Les auteurs tiennent à remercier Jeffrey Farrell, James Gagnon, et Jennifer Bergmann des commentaires sur le manuscrit. KWR a été soutenu par le Programme National Science Foundation Graduate Research Fellowship lors de l&#39;élaboration de l&#39;essai FDAP. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH à AFS et par des subventions de la Fondation allemande pour la recherche (programme Emmy Noether), la Société Max Planck, et le Programme Human Frontier Science (Career Development Award) à PM.

1. Création d&#39;un Fusion photoconvertible construire et d&#39;embryons de poissons zèbres Injecter dechorionated <ol><li> Générer une construction fonctionnelle contenant la protéine d&#39;intérêt fusionnée à une protéine du vert au rouge photoconvertible (voir Discussion), puis utilisez la transcription in vitro pour générer plafonné ARNm codant pour la protéine de fusion comme dans Müller et al., 2012 19. </li><li> Utilisez pronase pour enlever les chorions d&#39;environ 30 embryons de poisson zèbre au stade unicellulaire. Alternativement, dechorionate manuellement embryons en utilisant une pince 28. Remarque: Les embryons doivent être dechorionated pour l&#39;imagerie ultérieure. Si on le souhaite, les embryons peuvent être injectés à travers le chorion et dechorionated plus tard, juste avant l&#39;imagerie. <ol><li> Faire un ml de solution 5 mg / stock de pronase de Streptomyces griseus dans le milieu de embryon de poisson zèbre standard de 19. Roche doucement la solution à température ambiante pendant 10 min pour permettre à la protéase de se dissoudre. Aliquote 2 mL dans des microtubes et le gel à -20 ° C. </li><li> Transfert des embryons au stade de cellule unique à un verre d&#39;un diamètre de 5 cm ou boîte de Petri en matière plastique revêtue d&#39;agarose contenant ~ 8 ml de milieu d&#39;embryon. Ajouter 2 ml de solution décongelé pronase boursier à l&#39;antenne et incuber à température ambiante pendant 5 à 10 min. </li><li> Évitez d&#39;exposer les embryons à l&#39;air ou en plastique, que le contact avec soit provoquera embryons dechorionated la rupture. Remplissez un récipient en verre de 200 ml avec le milieu de l&#39;embryon. Transférer les embryons dans le bécher en inclinant la boîte de Pétri en plongeant dans le milieu. </li><li> Après les embryons se sont installés au fond du gobelet, versez plus de la moyenne de l&#39;embryon, puis versez moyen d&#39;embryons frais dans le bécher. Le tourbillonnant légère du milieu verser dans le bécher provoque embryons perdent leurs chorions affaibli. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.2.4. </li></ol></li><li> Transférer les embryons dechorionated dans un plat d&#39;injection agarose revêtu 29 en utilisant une pipette Pasteur en verre avec une pointe flammé. Flamboyantla pointe de la pipette empêche les contours crénelés des embryons blessant. </li><li> Co-injecter l&#39;ARNm et 3 kDa Alexa488-dextran conjugué 29,30 (figure 1B; voir discussion pour suggéré ARNm et les montants Alexa488-dextran). Injecter directement dans le centre de la cellule (et non le jaune) afin d&#39;assurer une distribution uniforme de l&#39;ARNm et une fois colorant fluorescent clivage commence. Remarque: Le signal Alexa488 sera utilisé lors de l&#39;analyse des données afin de générer des masques compartimentés afin de distinguer entre la fluorescence intracellulaire et extracellulaire. </li><li> Transfert embryons injectés à un puits d&#39;agarose revêtues 1-2% d&#39;un plat à six puits en plastique rempli avec le milieu de l&#39;embryon. Incuber dans l&#39;obscurité à 28 ° C jusqu&#39;à ce que les embryons ont atteint le stade de la sphère fin 31 (environ après la fécondation de 5 h). Vérifiez embryons chacun de deux heures sous un stéréomicroscope et enlever tous les débris générés par les embryons sont morts. </li></ol> 2. Montage embryons de poissons zèbres Photoconversion et imagerie sur un microscope confocal inversé <ol><li> Utilisez un stéréomicroscope pour identifier une à cinq embryons sains, et d&#39;utiliser une pipette Pasteur en verre avec une pointe flammé pour les retirer de l&#39;antenne. </li><li> Éjecter délicatement les embryons dans un tube à centrifuger contenant ~ 1 ml de fondu 1% agarose bas point de fusion dans un milieu d&#39;embryon de 1x Danieau (voir list des matériaux) (figure 2A). Remarque: Agarose doit avoir une température comprise entre 40 et 42 ° C; des températures plus élevées pourraient endommager les embryons. </li><li> Dessiner les embryons de retour dans la pipette avec quelques agarose. Éjecter délicatement l&#39;agarose et les embryons sur la vitre du couvercle d&#39;un plat à fond de verre (figure 2B). Se assurer que l&#39;épaisseur de la vitre de protection est compatible avec l&#39;objectif de microscope confocal. <ol><li> Re-utiliser la pipette de verre, si désiré. Pour nettoyer l&#39;agarose résiduel hors de la pipette et éviter le colmatage, rapidement milieu pipette d&#39;embryons de haut en bas.Placer un tube de 15 ml remplie de ~ 5 ml de milieu d&#39;embryon à côté du stéréomicroscope à cet effet. </li></ol></li><li> Utilisation d&#39;une sonde en métal pour positionner les embryons de sorte que le pôle animal (de blastoderme) fait face à la vitre de protection. Travaillez rapidement depuis l&#39;agarose se solidifie en 20-30 sec. Utilisez le stéréomicroscope pour surveiller les positions des embryons et réajuster si nécessaire jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose durcit. </li><li> Répétez les étapes 2.1 à 2.4 jusqu&#39;à ce que le nombre souhaité d&#39;embryons a été monté. Remarque: Dans une expérience typique, quatre gouttes agarose contenant quatre ou cinq embryons chacun se adaptera facilement sur le couvercle en verre. Environ 16 embryons peuvent être visualisés au cours d&#39;une seule expérience idéale (figure 2C). </li><li> Lorsque la gélose a solidifié, remplir la cuve à fond de verre avec du milieu de l&#39;embryon de 1x Danieau. </li></ol> 3. Photoconverting et mesure de la diminution de la Signal Photoconverted Un objectif 25X ou 40X eau is approprié à la taille et l&#39;indice de réfraction d&#39;embryons de poisson zèbre. Il est préférable d&#39;utiliser de l&#39;huile d&#39;immersion avec le même indice de réfraction que l&#39;eau plutôt que de l&#39;eau réelle, car l&#39;eau va se évaporer au cours de l&#39;expérience de cinq heures. Se assurer que l&#39;huile à immersion est conçu pour être utilisé avec une eau (pas d&#39;huile) objectif. <ol><li> Placez une grande goutte d&#39;huile d&#39;immersion sur l&#39;objectif de se assurer que le film d&#39;huile entre l&#39;objectif et le verre de couverture ne se cassera pas que la scène se déplace vers différentes positions de l&#39;embryon au cours de l&#39;imagerie. Fixer solidement le plat à fond de verre sur la scène de telle sorte que le plat ne passeront pas si les coups de théâtre. Si possible, utilisez un stade chauffé à 28 ° C, la température optimale pour le développement du poisson zèbre. </li><li> Définir la position de chaque embryon dans le logiciel du microscope confocal. Réglez la profondeur z pour chaque embryon, et tenter de cibler à peu près le même plan dans chaque embryon. Remarque: Environ 30 pm du pôle animal est un allerod profondeur depuis à cette profondeur de la couche enveloppante de l&#39;embryon peut être évitée, zone d&#39;imagerie est maximisée, et diffusion de la lumière est minime. Une tranche optique unique avec une épaisseur de 3,3 um ~ fournit suffisamment de données; il ne est pas nécessaire d&#39;acquérir un z-pile (voir la section 5). </li><li> Recueillir deux signaux au cours de l&#39;expérience: le signal &quot;vert&quot; de l&#39;Alexa488-dextrane conjugué, qui sera utilisé lors de l&#39;analyse des données d&#39;isoler extracellulaire et intracellulaire par fluorescence et le signal &quot;rouge&quot; de la protéine de fusion après son photoconverted. <ol><li> Excite Alexa488 utilisant un laser de 488 nm, et de recueillir fluorescence émise entre ~ 500 et 540 nm. Remarque: Après photoconversion, beaucoup vert au rouge protéines photoconvertible (par exemple, Dendra2) peut être excité avec un laser 543 nm et émettent fluorescence entre ~ 550 et 650 nm. Réglez si nécessaire en fonction de la protéine photoconvertible utilisé. </li></ol></li><li> Acquérir &quot;pré-photoconversion&quot;Images, et de configurer le logiciel du microscope confocal à l&#39;image de chacune des positions précédemment définies (de l&#39;étape 3.2) avec les conditions d&#39;imagerie appropriés tous les 10 ou 20 minutes pour un cours de temps de cinq heures (voir la section 5 et Discussion). </li><li> Pour photoconvert la protéine de fusion, passer à un objectif 10X et d&#39;exposer des groupes d&#39;embryons à la lumière UV provenant d&#39;une lampe à vapeur de mercure avec un filtre ~ 300-400 nm d&#39;excitation à la sortie de 100% pendant 2 min. Détourner l&#39;attention long de l&#39;axe z pour promouvoir photoconversion uniforme (voir la section 5). Assurez-vous que l&#39;huile d&#39;immersion ne coule pas sur l&#39;objectif 10x lors de photoconversion. Remarque: Le déplacement de mise au point pendant photoconversion pourrait être automatisé afin d&#39;éviter la variabilité des expérimentateurs. </li><li> Revenez à l&#39;objectif 25X ou 40X immédiatement après photoconversion. Veiller à ce que les positions définies précédemment de l&#39;étape 3.2 sont toujours exactes. Si le plat déplacé pendant photoconversion, re-définir les positions des embryons. <ol><li> Démarrez le programme créé à l&#39;étape 3.4 et permet l&#39;imagerie de continuer pendant 5 heures. Noter le temps écoulé entre le début et photoconversion de formation d&#39;image pour chaque embryon. </li></ol></li><li> Vérifiez de temps sur l&#39;expérience. Surveiller le niveau de milieu de Danieau et ajouter plus si nécessaire. Redémarrez le logiciel se il est en panne. </li><li> Afin de déterminer les valeurs de fluorescence de fond qui seront utilisés au cours de l&#39;analyse des données pour estimer l&#39;asymptote un modèle de décroissance exponentielle, inclure des embryons qui ont été injectés avec Alexa488-dextrane mais non l&#39;ARNm dans l&#39;expérience. Afin de déterminer le bruit de l&#39;instrument, qui sera également utilisé au cours de l&#39;analyse des données ultérieur, acquérir une image en l&#39;absence d&#39;un échantillon. </li></ol> 4. Analyser les données en utilisant PyFDAP <ol><li> Inspecter visuellement le temps des ensembles de données de cours de chaque embryon. Jeter ensembles de données à partir d&#39;embryons morts durant imagING, qui a déplacé de manière significative, qui ont de très faibles niveaux de signaux photoconverted, ou qui contiennent des régions de cellules qui ressemblent inhabituel et ont cessé de bouger et en divisant (typique d&#39;embryons blessés ou malades). Remarque: Parfois, des bulles dans l&#39;huile d&#39;immersion ou d&#39;autres artefacts apparaissent dans une ou deux images dans un ensemble de données autrement utilisable. Notez toutes les images qui contiennent des artefacts; ils seront rejetées plus tard, et les points de temps restants de cet ensemble de données peuvent être analysées. </li><li> Utilisez le logiciel PyFDAP en Python pour analyser les données FDAP. PyFDAP calcule la demi-vie en déterminant l&#39;intensité de fluorescence intracellulaire et extracellulaire rouge moyen dans chaque image et d&#39;ajustement des données avec une fonction décroissante de façon exponentielle 56 (figure 3). <ol><li> Télécharger PyFDAP (voir Liste des matériaux). </li><li> Utilisation PyFDAP pour séparer le signal intracellulaire et extracellulaire photoconverted (figure 3A, B). Nouse le signal Alexa488, qui est strictement intracellulaire, pour créer un masque intracellulaire. Appliquez ce masque à l&#39;image du canal de rouge correspondant à éviter pixels intracellulaires d&#39;être considérés lors du calcul de l&#39;intensité moyenne extracellulaire. Pour mesurer l&#39;intensité intracellulaire moyenne, inverser le masque. </li><li> Dans PyFDAP, afficher les images masqués générés à l&#39;étape 4.2.2. Inspecter visuellement ces images et jeter des ensembles de données dans laquelle masques ne distinguent pas exactement intracellulaire de l&#39;espace extracellulaire (ce devrait être rare; noter que les membranes cellulaires sont inclus dans des images où l&#39;espace extracellulaire a été masqués, mais ils pourraient être supprimés en modifiant le seuil algorithme ou en introduisant un masque de membrane (par exemple, en utilisant une membrane-PCP)). Écartent également toute simples images contenant des objets (par exemple, des bulles dans l&#39;huile d&#39;immersion) identifiés dans l&#39;étape 4.1. </li><li> Utilisez PyFDAP pour calculer les intensités de fluorescence extracellulaires et intracellulaires moyennes pour each image. PyFDAP ces moyennes calcule en additionnant les intensités des pixels qui tombent à l&#39;extérieur du masque et en divisant par le nombre total de pixels additionnés. </li><li> Monter les données de fluorescence (figure 3C) avec la fonction exponentielle suivante: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" /> où t est le temps post-photoconversion, c (t) est l&#39;intensité à une valeur donnée de t, c 0 est l&#39;intensité à l&#39;instant t = 0, k est le taux de clairance constante, et y 0 est l&#39;asymptote que la fonction se approche en tant que fluorescence diminue (figure 1D). y 0 peut être limitée en fonction des mesures de l&#39;étape 19 3,8. </li><li> Utilisation PyFDAP pour calculer les protéines extracellulaires et intracellulaires des demi-vies (τ) à partir des constantes de vitesse de dégagement (k) à l&#39;aide de la relation suivante: <img fo:content-width = &quot;1 pouce&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52266 / 52266eq2.jpg&quot; width = &quot;153&quot; /&gt; </li></ol></li></ol> 5. Les expériences de contrôle pour évaluer Photoblanchiment, par inadvertance Photoconversion et Photoconversion Uniformité <ol><li> Photoblanchiment évaluer Remarque: Le photoblanchiment peut provoquer une diminution artéfactuelle l&#39;intensité de fluorescence qui reflète les propriétés de blanchiment de la protéine fluorescente, en plus de la clairance de la protéine d&#39;intérêt. <ol><li> Pour évaluer d&#39;éventuelles photoblanchiment, effectuer une série d&#39;expériences FDAP avec des intervalles de 10 min entre l&#39;imagerie et un deuxième ensemble avec des intervalles de 20 min entre imagerie (figure 4). Analyser les données des deux séries d&#39;expériences utilisant PyFDAP comme décrit à la section 4. </li><li> Comparer les demi-vies des expériences 10 et 20 de l&#39;intervalle min. Plus longue demi-vie de 20 min d&#39;intervalle expériences indiquent photoblanchiment significative. Si les demi-vies des deux expériences sont identiques, photobleaching ne est pas une préoccupation importante. </li><li> Alternativement, d&#39;évaluer photoblanchiment en acquérant une série de ~ 30 images immédiatement après photoconversion. Une diminution significative de l&#39;intensité de fluorescence indique photoblanchiment significative. </li><li> Si photoblanchiment est détectée, utiliser la puissance du laser inférieure, diminuer le temps d&#39;imagerie, ou envisager d&#39;utiliser une protéine photoconvertible plus photostable 32. </li></ol></li><li> Évaluation photoconversion par inadvertance. Remarque: Dendra2 peut être photoconverted utilisant 488 nm éclairage 27. Lorsque excitant Alexa488 avec le laser 488 nm comme décrit dans l&#39;étape 3.3.1, photoconversion par inadvertance et donc une augmentation artéfactuelle dans la demi-vie apparente de la protéine d&#39;intérêt est possible. Cependant, nous et d&#39;autres avons constaté que 33 488 ​​nm éclairage est une méthode inefficace de photoconversion dans embryons de poisson zèbre. <ol><li> Utilisez l&#39;expérience de contrôle décrit à l&#39;étape 5.1.1 pour détecter photoconversion par inadvertance. Comparer les demi-vies des expériences 10 et 20 de l&#39;intervalle min. Courtes demi-vies de 20 min d&#39;intervalle expériences indiquent photoconversion inadvertance significative. Si les demi-vies des deux expériences sont identiques, photoconversion par inadvertance ne est pas une préoccupation importante. </li><li> Si par inadvertance photoconversion est détectée, utiliser une puissance laser de 488 nm inférieure et la réduction des temps d&#39;imagerie pour éviter par inadvertance photoconverting Dendra2. </li></ol></li><li> Évaluation photoconversion uniformité. Remarque: Si photoconversion est sollicité vers le pôle animal de l&#39;embryon, la diminution de la fluorescence sera influencée par la diffusion de la protéine ou le mouvement des cellules dans des plans plus profondes (Figure 5A). <ol><li> Pour déterminer si photoconversion est uniforme, exprimer une protéine sécrétée photoconvertible (pour des expériences avec des protéines de fusion extracellulaires) ou une protéine cytoplasmique photoconvertible (pour des expériences avec des protéines de fusion intracellulaires). Photoconvert comme d&#39;habitude, tpoule acquièrent un z-stack englobant la plupart des blastoderme toutes les 20 minutes pendant 80 min. </li><li> Si photoconversion est sollicité vers le pôle animal, l&#39;intensité de fluorescence dans des plans profonds va augmenter au cours du temps due à la diffusion ou le mouvement des cellules (figure 5B). Si non uniforme photoconversion est détecté, se concentrer plus profondément dans les embryons au cours photoconversion. </li></ol></li></ol>

Les auteurs ne ont aucun conflit de divulguer.

Le succès d&#39;une expérience FDAP repose sur la génération d&#39;une protéine de fusion photoconvertible fonctionnel. Une protéine de marquage peut affecter son activité biologique et / ou les propriétés biophysiques, y compris sa localisation, la solubilité, la stabilité et 36 à 41. Soyez prêt à tester l&#39;activité de plusieurs différentes constructions de fusion afin de trouver celui qui est actif. Nous avons trouvé que la modification de la position de la protéine photoconvertible par...

Les niveaux de protéines dans des cellules et des organismes sont déterminés par leurs taux de production et de dégagement. Protéines demi-vie peut varier de quelques minutes à 1-4 jours. Dans de nombreux systèmes biologiques, la stabilisation ou la clairance de protéines clés a des effets importants sur l&#39;activité cellulaire. La modulation de stabilité de la protéine intracellulaire est nécessaire pour la progression du cycle cellulaire de 5,6, la signalisation du développement 7-9, 10 l&#39;apoptose, et la fonction normale et le maintien des neurones 11,12. La stabilité des protéines extracellulaires affecte la distribution et la disponibilité des protéines sécrétées, telles que 13,14 morphogènes, dans un tissu. Au cours des dernières décennies, la stabilité des protéines a été évaluée principalement dans la culture de cellule à l&#39;aide d&#39;impulsions marquage radioactif ou d&#39;expériences de chasse cycloheximide 15. Dans ces expériences pulse-chase, les cellules sont soit transitoirement exposées à un «pouls» de aminés radioactifsprécurseurs acides qui sont incorporés dans des protéines nouvellement synthétisées, ou ils sont exposés à la cycloheximide, qui inhibe la synthèse des protéines. Les cellules cultivées sont ensuite recueillies à différents points dans le temps, ainsi que d&#39;une immunoprécipitation suivie d&#39;une autoradiographie (en radioactives expériences pulse-chase) ou western blot (dans des expériences de cycloheximide) est utilisé pour quantifier la clairance de la protéine au fil du temps. Classiques tests de stabilité des protéines présentent plusieurs inconvénients. Tout d&#39;abord, les protéines dans ces dosages sont souvent pas exprimées dans leurs environnements endogènes, mais plutôt dans une culture tissulaire et parfois dans des cellules provenant d&#39;espèces différentes. Pour les protéines dont la stabilité dépend du contexte, cette approche est problématique. Deuxièmement, il ne est pas possible de suivre la clairance de la protéine dans des cellules ou des organismes individuels au cours du temps, et les données provenant de ces essais reflète une moyenne de différentes populations de cellules à différents points dans le temps. Depuis cellules individuelles peuvent avoir commencéavec différentes quantités de protéines, peut avoir pris l&#39;étiquette ou cycloheximide radioactifs à des moments différents, ou peuvent avoir différents cinétique d&#39;élimination, ces données agrégées peuvent être trompeuses. Enfin, dans le cas d&#39;expériences de chasse cycloheximide, l&#39;addition de l&#39;inhibiteur de la synthèse des protéines peut avoir des effets physiologiques non désirées qui pourraient modifier artificiellement la stabilité des protéines de 16 à 18. Ces lacunes peuvent être évités en utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP), une technique qui utilise des protéines photoconvertible pour mesurer la clairance de la protéine dynamiquement dans les organismes vivant 19-25 (voir Discussion des limitations de la technique FDAP). Photoconvertible protéines sont des protéines fluorescentes dont excitation et d&#39;émission propriétés changer après une exposition à des longueurs d&#39;onde spécifiques de la lumière 26. Une variante couramment utilisé est Dendra2, une protéine &quot;vert au rouge» photoconvertible qui a initialement excitations et d&#39;émission des propriétés similaires aux protéines fluorescentes vertes, mais après une exposition à &quot;la photoconversion&quot; de -son excitation UV / propriétés d&#39;émission deviennent semblables à celles des protéines fluorescentes rouges 23,27. Surtout, nouvelle protéine produite après photoconversion ne aura pas les mêmes propriétés d&#39;excitation / émission que la protéine photoconverted, permettant découplage de la production et de la clairance à la photoconversion et l&#39;observation de seulement une piscine de protéines photoconverted. Marquage des protéines d&#39;intérêt avec des protéines photoconvertible fournit ainsi un moyen pratique d&#39;impulsion-étiquette protéines dans les organismes vivants intacts, optiquement accessibles. Dans les dosages de FDAP (Figure 1A), une protéine d&#39;intérêt est marquée avec une protéine photoconvertible et exprimé dans un organisme vivant (figure 1B). La protéine de fusion est photoconverted, et la diminution du signal photoconverted cours du temps est suivie par fluorescenMicroscopie CE (figure 1C). Les données sont ensuite équipé d&#39;un modèle approprié pour déterminer la demi-vie de la protéine de fusion (Figure 1D). Le dosage FDAP décrit ici a été conçu pour déterminer les demi-vies extracellulaires de protéines de signalisation sécrétées dans embryons de poisson zèbre au début de l&#39;embryogenèse 19. Cependant, cette approche peut être adapté à tout organisme modèle transparent qui tolère l&#39;imagerie en direct, et pourrait être utilisé pour surveiller le jeu de toute protéine intracellulaire ou extracellulaire tagable. Variations de la technique décrite ici ont été réalisées dans des cellules cultivées 20,23 et 22 drosophile et la souris 21 embryons.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic dish (BD Falcon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injecting and mounting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Danieau&#39;s medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau&#39;s medium: add 200 mg to 20 ml Danieau&#39;s medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 &#176;C, re-melted at 70 &#176;C, and cooled to 40 - 42 &#176;C when ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For positioning embryos during mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &#176;C during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal software capable of time-lapse imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x or 40x water objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x air objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for photoconversion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil with the same refractive index as water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)

la stabilité des protéines influence de nombreux aspects de la biologie, et de mesurer la cinétique de libération de protéines peut fournir des informations importantes sur les systèmes biologiques. Dans les expériences FDAP, la clairance de protéines dans les organismes vivants peut être mesurée. Une protéine d&#39;intérêt est marquée avec une protéine fluorescente photoconvertible, exprimée in vivo et photoconverted, et la diminution du signal dans le temps photoconverted est surveillée. Les données sont ensuite muni d&#39;un modèle d&#39;autorisation approprié pour déterminer la demi-vie de la protéine. Fait important, la cinétique de libération des populations de protéines dans les différents compartiments de l&#39;organisme peuvent être examinées séparément en appliquant des masques à compartiments. Cette approche a été utilisée pour déterminer les demi-vies intra- et extracellulaires de protéines de signalisation sécrétées pendant le développement du poisson zèbre. Ici, nous décrivons un protocole pour des expériences FDAP dans embryons de poisson zèbre. Il devrait être possible d&#39;utiliser FDAP pour déterminer la cinétique de libération detoute protéine tagable dans tout organisme optiquement accessible.

FDAP a été utilisé pour déterminer la demi-vie de protéines de signalisation extracellulaires dans 19 embryons de poisson zèbre. Une de ces protéines, strabisme, induit l&#39;expression de gènes de 34 mesendodermal cours de l&#39;embryogenèse. Squint-Dendra2 active l&#39;expression des gènes de mesendodermal à des niveaux similaires à untagged Squint, comme démontré par qRT-PCR et l&#39;hybridation in situ 19 essais. Les embryons sont co-injectés avec Alexa488-dex...

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Les teneurs en protéines dans les cellules et les tissus sont souvent étroitement réglementées par l&#39;équilibre de la production de protéines et de dégagement. En utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP), la cinétique de dégagement de protéines peuvent être mesurées expérimentalement in vivo.

Mesure de la stabilité des protéines dans le salon embryons de poissons zèbres en utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

measuring-protein-stability-living-zebrafish-embryos-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

11.1K vues.  Harvard University.  Les teneurs en protéines dans les cellules et les tissus sont souvent étroitement réglementées par l'équilibre de la production de protéines et de dégagement. En utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP), la cinétique de dégagement de protéines peuvent être mesurées expérimentalement in vivo. 

Vidéo: Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Blessure mécanique des bateaux dans embryons de poissons zèbres

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Recherche

Biologie du développement

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Biosensing Potentiel de membrane de neurones moteurs dans les embryons vivants de zébrés

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Feuille à base de lumière de la vie Microscopie Fluorescence ou fixe et Stained<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embryons

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Induction de l&#39;hypoxie dans les écrevisses vivantes de grenouille et de poisson zèbre

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Mouvements de tissu endocardique suivant via Photoconversion de cellules dans l’embryon de poisson zèbre

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualiser le cerveau en développement dans le poisson zèbre vivant à l’aide de Brainbow et Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...