Ce produit est optimisé pour niveler les protéines avec l’étiquette de protéine de fluorescence, et pour visualiser l’emplacement et l’expression de la protéine d’un individu de laboratoire intéressant de poisson zèbre. Il est particulièrement utile pour l’imagerie de protéines exprimées en faible abondance. Notre méthode simplifie et accélère le processus de construction des donateurs.
Ces composants, à l’exception du CDS, sont intégrés à l’épine dorsale au préalable. Le donneur a également été optimisé pour augmenter l’efficacité. Le flux de travail de l’écran de transmission accumule des noyaux héréditaires au moindre coût de temps et d’efforts.
Le poisson-zèbre est l’organisme modèle largement utilisé dans la recherche sur l’infection et l’immunité. Nous nous intéressons particulièrement aux mécanismes sous-jacents à la septicémie. Comme nous sommes maintenant capables de faire du marquage par fluorescence facilement en utilisant notre protocole, nous allons essayer de marquer une image, des protéines de septicémie et des cellules chez le poisson zèbre.
Pour commencer, placez une femelle poisson-zèbre en bonne santé et deux poissons-zèbres mâles en bonne santé dans un bassin d’accouplement. Utilisez un séparateur pour séparer les mâles des femelles afin de les préparer à l’accouplement. Le jour de la micro-injection, préparez le mélange de micro-injection sur de la glace dans un environnement sans RNase.
À l’aide d’une pointe de pipette sans Rnase, chargez la solution de micro-injection dans l’aiguille. Placez l’aiguille chargée dans un micromanipulateur attaché à un micro-injecteur. Au microscope, à l’aide d’une pince à épiler pointue, coupez la pointe de l’aiguille en la pinçant doucement jusqu’à ce qu’elle se brise.
Ajustez la pression d’injection jusqu’à ce que l’aiguille éjecte constamment une gouttelette d’un nanolitre. Ensuite, retirez le séparateur de la cuve d’accouplement et laissez le poisson se reproduire pendant six minutes. Prélever et transférer les embryons au stade d’une cellule dans une boîte de Pétri contenant un tampon embryonnaire.
Examinez la santé des embryons au microscope optique et retirez les ovules ou les débris non fécondés. Réservez 20 embryons sains dans une boîte de Pétri distincte en tant que témoins non injectés, et étiquetez la boîte. À l’aide d’un petit pinceau, transférez et alignez doucement des embryons sains au stade d’une cellule sur les rainures d’une plaque de micro-injection chauffée à température ambiante.
Retirez l’excédent de tampon de la plaque. À l’aide d’une pointe d’aiguille, ajustez doucement la position de chaque embryon de manière à ce que le pôle de l’animal fasse face à l’aiguille. Injectez un nanolitre de la solution mélangée dans le poteau de l’animal.
Après l’injection, rincez doucement les embryons dans une plaque à 6 puits avec tampon pour embryons. Placez la plaque dans un incubateur à température constante de 28,5 degrés Celsius. 10 heures après la fécondation, examinez le développement embryonnaire au microscope stéréoscopique et retirez les embryons morts.
24 heures après la fécondation, collectez les embryons dans des tubes de 1,5 millilitre pour le génotypage et jetez soigneusement l’eau supplémentaire. Ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse contenant de la protéinase K dans chaque tube. Incuber les tubes à 56 degrés Celsius pendant une heure, puis à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Après l’incubation, ajoutez 200 microlitres d’éthanol et mélangez bien. Centrifugez le tube à 19 000 G pendant 10 minutes et jetez le surnageant avant de remettre en suspension le granulé avec 500 microlitres d’éthanol à 70 %. Centrifugez à nouveau et faites sécher la pastille à l’air libre avant de la dissoudre dans 50 microlitres d’eau double distillée.
Utilisez un microlitre de l’extrait pour préparer le mélange réactionnel pour la PCR. Après la PCR, analysez des gels d’agarose avec deux microlitres de produits PCR pour confirmer la réussite de l’amplification. Effectuer une digestion enzymatique pour évaluer l’efficacité des ARNsg.
Mélangez délicatement la solution de digestion et incubez à température ambiante, en suivant les instructions du fabricant. Exécutez des gels d’agarose pour les produits digérés avec des contrôles PCR non digérés pour confirmer la digestion. Pour analyser l’efficacité de l’ARNsg, ouvrez le site Web TIDE et cliquez sur Démarrer TIDE.
Entrez la séquence guide de l’ARNsg dans le cadre de la séquence guide. Cliquez sur Parcourir pour télécharger le résultat de séquençage de la commande de type sauvage dans le champ de chromatogramme de l’échantillon de contrôle. De même, téléchargez le résultat du séquençage de l’échantillon modifié dans le champ du chromatogramme de l’échantillon de test.
Cliquez sur Mettre à jour la vue pour analyser les résultats. Pour commencer, utilisez le clonage indépendant de la ligature ou LIC avec l’exonucléase III pour construire le plasmide donneur. Concevez l’amorce F1 avec une séquence qui se chevauche avec l’élément vectoriel 1 et une partie de l’élément 2.
Concevez l’amorce R2 avec une partie de l’élément 1, de l’élément 2 et de l’élément 3. Concevez l’amorce F2 pour inclure les éléments 3 et 4, ainsi que la séquence 5 premières du CDS suivant le site cible de l’ARNsg. Concevez l’apprêt R1 avec les trois séquences principales de la séquence de revêtement et une séquence de chevauchement avec le vecteur.
Utilisez le CDNA de poisson-zèbre comme modèle et effectuez une PCR avec les amorces conçues. Purifier les produits PCR à l’aide d’une précipitation d’éthanol. Digérer le vecteur donneur avec des enzymes de restriction telles que pCI et Acc65I, et purifier le vecteur donneur digéré.
Quantifiez les fragments de PCR purifiés et le vecteur donneur digéré à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’ADN. Ensuite, préparez le mélange LIC avec le vecteur donneur purifié et incubez sur de la glace pendant 60 minutes. Ajoutez un microlitre d’EDTA 0,5 molaire pour arrêter la réaction.
Pipette de haut en bas pour mélanger la solution. Incuber le mélange réactionnel à 60 degrés Celsius pendant cinq minutes. Refroidissez les produits LIC sur de la glace.
Ensuite, transformez les cellules compétentes DH5-Alpha à l’aide de produits LIC. Placez les cellules transformées sur des plaques Luria-Bertani contenant l’ampicilline et cultivez-les pendant 16 heures. Après l’incubation, choisissez des colonies uniques dans les plaques LIC pour l’analyse de la digestion enzymatique et le séquençage de l’ADN.
Extrayez et purifiez les plasmides du donneur à l’aide d’un kit de purification. Injectez des embryons de poisson-zèbre avec un mélange de micro-injection pour le gène 12 à 48 heures après la microinjection, sous un microscope à stéréofluorescence, observez la fluorescence des larves de poisson-zèbre. À l’aide d’une méthode de dépistage établie, sélectionnez les larves fluorescentes et élevez-les séparément.
À l’âge d’un mois, prélevez un petit morceau de la nageoire de cajole de chaque poisson-zèbre anesthésié dans un tube PCR étiqueté. Placez le poisson-zèbre anesthésié correspondant dans une plaque à 6 puits remplie d’eau filtrée stérilisée aux UV correspondant à l’étiquette sur le tube. Extraire l’ADN génomique à l’aide de la méthode de lyse alcaline.
Concevez une amorce avant en amont du bras d’homologie gauche et une amorce inversée sur l’insert. Effectuez une PCR, en ciblant les cinq jonctions premières de la séquence. Examiner les embryons F1 obtenus en accouplant le poisson-zèbre F filtré avec du poisson zèbre de type sauvage pour les modèles d’expression de la GFP.
Génotypez les embryons F1 à l’aide de la PCR de jonction. Une fluorescence spécifique héréditaire a été observée dans les muscles de toute la descendance F1, indiquant que le marquage GFP du connexon 39.9 a été réussi. Une fluorescence spécifique héréditaire a été détectée dans le cristallin de toute la descendance F2, ce qui suggère que le marquage mCherry du connexon 44.1 a réussi.
Le cognement correct des connexons 39.9 et 44.1 a été vérifié par des réactions en chaîne par polymérase de jonction.
