La recherche dans les laboratoires est financé par la Fondation Fritz-Bender, Munich, Allemagne (TD) et l&#39;Université de Witten / Herdecke subvention de recherche interne (W.-KL). Nous tenons à remercier le Professeur Dr. Dr. Frank Thévenod (Institut de Physiologie, Physiopathologie et toxicologie, Université de Witten / Herdecke) pour des suggestions utiles.

1. Préparation des réactifs et des solutions <ol><li> Préparer une solution de Hank équilibrée en sel modifié (HBSS) (en mM: NaCl 136,9, KCl 5,37, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCO3, pH 7,2, sans rouge de phénol). Conserver à 4 ° C. </li><li> Ajouter 1,5 M de CaCl2 2 M et l&#39;acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (pH 7,2) des solutions de réserve avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Préparer une solution 250 mM d&#39;achat d&#39;actions de probénécide. Pour la forme de l&#39;acide libre (souvent désigné comme insoluble dans l&#39;eau), dissoudre la poudre dans le probénécide 1 N NaOH, remplir aux trois quarts du volume final avec de l&#39;eau distillée et titrer lentement à pH 7,4 avec HCl 1. Conserver à 4 ° C. </li><li> Dissoudre membrane perméable calcium fluorescent colorant de liaison dans diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO) à une concentration stock de 1 mM. Conserver à -20 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Avant chaque expérience, fraîchement préparer H contenant le probénécide,BSS flux (FSP) en combinant un tampon modifié avec du HBSS (en concentrations finales) 1,5 mM de CaCl2, 10 mM d&#39;HEPES, pH 7,2, 5% de sérum bovin fœtal, 2 mM de probénécide de, et 5,55 mM de glucose. Chaud à 37 ° C. </li></ol> 2. Culture Cellulaire <ol><li> Plate cellules 2,5 x 10 5 rénaux proximaux des tubules (WKPT-0293 CL.2) par puits d&#39;une boîte 6 de la plaque ou bien 35 mm dans un milieu de culture standard et se développent pendant 2 jours pour atteindre un confluence d&#39;environ 70%. </li></ol> 3. Calcium Dye Chargement <ol><li> Pour chaque plat bien ou, mélanger milieu de culture de 1 ml contenant 5% de sérum de veau fœtal, 4 cellules uM perméable colorant de liaison de calcium et 2 mM de probénécide. </li><li> Remplacer le milieu de culture avec 1 ml de mélange chargement de colorant dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 30 min dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2. Couvrir la plaque avec une feuille d&#39;aluminium pour empêcher le blanchiment de l&#39;indicateur fluorescent. </li></ol> 4. Préparation de CeLLS pour cytométrie en flux <ol><li> 0,05% de trypsine-acide éthylènediaminetétra-chaud (EDTA), solution à 37 ° C. </li><li> Solution de colorant de chargement de calcium Aspirer chaque puits et ajouter 1 ml de trypsine long de la paroi du puits. </li><li> Incuber à 37 ° C jusqu&#39;à ce que toutes les cellules sont décollées. </li><li> les cellules de transfert à un tube de 1,5 ml et culot par centrifugation dans une microcentrifugeuse à 10 000 g pendant 1 min. </li><li> Aspirer soigneusement le surnageant sans déranger le culot. </li><li> Laver les cellules en ajoutant 1 ml de tampon de PHF et remettre en suspension par pipetage de haut en bas. </li><li> Pellet les cellules par centrifugation à 10000 g pendant 1 min. </li><li> Répétez les étapes 4.6. et 4.7. encore deux fois. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans un volume final de 500 ul de tampon de PHF et en utilisant les cellules à l&#39;intérieur de l&#39;expérimentation 1 heure. </li><li> Facultatif: cellules de comptage pour déterminer la concentration de cellules et utilisent 5 x 10 4 - 1 x 10 5 cellules par mesure. </li></ol> 5. Débit CytOmeter Setup <ol><li> Lancer le cytomètre en flux, ouvrez le tiroir fluidique et appuyer sur l&#39;interrupteur à bascule valve de ventilation pour augmenter la pression d&#39;air du réservoir de liquide de gaine. </li><li> &quot;Premier&quot; l&#39;instrument pour éliminer les bulles d&#39;air éventuelles résidant à l&#39;intérieur des chambres à air et la chambre d&#39;écoulement. </li><li> Dans le logiciel de cytométrie de flux, d&#39;ouvrir deux fenêtres points de l&#39;intrigue. <ol><li> Le premier tracé de points nécessite la lumière diffusée vers l&#39;avant (FSC) pour le paramètre X et la lumière de côté dispersé (SSC) pour le paramètre Y pour contrôler la qualité des cellules dans l&#39;échantillon par leur taille et leur granularité, respectivement. </li><li> Le deuxième tracé de points de mesure l&#39;intensité de fluorescence du colorant lié au calcium. Sélectionnez le canal de détection de fluorescence appropriée pour le paramètre Y en utilisant une échelle logarithmique et le temps en secondes pour le paramètre X sur une échelle linéaire. </li></ol></li><li> Réglez le taux de «haute» de flux. </li></ol> 6. cytométrie en flux Mesure <ol><li> Effectuer les mesures à température ambiante. Dans un tube de cytométrie de flux de l&#39;échantillon (11,5 x 75 mm), ajouter du tampon de PHF 480 ul. </li><li> Ajouter 20 ul suspension de cellules et de vortex brièvement pour mélanger. </li><li> Déplacer le bras de support de tube vers le côté et positionner le tube à échantillon sur le tube d&#39;injection d&#39;échantillon jusqu&#39;à ce que un joint étanche est formé. Remettre le bras de support de tube à sa position centrée originale. </li><li> Optimisation de mesure en réglant le canal de fluorescence de telle sorte que l&#39;intensité moyenne de la fluorescence de l&#39;échantillon est d&#39;environ 10 2 sur l&#39;axe des y. Enregistrer et utiliser pour des expériences ultérieures. </li><li> Pour commencer une expérience, répétez les étapes 6.1 à 6.3. </li><li> Enregistrez fluorescence de base pour 50 sec. </li><li> Pause mesure, retirer le tube d&#39;échantillon, ajouter composé d&#39;intérêt, vortex brièvement et revenir au tube d&#39;injection d&#39;échantillon. Cette étape ne devrait pas prendre plus de 15 secondes. </li><li> Reprendre la mesure et continuer pour un total de 204,8 sec. </li><li> Utilisez un i de calciumonophore, tel que l&#39;ionomycine (10 uM), et d&#39;un chélateur du calcium, tel que l&#39;éthylèneglycol tétraacétique (EGTA), MnCl 2 ou CoCl 2 (2 mM), des contrôles, respectivement positive et négative. </li></ol> Analyse 7. données <ol><li> Analyser les données en utilisant un logiciel de cytométrie en flux dédié pour l&#39;analyse en ligne, tels que WinMDI (Multiple Document Interface Windows pour cytométrie en flux), un logiciel gratuit développé par Joe Trotter à l&#39;Institut Scripps, Cytométrie en flux Core. </li><li> Ouvrez un tracé de points avec les paramètres de la SSC et FSC. </li><li> Sélectionnez la région de cellules pour l&#39;analyse à l&#39;aide de l&#39;outil &quot;des régions&quot; (clic droit sur ​​l&#39;image) d&#39;exclure les cellules mortes ou les débris cellulaires trouvé dans le coin inférieur gauche de l&#39;analyse des données (Figure 1). </li><li> Analyse Quadrant (Figure 2) <ol><li> Ouvrir un diagramme de densité en fonction du temps sur l&#39;axe des x et l&#39;intensité de fluorescence sur l&#39;axe des y. Utilisez tous les événements. </li><li> Nousenvoyer la même région de déclenchement comme dans 7.3. </li><li> Quantifier les données en utilisant l&#39;outil &quot;Quadrant&quot;. </li><li> Régler les séparateurs quadrants de telle sorte que la ligne verticale est placé au moment de l&#39;addition du composé et de la ligne horizontale est placée au centre de la fluorescence de ligne de base chez les témoins. Assurez-vous que le positionnement des séparateurs de quadrant est égale dans tous les échantillons. </li><li> Le pourcentage de cellules dans chaque quadrant est affichée dans chaque coin (figure 2). Comparer le quadrant supérieur droit (UR) entre les échantillons. </li></ol></li><li> analyse de l&#39;histogramme (figure 3) <ol><li> Ouvrir les données de commande dans une fenêtre de l&#39;histogramme de l&#39;intensité de fluorescence sur l&#39;axe des x et des événements sur l&#39;axe des y. Utilisez tous les événements. </li><li> Pour une vue d&#39;ensemble pictural, ajouter les données de test pour être comparé à l&#39;intrigue comme parcelles de superposition de commande (allez dans Fichier → Ouvrir Fichier → → Sélectionnez le fichier Overlay). </li><li> Pour l&#39;analyse quantitative, seul histogramme gagnerDow doivent être utilisés. Porte le population de cellules à l&#39;aide de la région R1 de l&#39;étape 7.3. </li><li> Dans le témoin non traité, utilisez la fonction de marqueur («marqueurs») pour marquer la zone d&#39;analyse à partir de la mi-chemin entre le minimum et le maximum de fluorescence du pic de contrôle et se terminant à l&#39;intensité de la fluorescence maximale. Le pourcentage de cellules dans cette zone est calculée. </li><li> Récupérer des données à partir de la fenêtre des statistiques. Répétez l&#39;opération pour les autres fichiers de données en utilisant la même zone marquée pour l&#39;analyse. </li></ol></li><li> analyse de l&#39;intensité de fluorescence (Figure 4) <ol><li> Ouverture d&#39;un tracé de points dans le temps sur l&#39;axe des x et l&#39;intensité de fluorescence sur l&#39;axe des y. Utilisez tous les événements. </li><li> Activer &quot;Mode cinétique» et «Overlay ligne Kinetics&quot;. Une ligne bleue apparaît dans le tracé de points représentant l&#39;intensité moyenne de fluorescence. </li><li> Quantifier l&#39;afflux de calcium par rapport en créant des régions rectangulaires multiples. Chaque région doit avoir awidth d&#39;environ &quot;50&quot;, ce qui équivaut à &quot;10 secondes&quot;. Définir jusqu&#39;à 15 zones rectangulaires. </li><li> Récupérer quantification de la fenêtre des statistiques et copiez-les dans une feuille de calcul. </li><li> Utilisez les données de Y-moyen pour analyse. Calculer la moyenne des R2 à R6, qui est équivalente à 20 à 50 sec. Ceci est la valeur de référence. </li><li> Choisissez un intervalle de temps approprié pour l&#39;analyse de l&#39;afflux de calcium (dépend de début, la durée et l&#39;intensité). </li><li> Calculer les signaux de calcium de chaque région à l&#39;intérieur de cet intervalle de temps par rapport à la valeur moyenne de référence, qui est, le signal de fluorescence avant l&#39;addition de composé, qui est fixé à 100%. Déterminer la moyenne et l&#39;écart type des régions poster plus composé; ce moyen est le signal de calcium provoquée par le composé. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Le calcium est un événement clé dans de nombreux processus cellulaires qui agissent comme une seconde molécule de signalisation de messager et également en tant que moyen pour la communication entre le RE et les mitochondries. La capacité de mesurer l&#39;évolution des concentrations libres de calcium cytosolique est une technique utile qui peut appliquer à tous les domaines de la biologie cellulaire. Il existe différentes méthodes pour détecter les signaux de calcium cytosolique. Classiquement, des signaux d...

Le calcium est un second messager important de responsable de la transmission de signaux physiopathologiques 1 et physiologique cellulaire. Les concentrations de calcium cytosolique sont maintenus bas grâce à l&#39;activité des pompes et des échangeurs de calcium de calcium. Le sarcoplasmique / endoplasmique ATPase du réticulum calcium (SERCA) remplit le réticulum endoplasmique (RE) magasin de calcium dans le cadre d&#39;un système de «pompe de fuite&quot; alors que le calcium ATPase de la membrane plasmique (PMCA) expulse calcium dans le compartiment extracellulaire, à la fois dans les mœurs dépendant de l&#39;ATP 2. Messagers physiologiques, telles que des hormones ou des neurotransmetteurs, transmettent leurs signaux à G récepteurs couplés aux protéines, l&#39;activation de la phospholipase C, qui hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) dans la membrane plasmique à générer diacylglycérol et l&#39;inositol triphosphate (IP3) 3. Bien diacylglycérol reste dans la membrane plasmique, IP3 diffuse dans le cytosol et se lie à un récepteur d&#39;IP3s (IP3Rs), qui sont activés ligand canaux calciques, qui se trouvent dans la membrane du RE et le calcium est libéré du magasin ER luminale a abouti à une augmentation de la concentration en calcium cytosolique 4. Une autre voie pour le calcium pour atteindre le cytosol est à travers les canaux calciques et des échangeurs présents dans la membrane plasmique. Diaphonie entre ces deux compartiments ont été décrites: la libération de calcium de calcium induite (CICR) où le calcium extracellulaire induit la libération de calcium à partir de ER magasins 5 et magasin exploité entrée de calcium (SOCE) où la vidange des magasins à l&#39;urgence est détectée par la STIM et provoque l&#39;ouverture de Orai les canaux de calcium dans la membrane plasmique afin de promouvoir le remplissage des magasins ER 6. Dans des conditions physiopathologiques, la réponse calcique cellulaire est l&#39;augmentation de calcium cytosolique déréglementés et en l&#39;absence de stimulateurs physiologiques 1. La réponse du calcium peut être affectée à un certain nombre de façons: calcium prolongésignal retardé élimination du calcium du cytosol, l&#39;épuisement des réserves de calcium ou des changements localisés de calcium. En outre, les mitochondries ont un rôle central dans la mémoire tampon et la libération de calcium 7. Prolongé et / ou supramaximal augmentation de calcium cytosolique entraîne la mort cellulaire. En fait, le calcium est le plus souvent impliqué dans la réponse physiopathologique cellulaire et est un événement clé dans un large éventail de maladies, comme les maladies neurodégénératives, les maladies cardiaques, le cancer, les maladies osseuses et les maladies du rein, qui sont principalement associée à la mort cellulaire et la perte ou l&#39;altération des organes ou de tissus fonction 8-10. En outre, la perturbation des signaux du calcium a été liée à l&#39;adaptation cellulaire et des changements dans les fonctions cellulaires et des réponses. Traditionnellement, les signaux calciques sont mesurés avec un indicateur de calcium fluorescent chargé négativement qui est chargé dans les cellules sous forme d&#39;un ester d&#39;acétoxyméthyle cellule perméable (AM). Une fois clivée par esteras cellulaireses, les indicateurs fluorescents restent dans le compartiment intracellulaire et augmentent l&#39;intensité de fluorescence lorsque le calcium est lié. L&#39;indicateur de calcium le plus connu et utilisé est le quotientométrique Fura-2 développé par Roger Tsien et ses collègues 11. indicateurs de calcium ayant des affinités différentes pour le calcium permettent à différents pools de calcium à surveiller. Les méthodes de détection comprennent l&#39;imagerie des cellules vivantes, fluorescence lecteur de microplaques et la cytométrie de flux. La cinétique relativement rapide de signaux calciques (généralement au bout de quelques secondes à quelques minutes) fait Imagerie de cellules vivantes la meilleure méthode pour gagner le plus d&#39;informations sur les caractéristiques du signal de calcium. Mis à part la cinétique rapide de signaux calciques (quelques millisecondes), imagerie de cellules vivantes est une meilleure méthode pour étudier la compartimentation cellulaire de la signalisation calcique dans une seule cellule 12. Les concentrations de calcium absolues peuvent être calculées par la détermination de la fluorescence minimale et maximale du calcium indicator par addition d&#39;un chélateur de calcium et perméabilisation des cellules, respectivement, comme décrit par Grynkiewicz et al., 11. L&#39;utilisation de la cytométrie en flux pour mesurer des signaux de calcium a été développé dans les années 1980 dans des cellules immunologiques où la possibilité de mesurer des paramètres tels que l&#39;intégrité de la membrane et la séparation de la population de cellules, et l&#39;exigence de cellules en suspension combinée avec le développement de la longueur d&#39;onde unique indicateurs de calcium fait cytométrie de flux une méthode idéale et convenientdetection 13-15. Dans les cellules adhérentes, imagerie des cellules vivantes fournit le plus d&#39;informations sur la signalisation calcique, surtout la cinétique, mais nécessite une installation complexe comprenant un microscope à fluorescence, un système de perfusion, l&#39;entretien de l&#39;environnement cellulaire, telles que la température, et un logiciel de microscope spécialisé pour l&#39;acquisition et l&#39;analyse des données. Des méthodes alternatives comme un lecteur de microplaques à fluorescence ou pharmacolmoyens giques grâce à l&#39;utilisation de chélateurs de calcium sont incomparables en termes d&#39;information acquise. La cytométrie en flux est de plus en plus largement utilisés pour surveiller calcium cytosolique dans les cellules adhérentes si, dans la majorité des études, ne finissent point les mesures sont effectuées. En utilisant le procédé développé initialement par Gergely et al., Dans les cellules B immunologiques 16, les variations de concentration de calcium libre cytosolique par cytométrie en flux avec une cinétique en temps réel et le contrôle de l&#39;intensité de fluorescence dans des cellules individuelles à partir d&#39;une population d&#39;échantillon ont été mesurés avec succès dans des cellules épithéliales cancéreuses et les hybrides de cellules souches du cancer 17. Cette méthode est en outre adapté pour une utilisation dans des cellules épithéliales adhérentes, qui sont difficiles à charger avec des indicateurs de calcium 18. Ici, en utilisant une lignée de cellules épithéliales immortalisées adhérente dérivée du segment S1 du rein de rat tubule proximal (CL.2 WKPT-0293) 19, nous décrivons un m simplifié optimisééthode pour la mesure de l&#39;évolution de la concentration en calcium cytosolique par cytométrie de flux. Depuis de nombreuses cellules épithéliales possèdent un certain nombre de transporteurs organiques pour les composés anioniques, le chargement des cellules avec un indicateur de calcium peut se révéler être un défi. Pour éviter que l&#39;efflux de calcium, les indicateurs de probénécide, l&#39;inhibiteur prototype de transporteurs d&#39;anions organiques et développé à l&#39;origine pour diminuer l&#39;excrétion rénale de la pénicilline 20, est appliquée simultanément dans le milieu d&#39;incubation. Les cellules sont maintenues dans des monocouches de chargement indicateur de calcium, mis en suspension et des signaux de calcium peuvent être détectés immédiatement après l&#39;addition du composé.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:79px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:321px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-3, AM</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">F-1241&#160;</td>
			<td>Cell permeable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Probenecid</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8761</td>
			<td>Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:79px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tunicamycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software</td>
			<td style="width:79px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)</td>
			<td style="width:79px;">Joe Trotter, The Scripps Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line</td>
			<td style="width:79px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology &#38; Biophysics, Case 
			Western Reserve University, Cleveland, OH)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Pour augmenter le calcium cytosolique, deux composés pharmacologiques ont été appliquées aux cellules des tubules rénaux proximaux (WKPT-0293 CL.2) chargés de colorant de liaison cellulaire calcium perméable, Fluo-3-AM. Les échantillons de contrôle non traités ont été chargées avec un colorant de liaison de calcium en présence de probénécide et ont été mélangés mais sans l&#39;addition de tous les composés. Thapsigargine (TG) est un inhibiteur classique de la pompe de SERCA conduisant à une fuite h...

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Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Le calcium est impliqué dans de nombreuses voies de signalisation physiologiques et physiopathologiques. Imagerie des cellules vivantes nécessite un équipement spécialisé et peut prendre du temps. Une méthode simple et rapide à l&#39;aide d&#39;un cytomètre de flux pour déterminer les changements relatifs au calcium cytosolique dans les cellules épithéliales adhérentes mises en suspension a été optimisée.

Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

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15.2K vues.  University of Witten/Herdecke.  Le calcium est impliqué dans de nombreuses voies de signalisation physiologiques et physiopathologiques. Imagerie des cellules vivantes nécessite un équipement spécialisé et peut prendre du temps. Une méthode simple et rapide à l'aide d'un cytomètre de flux pour déterminer les changements relatifs au calcium cytosolique dans les cellules épithéliales adhérentes mises en suspension a été optimisée. 

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IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: immunoprécipitation détectée par cytométrie en flux

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

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Biologie

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolement de la chromatine par purification d&#39;ARN (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

Haut différenciation de l&#39;efficacité de pluripotentes humaines des cellules souches à des cardiomyocytes et caractérisation par cytométrie en flux

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse des suspensions de cellules isolées de tissus solides par Spectral cytométrie en flux

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Mesurer d’endoréduplication par cytométrie de flux des protoplastes isolés Tuber

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

Haut débit mesure de Dictyostelium discoideum macropinocytose par cytométrie en flux

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

Détection et caractérisation de l'auto-assemblage des protéines in Vivo par la cytométrie des flux

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes T par cytométrie de flux

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...