Le plasmide exprimant pCG001 Ubp1 a été aimablement fourni par Rohan Baker à l&#39;École de gestion John Curtin de la recherche médicale. Ce travail a été financé par Mars des dix sous de subvention de recherche de 1 exercice 2011, Mars of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Award de bourses de recherche n ° 5-FY20 et d&#39;attribution de la NSF CAREER 0746796.

1. Souche Ingénierie flux de travail <ol><li> Insérer séquences codant pour (a) une séquence de localisation membranaire, (b) une protéine de maturation rapide fluorescent et (c) une séquence de reconnaissance de protéase N-terminale à et en phase avec une protéine d&#39;intérêt (par exemple un facteur de transcription). Nous avons utilisé la membrane cible Tsr-Vénus reporter 2 et fusionnée à la séquence de reconnaissance de protéase ubiquitine (Ub) pour compter le nombre de bactériophage λ exprimées répresseur CI molécules de protéines. Détails sur la façon dont nous avons construit la protéine de fusion Tsr-Vénus-Ub-CI, en remplaçant le type sauvage CI région codante et en intégrant la construction dans la E. chromosome coli en utilisant λ Rouge recombinaison 3, sont décrits en détail dans la référence. 1. </li><li> Vérifiez toutes les modifications par séquençage. </li><li> Transformer un plasmide codant pour une protéase spécifique de la séquence de reconnaissance utilisé ci-dessus dans une souche exprimant la protéine rapporteur fluorescent et d&#39;intérêten fusion traductionnelle. Nous avons utilisé la protéase Ubp1, qui clive immédiatement après le résidu C-terminal de l&#39;ubiquitine 4. </li></ol> 2. Les cellules de la Culture et préparer l&#39;échantillon <ol><li> Choisissez un E. coli colonie d&#39;intérêt à partir d&#39;une plaque de gélose fraîchement striée en 1 ml médias M9 minimum 5 complété avec des acides aminés et MEM 1X antibiotiques appropriés. Incuber dans un shaker à la température désirée assez long pour atteindre OD 600&gt; 1,0 (densité optique à 600 nm). </li><li> Diluer la culture dans 1 ml de milieu M9 frais avec des antibiotiques appropriés à DO600 = 0,02. Incuber dans un shaker à la température appropriée. Densité cellulaire initiale peut être augmentée si nécessaire à la croissance à basse température. </li><li> Lorsque la DO 600 = 0,2 à 0,3 (à 37 ° C avec une culture cellulaire initiale à DO600 = 0,02, cela prendra 3-4 heures), commencer à préparer le gel d&#39;agarose tampon (étape 3). </li><li> Les cellules sont prêtes pour l&#39;imagerie lorsque OD <sub&gt; 600 = de 0.3 à 0.4. </li><li> Transférer 1 ml de culture incubé dans un tube de 1,5 ml, centrifuger à 10.000 xg pendant 1 min dans une centrifugeuse de paillasse. </li><li> Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de milieu frais M9 et remettre en suspension le culot doucement. </li><li> Centrifuger à 10000 g pendant 1 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 1,6 et 1,7. Jeter le surnageant. </li><li> Resuspendre doucement dans 1 ml de milieu M9. Les cellules peuvent être directement utilisés pour l&#39;imagerie microscope ou 10 diluée - à 100 fois pour garantir de faibles densités cellulaires pour l&#39;imagerie timelapse. Notez que de faibles densités cellulaires sont importantes pour l&#39;imagerie timelapse prolongée. La chambre de formation d&#39;image (étape 4) est rendue étanche lors de l&#39;expérience. En raison de la croissance exponentielle des cellules, les concentrations cellulaires initiales élevées peuvent sensiblement épuiser l&#39;oxygène à l&#39;intérieur de la chambre de croissance après prolongée dans le tampon de gel, ce qui réduit la maturation des protéines fluorescentes et affecter la croissance des cellules. </li></ol> 3. Préparer la solution d&#39;agarose <ol><li> Peser 10-20 mgà faible température de fusion d&#39;agarose dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter le volume de milieu minimal M9 sans antibiotiques pour faire une solution à 3% d&#39;agarose. </li><li> Chauffer la solution d&#39;agarose pendant 30 min à 70 ° C pour faire fondre, retournant le tube pour que la solution soit complètement fondu et homogène. Le tampon de gel peut être versé à ce moment (étape 4) ou de la température peut être réduite à 50 ° C et maintenu pendant plusieurs heures pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 4. Préparer Pad Gel sur la chambre <ol><li> Environ 50 min avant l&#39;imagerie, rincer une diapositive Microaqueduct avec de l&#39;eau. </li><li> Rincé une nettoyés couvercle en verre (en utilisant une méthode de nettoyage strictes telles que celle décrite dans 6) et Microaqueduct diaporama avec de l&#39;eau stérile et sécher par soufflage à l&#39;air comprimé. </li><li> Placer le joint d&#39;étanchéité en caoutchouc sur la lame Microaqueduct de manière à recouvrir les orifices d&#39;entrée et de sortie sur le côté de la lame de verre Microaqueduct (ceci peut être modifié pour des applications dansles supports qui sont perfusés à travers l&#39;échantillon). Appliquer 50 ul de solution d&#39;agarose (étape 3) au centre de la diapositive Microaqueduct. </li><li> Haut de la solution d&#39;agarose avec le nettoyage, couvercle en verre sec. </li><li> Laissez la solution d&#39;agarose reposer à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Pendant ce temps, préparer un échantillon de cellules (étape 2). </li><li> Soigneusement détacher la vitre de protection de la partie supérieure du tampon de gel. Ajouter 1,0 ul de culture cellulaire lavée vers le haut de la poche de gel. Attendre ~ 2 min pour la culture d&#39;être absorbée par le tampon de gel. Il est important de ne pas attendre aussi longtemps que les overdries coussin de gel, mais suffisamment longue pour que les cellules sont correctement respectées le coussin de gel. Le temps d&#39;attente Idéal varie selon la température et de l&#39;humidité. </li><li> En attendant, une autre sécher couvercle en verre préalablement nettoyé. </li><li> Couverture de l&#39;échantillon avec la nouvelle vitre de protection en sorte que le verre de protection et Microaqueduct coulisseau sont bien alignés. </li><li> Assemblez la chambre de croissance à température contrôlée suivant les instructions du fabricant.Il peut maintenant être utilisé pour l&#39;imagerie de microscope (étape 5). </li></ol> 5. Imagerie et acquisition de films Timelapse <ol><li> Allumez le laser et du microscope en suivant les instructions du fabricant (par exemple, le laser peut être nécessaire de réchauffer pour ~ 0,5 h avant l&#39;expérience). </li><li> Verrouiller la chambre assemblé à l&#39;insert de phase sur le microscope. Régler la température de la chambre de croissance et le chauffe-objectif à 37 ° C ou autre température de croissance souhaitée. </li><li> Si l&#39;imagerie dessus de la température ambiante, la mise au point ou coussin de gel est généralement dériver de façon significative pour ~ 15 min après le changement de température initiale. Dans la pratique, utiliser ce temps pour trouver des régions d&#39;intérêt et modifier des scripts d&#39;imagerie que nécessaire pour une expérience. </li><li> Trouver des cellules sur le microscope et stocker la position de chaque cellule après son centrage à l&#39;intérieur d&#39;une région d&#39;imagerie prédéfinie et alignés. Plus d&#39;une cellule peut être imagé dans chaque fenêtre de temps d&#39;acquisition d&#39;image. Pour plus timelapse imagerie mdes générations, en sorte que les cellules de représentation sont initialement séparés à partir d&#39;autres cellules par au moins quelques centaines de micromètres de telle sorte que les autres colonies n&#39;entrera pas dans la région de formation d&#39;image en cours de croissance. </li><li> Réglez l&#39;intensité d&#39;excitation laser de sorte que la quasi-totalité des molécules fluorescentes photoblanchiment dans les 6 expositions (figure 5). </li><li> Utilisation d&#39;un script automatisé d&#39;imagerie / journal, l&#39;acquisition de données timelapse en utilisant l&#39;algorithme décrit dans le flux de travail expérimental sur la figure 3. </li></ol>

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	<li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis.">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li><li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells,+One+Protein+Molecule+at+a+Time.">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li><li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).</li><li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+gene+expression+in+living+cells+at+the+single-molecule+level.">Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level.</a> Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).</li><li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects.">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li><li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+in+bacteria.">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li></ol>

Nous n&#39;avons pas d&#39;autres informations.

La méthode COTRAC peuvent être généralisés à mesurer la production d&#39;autres protéines où N-ou C-terminaux conventionnels fusions de protéines fluorescentes peuvent perturber l&#39;activité des protéines. La stratégie COTRAC a trois avantages uniques par rapport aux méthodes actuelles. Tout d&#39;abord, co-traductionnelle de fusion assure une molécule de rapporteur fluorescent est le produit pour chaque molécule de la protéine d&#39;intérêt, ce qui permet un comptage précis de la production de prot...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Agarose (température de fusion basse) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × sels M9 </td><td></td><td></td><td> Recette suivante décrit en 9 </td></tr><tr><td> Glucose à 20% </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 x solution d&#39;acides aminés MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> À température contrôlée croissanceChambre Adaptateur étape </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> Chauffage objectif </td><td> Bioptechs </td><td> Modèle dépend de l&#39;objectif de microscope </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct Diaporama </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Verrres micro </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Peuvent être difficiles à trouver; également disponible à partir Bioptechs </td></tr><tr><td> Couverture en verre / coulissant joint </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 mm </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Divers </td><td> Exemple de configuration: Coherent Innova 308C laser argon-ion, Olympus IX-81 microscope, Olympus Planapo 100X NA 1,45 objective, Metamorph logiciel </td><td> Doit avoir une excitation laser, automatisé xyz stade, le logiciel d&#39;automatisation capable de l&#39;imagerie scénarisé et autofocus, optique capables de résolvineg protéines fluorescentes simples </td></tr><tr><td> EM-CCD de la caméra </td><td> Divers </td><td> Exemple de configuration: Andor Ixon DU-898 </td><td> Doit avoir un bruit suffisamment faible pour détecter simples protéines fluorescentes dessus du fond </td></tr></tbody></table>

single-molecule imaging of gene regulation in vivo using cotranslational activation by cleavage (cotrac)

Nous décrivons une méthode microscopie à fluorescence, co-translationnelle activation par clivage (COTRAC) à l&#39;image de la production de molécules de protéines dans des cellules vivantes avec une seule molécule de précision sans perturber la fonctionnalité de la protéine. Cette méthode permet de compter le nombre de molécules de protéines produites dans une cellule pendant séquentielles, des fenêtres de temps de cinq minutes. Il nécessite un microscope à fluorescence avec la densité de puissance laser d&#39;excitation d&#39;environ 0,5 à 1 kW / cm 2, ce qui est suffisamment sensible pour détecter des molécules simples protéine fluorescente dans les cellules vivantes. Le rapporteur fluorescent utilisé dans cette méthode se compose de trois parties: une séquence ciblage membranaire, une maturation rapide, protéine fluorescente jaune et une séquence de reconnaissance de protéase. Le rapporteur est fusionnée de manière traductionnelle à l&#39;extrémité N-terminale d&#39;une protéine d&#39;intérêt. Les cellules sont cultivées sur une platine de microscope à température contrôlée. Toutes les cinq minutes, des molécules fluorescentes dans les cellules sont imagés (et plus tard coopérationUnted en analysant les images de fluorescence), puis photobleached de sorte que seules protéines nouvellement traduits sont comptés dans la mesure suivante. Images de fluorescence résultant de cette méthode peut être analysée par la détection des taches fluorescentes dans chaque image, en les affectant à des cellules individuelles, puis affecter les cellules de lignées cellulaires. Le nombre de protéines produites à l&#39;intérieur d&#39;une fenêtre temporelle dans une cellule donnée est calculé en divisant l&#39;intensité intégrée de taches de fluorescence par l&#39;intensité moyenne des molécules fluorescentes simples. Nous avons utilisé cette méthode pour mesurer les niveaux d&#39;expression de l&#39;ordre de 0-45 molécules simples 5 fenêtres de temps min. Cette méthode nous a permis de mesurer le bruit dans l&#39;expression de l&#39;IC λ répresseur, et a de nombreuses autres applications potentielles en biologie des systèmes.

Des résultats typiques d&#39;une expérience COTRAC le suivi de la production de l&#39;IC λ répresseur sont présentés dans les figures 4 et 5. Dans cette expérience, 12 colonies ont été imagées à intervalles de 5 min. A chaque point dans le temps, la colonie a d&#39;abord été autofocused et centralisé au sein de la zone d&#39;exposition. Ensuite, la position centrée / ciblée a été enregistré et une image de fond clair a été acquise. L&#39;étape est ensuite transport...

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Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Nous décrivons une méthode microscopie à fluorescence, co-translationnelle activation par clivage (COTRAC), à l&#39;image de la production de molécules de protéines dans des cellules vivantes avec une seule molécule de précision sans perturber la fonctionnalité de la protéine. Cette méthode a été utilisée pour suivre la dynamique d&#39;expression stochastique d&#39;un facteur de transcription, le λ répresseur CI<sup&gt; 1</sup&gt;.

Une seule molécule d&#39;imagerie du règlement Gene<em&gt; In vivo</em&gt; Utilisation de l&#39;activation par clivage cotraductionnelle (COTRAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

single-molecule-imaging-gene-regulation-vivo-using-cotranslational

Research

JoVE Journal

Biology

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

9.8K vues.  Johns Hopkins University School of Medicine. Nous décrivons une méthode microscopie à fluorescence, co-translationnelle activation par clivage (COTRAC), à l'image de la production de molécules de protéines dans des cellules vivantes avec une seule molécule de précision sans perturber la fonctionnalité de la protéine. Cette méthode a été utilisée pour suivre la dynamique d'expression stochastique d'un facteur de transcription, le λ répresseur CI 1.

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Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Molécules simples à l&#39;imagerie du transport nucléaire

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Recherche

Biologie

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

L&#39;activation de l&#39;apoptose par micro-injection cytoplasmique du cytochrome C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilisation de la séquence d&#39;arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel&#8217;s &#947;-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (&#916;Iami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of &#947;ENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a &#947;ENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in &#947;ENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes can be demonstrated by combining current measurements with a biotinylation approach to investigate the appearance of ion channel cleavage products at the cell surface. Functionally important cleavage sites can be identified by using site-directed mutagenesis.

Démonstration de protéolytique activation du canal sodique épithélial (ENaC) en combinant les mesures actuelles avec la détection de fragments de clivage

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Étude de l&#39;ADN Looping par une seule molécule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

Essai cinétique à molécule unique à haut débit parallèle pour le clivage d’ADN spécifique au site

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...