’empiler. Si nous sommes intéressés par une protéine qui diffuse plus rapidement à l’intérieur des compartiments intracellulaires, nous pouvons appliquer plus rapidement zéro fois et utiliser la numérisation sur les microscopes focaux ou multiphotons à l’image à l’intérieur de la cellule.
Avec notre approche, nous minimisons les effets néfastes du photobleaching lorsque nous voulons explorer la dynamique d’événements tels que la diménisation. Ces événements contrôlent une variété de réponses cellulaires et sont très difficiles à prouver dans les cellules vivantes avec d’autres techniques.
