Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jean-Michel Ané dans le département d&#39;agronomie à l&#39;UW-Madison pour fournir des échantillons de Medicago truncatula. Ce travail a été financé en partie par un financement de la National Science Foundation (NSF) subvention CHE-0957784, l&#39;Université du Wisconsin Graduate School et la Fondation Wisconsin Alumni Research (FRAO) et le programme de bourses de recherche Romnes Faculté (LL). EG reconnaît un diplômé de bourses de recherche NSF (DGE-1256259).

Une. Instrumentation <ol><li> MALDI-TOF/TOF MSI. Utilisez un spectromètre de masse équipé d&#39;une source MALDI pour l&#39;analyse de petites molécules (voir le tableau des Matériaux / Équipement). Effectuer des acquisitions en mode ion positif ou négatif selon les analytes d&#39;intérêt. Spécifiez une plage de masse de l&#39;intérêt et de recueillir 500 coups laser / spot à 50 um intervalles à la fois les dimensions x et y sur la surface de l&#39;échantillon pour produire des images d&#39;ions. La largeur de la trame et le nombre de tirs laser peuvent être ajustés pour obtenir une résolution spatiale plus élevée et une intensité de signal maximale, respectivement. Utilisation de la matrice DHB pics ou des étalons internes appliquées à la glissière ou directement au tissu de calibrer les spectres de masse. </li><li> Résolution LC-MS haute. (Voir le tableau des Matériaux / Équipement) extraits d&#39;échantillons Exécuter avec LC-MS en utilisant soit en phase inverse (RP) LC avec une colonne C-18, ou phase normale (NP) avec une colonne HILIC selon les analytes d&#39;intérêt. Utilisez phases mobiles etgradients comme appropriés pour le type d&#39;échantillon spécifique. Effectuer des acquisitions en modes d&#39;ions positifs ou négatifs en fonction du type d&#39;échantillon. </li></ol> 2. Préparation des tissus <ol><li> Coupez le nodule de racine de la plante, laissant 3-4 mm de racine attachés au nodule. </li><li> Immédiatement après dissection, utiliser une pince pour placer le tissu dans une tasse de cryostat et couvrir avec de la gélatine (100 mg / ml dans de l&#39;eau déminéralisée). Il est essentiel pour le tissu devant être collé au fond de la tasse, sans bulles d&#39;air. </li><li> Flash geler le tissu en plaçant la tasse dans un bain de glace carbonique / éthanol jusqu&#39;à ce que la gélatine durcit et devient opaque. Conserver les échantillons à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Retirer les échantillons du congélateur à -80 ° C, couper la coupe du cryostat plastique et éliminer les excès de gélatine. Montez le tissu intégré à la pince de cryostat avec une quantité de taille dime de la température de coupe optimale (OCT) médias, tout en ne laissant pas les PTOM toucher le tissu. Placez dans cryostatboîte jusqu&#39;à la solidification PTOM. </li><li> Autoriser le mandrin et la gélatine de s&#39;équilibrer dans la boîte de cryostat (de série à -20 ou -25 ° C) pendant environ 15 min. </li><li> Utilisez le cryostat (voir le tableau des Matériaux / Équipement) de l&#39;article tissu environ l&#39;épaisseur d&#39;une cellule (8-20 um selon le type de tissu) et dégel monter chaque tranche sur le verre revêtu d&#39;ITO en chauffant le dos (non-ITO côté) d&#39;une lame de verre revêtu d&#39;ITO sur le dos de votre main-enduit. Placez le côté revêtu d&#39;ITO de la glissière réchauffé à proximité de la tranche de tissu congelé et permettre à la tranche de coller sur la lame. Placer les sections rapprochées sur la diapositive fournira un meilleur alignement pendant MSI. </li></ol> 3. Matrice d&#39;application <ol><li> Airbrush application de MALDI Matrice <ol><li> Toutes les procédures de l&#39;aérographe doivent être effectuées dans une hotte. </li><li> Bien nettoyer le récipient de solution à l&#39;aérographe et la buse (voir le tableau des Matériaux / Équipement) avec du méthanol etremplir le récipient de la solution avec une solution de matrice DHB (150 mg / ml dans 50% methanol/0.1% de TFA v / v). </li><li> Maintenir l&#39;aérographe environ 35 cm à partir de l&#39;échantillon et d&#39;appliquer de 10 à 15 couches de matrice sur la surface de la lame d&#39;une durée de 10 sec 30 sec pulvérisation et le temps de séchage entre chaque couche. </li><li> Bien nettoyer l&#39;aérographe à nouveau avec du méthanol lorsque vous avez terminé pour éviter le colmatage de la solution de matrice. </li></ol></li><li> Demande pulvérisateur automatique de MALDI Matrice <ol><li> Suivez les instructions de démarrage fournis par les fabricants du système de pulvérisation automatique. </li><li> Pour MSI de métabolites dans les nodules des racines à l&#39;aide de 40 mg / ml (dans 50% methanol/0.1% de TFA v / v) DHB comme matrice, régler la température à ~ 80 ° C, la vitesse de 1250 mm / min, le débit à 50 ul / min, et le nombre de passes à 24. Pour une meilleure protection, il est recommandé de faire pivoter la buse 90 ° et / ou de décalage de la buse de 1,5 mm entre chaque passe. Lancer méthode de pulvérisation. Comme un SIde note, le système de pulvérisation particulière utilisée ici chauffe la buse pour l&#39;évaporation rapide du solvant. Comme le solvant s&#39;évapore, la concentration de la matrice augmente rapidement. La matrice appliquée à l&#39;échantillon avec l&#39;aérographe et le pulvérisateur automatique ont des concentrations comparables. </li><li> Suivez les instructions de mises à l&#39;arrêt fournies par les fabricants du système de pulvérisation automatique. </li></ol></li><li> Application de sublimation matrice MALDI <ol><li> Peser 300 mg DHB dans le fond de la chambre de sublimation (voir le tableau des Matériaux / Équipement). </li><li> Collez la lame de verre au doigt froid (partie supérieure de la chambre de sublimation) avec les sections de tissus vers le bas avec du ruban adhésif double-face conductrice. Couvrir l&#39;ensemble du dos de la lame avec le ruban adhésif double face, même pour la conductivité, la production même dépôt de matrice. </li><li> Serrer les moitiés supérieure et inférieure de la chambre de sublimation avec le serre-joint. Connectez le vide et annonced glace et l&#39;eau froide dans le réservoir supérieur. </li><li> Placer la chambre de sublimation dans une enveloppe chauffante qui est à la température ambiante. </li><li> Mettre en marche la pompe à vide. Attendez 15 minutes et tourner sur le chauffe-ballon. Le chauffe-ballon doit atteindre 120 ° C au cours de 10 min. </li><li> Après 10 minutes, éteindre le feu, fermer le robinet à vide (si l&#39;intérieur de la chambre reste sous vide) et arrêter la pompe à vide. </li><li> Laisser la chambre pour venir à la température ambiante, ouvrir la vanne en relâchant la pression à vide et retirer l&#39;échantillon. La taille de la chambre de sublimation permettra de déterminer la quantité de matrice sublimé à la lame de verre. Les grandes sublimation chambres (la taille d&#39;un bécher de 400 ml) utilisent environ 300 mg de DHB tandis que les chambres plus petites (de la taille d&#39;un bécher de 150 ml) utilisent environ 100 mg de DHB et il faudra couper la lame de verre de sorte qu&#39;il s&#39;inscrit dans la chambre. </li></ol></li></ol> 4. Acquisition de l&#39;image <ol> &lt;li&gt; Marquer un modèle + à chaque coin de l&#39;échantillon avec un stylo WiteOut de fluide de correction pour être utilisé comme &quot;enseigner points&quot;. Placez la lame de verre dans la plaque de l&#39;adaptateur de diapositives MALDI et prendre une image optique de l&#39;échantillon à l&#39;aide d&#39;un scanner. </li><li> Mettre en place un fichier d&#39;acquisition d&#39;image en utilisant le logiciel fourni par le fabricant de l&#39;appareil avec une taille de pas de trame de 50 um et un diamètre de laser égale ou plus petite que la taille de pas de trame. Sur cet instrument particulier, le réglage du laser donne un diamètre minimum de laser d&#39;environ 10 um et petit réglage de laser a un diamètre de 40 à 50 um. </li><li> Chargez l&#39;image optique dans le logiciel et aligner la plaque avec l&#39;image optique. </li><li> Étalonner l&#39;instrument avant de commencer l&#39;acquisition en utilisant des ions communs de la matrice de munitions, des normes internes, ou un mélange d&#39;étalonnage. </li><li> Spécifiez les zones de tissu à analyser avec MSI, y compris une place de matrice pure sur la diapositive pour être utilisé comme un «blanc». </li><li> Commencez acquisition. </li></ol> 5. Génération de l&#39;image <ol><li> Ouvrez le fichier d&#39;image dans le logiciel disponible dans le commerce fournies par le vendeur et extraire les images d&#39;ions. Autres logiciels open-source est disponible pour MSI traitement de données 19. </li></ol> 6. Identification des métabolite <ol><li> Sélectionner un spécifique m / z d&#39;intérêt à partir du spectre de masse en utilisant le logiciel spécifique du fournisseur (voir le tableau des Matériaux / Équipement). Un analyte peut être distingué d&#39;un ion de matrice quand un pic de l&#39;analyte est choisi dans le spectre de masse et des images d&#39;ions sont générés spécifiquement localisée dans la section de tissu. </li><li> Générer la liste des analytes d&#39;intérêt et effectuer des expériences MS / MS. Voir le tableau 1 et tableau 2 résultats représentatifs pour les listes d&#39;analytes de l&#39;échantillon. </li><li> Effectuer une analyse ciblée LC-MS sur un spectromètre de masse à haute résolution (ou haute résolution MALDI-MS si disponible) pour obtenir précismesures de la masse des analytes d&#39;intérêt et aussi effectuer LC-MS/MS des analytes cibles pour obtenir des motifs de fragmentation caractéristiques. </li><li> Effectuer base de données de recherche afin de déterminer les identifications putatifs pour les analytes ciblés. Exemples de bases de données sur les métabolites comprennent: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG, et BDMH. </li><li> Pour confirmer les identifications putatifs de précision recherche de base de données de masse, correspondre à la MS / MS des analytes ciblés de spectres MS / MS de normes, de la littérature, et / ou logiciels de prédiction de la fragmentation. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Comme discuté ci-dessus, la préparation de l&#39;échantillon est l&#39;étape la plus critique dans le flux de travail MSI. Intégrer le tissu inégalement fera sectionnement d&#39;être difficile ou impossible dans certains cas. La taille de la section et le temps d&#39;équilibrage adéquat sont essentiels au maintien de l&#39;intégrité des tissus et d&#39;éviter de pliage et de larmes. Sélection de la matrice et de la technique d&#39;application va jouer un rôle dans la détermination des types de substances ...

Le domaine en pleine croissance de la métabolomique a de nombreuses applications biologiques importants, notamment la découverte de biomarqueurs, déchiffrer les voies métaboliques des plantes et d&#39;autres systèmes biologiques, et de la toxicologie profilage 4,6-10. Un défi technique majeur lors de l&#39;étude des systèmes biologiques est d&#39;étudier les voies métabolomique sans les perturber 11. MALDI-MSI permet une analyse directe de tissus intacts qui permet la détection sensible des analytes dans les organes simples 12,13 et même des cellules individuelles 14,15. La préparation des échantillons est une étape cruciale dans la production d&#39;images de spectrométrie de masse fiables et reproductibles. La qualité des images dépend grandement de facteurs tels que le tissu support d&#39;enrobage, l&#39;épaisseur de coupe, une matrice MALDI, et la technique d&#39;application de la matrice. Pour des applications d&#39;imagerie, de l&#39;épaisseur de section idéal est la largeur d&#39;une cellule (8-20 um en fonction du type d&#39;échantillon). MALDI nécessite le dépôt d&#39;une organique, cristalline composé de matrice, typiquement un acide faible, sur l&#39;échantillon pour faciliter l&#39;ablation analyte et de l&#39;ionisation. Différentes matrices 16 fournissent différentes intensités de signal, des ions interférents et l&#39;efficacité d&#39;ionisation des différentes classes de composés. La technique d&#39;application de la matrice joue également un rôle dans la qualité des images spectrales de masse et de différentes techniques appropriées pour les différentes classes d&#39;analytes. Trois méthodes d&#39;application de la matrice sont présentés dans ce protocole: aérographe, pulvérisateur automatique, et la sublimation. Airbrush l&#39;application de la matrice a été largement utilisé dans l&#39;imagerie MALDI. L&#39;avantage de l&#39;application de la matrice aérographe est qu&#39;il est relativement facile et rapide. Cependant, la qualité de l&#39;application de la matrice de l&#39;aérographe dépend fortement de la compétence de l&#39;utilisateur et a tendance à être moins reproductible et provoquer la diffusion d&#39;analytes, en particulier des petites molécules 17. Systèmes de pulvérisation automatiques ont mécaniciens similaires à l&#39;aérographe demande de matrice, mais le VHAe été mis au point pour éliminer la variabilité observée avec l&#39;application manuelle de l&#39;aérographe, faisant de la pulvérisation plus reproductible. Cette méthode peut parfois être plus de temps que l&#39;application traditionnelle de la matrice de l&#39;aérographe. Les deux aérographe manuel et systèmes de pulvérisation automatiques sont les méthodes d&#39;application de la matrice à base de solvants. La sublimation est une technique d&#39;application de matrice sèche qui devient de plus en plus populaire pour l&#39;imagerie par spectrométrie de masse des métabolites et des petites molécules, car il réduit la diffusion de l&#39;analyte, mais il lui manque la nécessaire solvant pour extraire et observer composés de masse plus élevées 18. Identification confiante de métabolites nécessite généralement des mesures de masse précises pour obtenir des identifications putatifs suivie par de masse en tandem (MS / MS) des expériences de validation, avec spectres MS / MS est comparé aux normes, la littérature, ou spectres théoriques. Dans ce protocole haute résolution (puissance de 60 000 à m / z 400 résoudre masse), la chromatographie liquide (LC)-MS est couplé à MALDI-MSI à obtenir à la fois l&#39;information spatiale et identifications confiants de métabolites endogènes, en utilisant Medicago truncatula racines et nodosités des racines comme le système biologique. Expériences MS / MS peuvent être effectuées directement sur le tissu avec MALDI-MSI ou d&#39;extraits de tissus avec LC-MS et utilisés pour la validation des identifications de métabolites. Ce protocole fournit une méthode simple pour cartographier métabolites endogènes dans M. truncatula, qui peut être adapté et appliqué à MSI de petites molécules dans différents types de tissus et les systèmes biologiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gelatin</td>
			<td style="width:181px;">Difco</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td>
			<td style="width:611px;">heat to dissolve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat- HM 550</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:163px;">956564A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">indium tin oxide (ITO)-coated glass slides&#160;</td>
			<td>Delta Technologies</td>
			<td>CB-90IN-S107</td>
			<td>25-75-0.8 mm (width-length-thickness)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td><a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx?ItemID=1787195">PI90033</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Airbrush</td>
			<td>Paasche Airbrush Company</td>
			<td>TG-100D</td>
			<td>coupled with 75 ml steel container</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td style="width:163px;">HTX.TMSP.H021-U</td>
			<td>Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sublimation apparatus&#160;</td>
			<td>Chemglass Life Science</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td>
			<td>Ideal Vacuum Products</td>
			<td>P10976</td>
			<td>Ultimate Pressure = 1x10-4 Torr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:163px;">276601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">FlexImaging</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td>269841</td>
			<td>One example of &#34;vender specific software&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MALDI LTQ Orbitrap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td>
			<td>High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Q Exactive</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maldi-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in medicago truncatula root nodules

La plupart des techniques utilisées pour l&#39;étude de petites molécules, telles que les produits pharmaceutiques ou les métabolites endogènes, utiliser les extraits de tissus qui nécessitent l&#39;homogénéisation du tissu d&#39;intérêt qui pourraient provoquer des changements dans les voies métaboliques étudiées 1. Spectrométrie de masse imagerie (MSI) est un outil d&#39;analyse puissant qui peut fournir des informations spatiales d&#39;analytes dans des tranches intactes d&#39;échantillons de tissus biologiques 1-5. Cette technique a été largement utilisée pour étudier divers types de composés, y compris les protéines, les peptides, les lipides et les petites molécules telles que les métabolites endogènes. Avec laser assistée par matrice de désorption / ionisation (MALDI)-MSI, les distributions spatiales de plusieurs métabolites peuvent être détectés simultanément. Ici, une méthode développée spécifiquement pour la conduite non ciblées métabolomique expériences MSI sur les racines des légumineuses et des nodules racinaires est présenté qui pourrait révéler un aperçu des processus biologiques qui ont lieu. Laméthode présentée ici montre un flux de production typique MSI, à partir de la préparation des échantillons pour l&#39;acquisition d&#39;images, et met l&#39;accent sur l&#39;étape d&#39;application de la matrice, ce qui montre plusieurs techniques d&#39;application de matrice qui sont utiles pour la détection de petites molécules. Une fois les images MS sont générés, l&#39;analyse et l&#39;identification des métabolites d&#39;intérêt sont discutés et démontrés. Le workflow standard présenté ici peut être facilement modifié pour différents types de tissus, des espèces moléculaires et de l&#39;instrumentation.

Une vue d&#39;ensemble de MSI expérimental est représenté sur la figure 1. Au tout début de l&#39;expérience, la préparation des échantillons est une étape critique. Les nodules sont supprimés de la racine de la plante et intégrés dans de la gélatine. Le tissu doit être plaqué contre la coupe du cryostat, sans bulles, alors qu&#39;il est gelé, ce qui permettra d&#39;assurer un alignement plus facile et correcte du tissu pendant qu&#39;il est sectionné. Lorsque le tissu est coupé, il est...

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MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Spectrométrie de masse imagerie (MSI) est un outil puissant qui peut être utilisé pour découvrir et identifier les différentes espèces chimiques dans les tissus intacts, en préservant les composés dans leur environnement naturel, qui peuvent fournir de nouvelles perspectives dans les processus biologiques. Ici un procédé MSI développé pour l&#39;analyse de petites molécules est décrite.

Imagerie MALDI-spectrométrie de masse pour l&#39;investigation des métabolites dans<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; nodules racinaires

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

maldi-mass-spectrometric-imaging-for-investigation-metabolites

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

18.8K vues.  University of Wisconsin- Madison.  Spectrométrie de masse imagerie (MSI) est un outil puissant qui peut être utilisé pour découvrir et identifier les différentes espèces chimiques dans les tissus intacts, en préservant les composés dans leur environnement naturel, qui peuvent fournir de nouvelles perspectives dans les processus biologiques. Ici un procédé MSI développé pour l'analyse de petites molécules est décrite. 

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Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) plasmid. A. rhizogenes can cause hairy root formation on plant tissues and form composite plants after transformation. On these composite plants, some of the regenerated roots are transgenic, carrying the wild type T-DNA and the engineered binary vector; while the shoots are still non-transgenic, serving to provide energy and growth support. These hairy root composite plants will not produce transgenic seeds, but there are a number of important features that make these composite plants very useful in plant research. First, with a broad host range,A. rhizogenes can transform many plant species, especially dicots, allowing genetic engineering in a variety of species. Second, A. rhizogenes infect tissues and explants directly; no tissue cultures prior to transformation is necessary to obtain composite plants, making them ideal for transforming recalcitrant plant species. Moreover, transgenic root tissues can be generated in a matter of weeks. For Medicago truncatula, we can obtain transgenic roots in as short as three weeks, faster than normal floral dip Arabidopsis transformation. Overall, the hairy root composite plant technology is a versatile and useful tool to study gene functions and root related-phenotypes. Here we demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species M. truncatula.

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

We demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species Medicago truncatula.

Génération de plantes dans les composites Medicago truncatula Utilisées pour les dosages nodulation

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) ...

Recherche

Biologie

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

La Ex vivo Préparation isolé microvaisseaux squelettique pour les enquêtes de la réactivité vasculaire

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purification des relevés de notes et de métabolites<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution of efflux pumps from the Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa in a biomimetic environment that allows for an accurate investigation of their activity of transport. Three prerequisites are fulfilled: compartmentation in a lipidic environment, use of a relevant index for transport, and generation of a proton gradient. The membrane protein transporter is reconstituted into liposomes together with bacteriorhodopsin, a light-activated proton pump that generates a proton gradient that is robust as well as reversible and tunable. The activity of the protein is deduced from the pH variations occurring within the liposome, using pyranin, a pH-dependent fluorescent probe. We describe a step-by-step procedure where membrane protein purification, liposome formation, protein reconstitution, and transport analysis are addressed. Although they were specifically designed for an RND transporter, the described methods could potentially be adapted for use with any other membrane protein transporter energized by a proton gradient.

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

We present a protocol for the in vitro investigation of efflux pumps from Pseudomonas aeruginosa. This protocol allows for the generation of a robust, reversible, and tunable proton gradient within the liposome membrane and hence should be adaptable to any membrane protein energized by the protomotive force.

In vitro enquête de la pompe à efflux MexAB De Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

Synchronisation de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Des enquêtes sur le cycle cellulaire bactérienne

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Mesures de contractilité des muscles papillaires isolés sur pour l&#39;Investigation des inotropie cardiaque chez la souris

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

Étalonnage et utilisation des performances de microcoil MRM démontrés sur les racines de la truncatule Medicago à 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Préparation d’échantillons pour le profilage métabolique à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

Divergence du microbiote racinaire dans différents habitats sur la base de réseaux de corrélation pondérés

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...