Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la Santé et des subventions HL44485 HL28607.

Déclaration éthique: Toutes les procédures ont été examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux et l&#39;utilisation institutionnelle. 1. Fabrication préliminaire de Micropipettes, retardateurs, et bloqueurs <ol><li> Tirer plusieurs tubes capillaires en verre de borosilicate propres en utilisant un extracteur moitié électronique ajustée de sorte que, lorsqu&#39;il est tiré, la partie étirée du tube est d&#39;environ 1 cm de longueur et les deux moitiés sont quelque peu symétrique. Assurez-vous que le cône est compatible avec les dimensions à la figure 1. Utilisez les deux moitiés pour micropipettes, retardateurs et les bloqueurs. <ol><li> Bevel micropipettes utilisant un air entraîné meule 30 avec 0,5 um papier abrasif baigné avec de l&#39;eau. Régler l&#39;angle du support de micropipette de sorte qu&#39;il est d&#39;environ 30 degrés par rapport à l&#39;horizontale. </li><li> Bien laver et sécher les micropipettes en utilisant aspiration pour tirer l&#39;acétone propre à travers la pointe et jusqu&#39;à l&#39;arbre. Inspectez les micropipettes (Figure 1A) à l&#39;aide d&#39;un petit microscope droit avec 4 × 40 × et objectifs équipés d&#39;un support de micropipette pince crocodile et d&#39;un réticule de l&#39;oculaire. </li><li> Sélectionnez micropipettes avec embout ouverture d&#39;environ 50 um de long avec un biseau dont le rapport longueur / largeur est entre 3,1 et 3,5 et un point fortement conique qui aide à pénétrer les fibres de collagène difficiles dans le mésentère. </li><li> Stockez 15-20 micropipettes de légèrement différentes tailles dans une boîte sans poussière. </li></ol></li><li> Assurez retardateurs utilisant des tubes capillaires tirés préparés à l&#39;étape 1.1). Tenez un tube capillaire en verre tiré brièvement près d&#39;un microflamme pour former une extrémité émoussée (figure 1B). Stocker plusieurs dans une boîte sans poussière. </li><li> Assurez microoccluders utilisant des tubes capillaires tirés préparés à l&#39;étape 1.1). Tenez un tube capillaire tiré sous un microflamme et doucement plier (en utilisant un adaptateur de tube, par exemple., 23G) de la pointe fine (environ 4 mm de la pointe) pour faire un angle de près de 120 degrés à l&#39;arbre ( <strong&gt; Figure 1C). Marque et stocker plusieurs. </li></ol> 2. Préparation des animaux et de chirurgie <ol><li> Anesthetize mâle (350-450 g) ou des rats femelles Sprague-Dawley (200-300 g) avec du pentobarbital sodique (80 à 100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) par injection sous-cutanée; protéger le mésentère par ne pas utiliser l&#39;injection intrapéritonéale. </li><li> Tout au long des procédures chirurgicales et des protocoles expérimentaux, de maintenir l&#39;anesthésie par des injections supplémentaires (30 mg / kg) selon le besoin. Déterminer profondeur de l&#39;anesthésie par pincement de l&#39;orteil ou réflexe cornéen. Après achèvement de la procédure expérimentale, le rat euthanasie par surdose de pentobarbital ou injection intra-cardiaque de chlorure de potassium saturé sous anesthésie. </li></ol> 3. Préparer des solutions et des érythrocytes pour une utilisation comme Flow Markers <ol><li> Préparer la solution de Ringer mammifère pour superfusat et la solution de contrôle de perfusat (acide généralement le mammifère de solution de Ringer contenant 10 mg / ml grasalbumine libre de sérum bovin, BSA). <ol><li> Filtre de perfusion grâce à 0,2 um filtres seringue pour éliminer les particules minuscules qui pourraient bloquer la pointe de micropipette; filtrer dans un petit récipient propre. </li></ol></li><li> Préparer érythrocytes par étirage d&#39;environ 0,2 ml de sang de la veine de la queue du rat anesthésié dans une aiguille de 20G sur une petite seringue contenant 0,05 ml d&#39;héparine (1000 U / ml) et transférer dans un tube de 15 ml de centrifugeuse contenant environ 14 ml de mammifère solution une solution de Ringer . <ol><li> Centrifugeuse pour emballer en douceur les cellules rouges (environ max 200 g pendant 7 min). Dessinez le surnageant et remettre en suspension les globules rouges dans la solution de Ringer. </li><li> Après centrifugation et retrait du surnageant trois fois laisser les globules rouges concentrés dans le fond du tube pour une utilisation ultérieure. Notez que cette procédure permet de réduire les plaquettes dans perfusats finale à moins de 0,1% des niveaux normaux 31. </li></ol></li></ol> 4. Disposer les tissus de l&#39;animalPlateau <ol><li> Raser l&#39;abdomen du rat anesthésié par le dessous du nombril au processus xiphoïde. Assurez-vous que la zone rasée étend autour du côté droit (pour rat placé sur le côté droit) de sorte que les cheveux ne fait pas une mèche d&#39;attirer l&#39;superfusat hors du tissu ainsi. Enlever les poils coupés avec un tampon de gaze ou un tissu mouillé. <ol><li> Maintenez la peau avec un instrument contondant pince dentelées et faire une incision ligne médiane (2-3 cm de long) à travers la peau en utilisant une paire de ciseaux robustes. Utilisation d&#39;une amende (IRIS) ciseaux font une incision similaire, par la ligne blanche, soulever la paroi abdominale avec des pinces dentelées pour éviter d&#39;endommager l&#39;intestin. </li><li> Avec l&#39;animal sur le côté sur le plateau de l&#39;animal, tirez doucement l&#39;intestin de la cavité abdominale à l&#39;aide d&#39;applicateurs coton-tige (bâton de bois) trempés dans une solution de Ringer et une pince dentelées contondants. Disposer l&#39;intestin dans le tissu même de sorte que le mésentère est drapée sur le pilier pour la visualisation au microscope en prenant soin d&#39;éviter de toucher le mésentère (poteendommager ntially microvaisseaux) soit avec des forceps ou de coton. Remarque: Le plateau des animaux (figure 2A) peut être construite à partir de plexiglas et nécessite un tissu bien (environ 3 mm de profondeur), un pilier optiquement clair (par exemple, le quartz poli environ 2 cm de diamètre et 5 mm de haut.), Et un coussin chauffant ajustée pour maintenir la température de l&#39;animal. L&#39;épaisseur de la colonne ne doit pas dépasser la distance de travail de l&#39;objectif. </li></ol></li><li> Placez le bac animale sur la platine du microscope afin que le mésentère est visible à travers les oculaires. </li><li> Placez une ligne de goutte à goutte par gravité à superfuse permanence le mésentère avec la solution de Ringer mammifère maintenue à 35-37 ° C. Utilisez des tampons de gaze pour maintenir l&#39;intestin en place, pour conserver l&#39;humidité, et la mèche de la solution de Ringer excès de la surface. Régler le débit de l&#39;effluent et aspirer à maintenir une épaisseur de superfusat cohérente. </li><li> Identifier les cibles microvaisseaux veinules, qui sontsegments linéaires en aval de l&#39;écoulement convergente, une ou deux branches distales de vrais capillaires. Trouver un vaisseau non ramifié (idéalement, 600 à 1000 mm de longueur) ayant flux sanguin rapide et exempt de cellules blanches collées sur la paroi du vaisseau. </li><li> Placez le microvaisseaux de test dans le centre du champ de microscope et déplacer le dispositif de retenue en position à proximité du site de ponction choisi. </li></ol> 5. Remplissez Micropipette et Mount Holder <ol><li> Juste avant cannulating, suspendre les globules rouges dans le perfusat. Ajouter 7 pi de globules rouges à 0,5 ml de perfusion dans un tube à essai de borosilicate propre. Remarque: les hématocrites de 1-3% peuvent être utilisés, mais hématocrite cohérente seront conduire à des concentrations de perfusat cohérentes de toutes les substances libérées par les globules rouges. </li><li> Monter une seringue de 1 ml avec un adaptateur de tube de 23G et PE 50 tubes (5-15 cm de longueur). Dessinez le mélange de cellules de perfusion / rouge dans la seringue. Inversez la seringue de mélanger et d&#39;expulser toutes les bulles à partir de tubes etadaptateur. Pour une efficacité accrue, des tubes en forme à plusieurs seringues avant l&#39;expérience commence et les conserver dans une boîte sans poussière ou un sac plastique. </li><li> Remplir la micropipette en faisant avancer le tube dans la grande extrémité de la micropipette jusqu&#39;à venir en butée de la région conique. Appliquer une poussée rapide douce sur le piston de la seringue pour remplir la pointe de la micropipette. Remarque: Un petit ruisseau ou gouttelettes doivent être visibles à la pointe de mettre en évidence le remplissage complet. </li><li> Retirer le tube tout en poussant doucement sur le piston pour remplir la partie la plus large de l&#39;arbre de micropipette. Retirer petites bulles dans l&#39;arbre de large en feuilletant attentivement l&#39;arbre de micropipette. Remarque: Une procédure similaire a été illustrée 32. </li><li> Placer la micropipette dans un support de pipette avec un orifice latéral qui permet une connexion de fluide continu à un manomètre à eau. Veiller à ce que le titulaire, qui est attaché à un entraînement hydraulique utilisé pour contrôler très fine avancement de la micropipette, est à un léger angle (15-25 °)à l&#39;horizontale de sorte que le bord du cône de micropipette ne touche pas l&#39;intestin ou d&#39;un plateau. </li><li> Monter l&#39;entraînement hydraulique sur un micromanipulateur mobile, qui a x, y et z lecteurs pour permettre un alignement étroit de la cuve d&#39;essai (figure 2). </li><li> Régler la pression hydrostatique appliquée sur le fluide dans la seringue en utilisant une micropipette ou poire en caoutchouc rempli d&#39;eau pour modifier la hauteur de liquide dans la colonne d&#39;eau du manomètre à environ 40 cmH 2 O au-dessus du mésentère. </li><li> Cathétériser l&#39;microvaisseaux dès que possible après le remplissage de la pipette; globules rouges se déposent au fond de la pipette, de sorte que, après environ 40 min très peu de globules rouges seront versés dans le récipient. </li></ol> 6. Microcannulation et microvasculaire mesure de pression <ol><li> Avant de positionner la micropipette remplie sous le microscope, appuyez doucement sur le dispositif de retenue sur le tissu près de la microvaisseaux appliquer une force suffisante pour saisir le tissu. Dessinez lerestrainer à dos, légèrement en étirant le tissu conforme à l&#39;microvaisseaux de sorte que les contraintes dans les fibres de collagène mésentériques sont alignés avec le récipient. <ol><li> Aligner la micropipette avec le navire et l&#39;abaisser dans vue à travers les oculaires. Placez la pointe juste en amont du site de ponction choisi et l&#39;abaisser sur le tissu afin qu&#39;il obstrue partiellement l&#39;écoulement dans le vaisseau, mais ne pas obstruer. </li></ol></li><li> Cathétériser la cuve par la conduite de la pointe de la pipette lentement dans la lumière du vaisseau à l&#39;aide de la commande hydraulique. Veillez à ne pas pousser à travers la partie inférieure de la cuve. Remarque: Comme la micropipette entre dans le lumen, le perfusat lave rapidement le sang dans le récipient hors de la lumière et perfusat librement flux en circulation de l&#39;distale de l&#39;animal à la microvaisseaux d&#39;essai, en déplaçant une partie de la perfusion sanguine normale dans les vaisseaux en aval. </li><li> Abaisser la pression de perfusion en ajustant le manomètre jusqu&#39;à ce que le sang (comme indiquépar les globules rouges de l&#39;animal) est tiré en arrière dans le segment perfusé; ce qui détermine la pression d&#39;équilibre où les globules rouges oscillent doucement dans la lumière du vaisseau et mesure la pression hydrostatique des microvaisseaux (P c) à l&#39;extrémité distale du segment de microvaisseaux. Maintenir navire perfusion à toutes les pressions au-dessus de cette pression de l&#39;équilibre. </li></ol> 7. Microocclusion et collecte de données <ol><li> Etape facultative: Avant d&#39;utiliser le micro-dispositif d&#39;occlusion pour bloquer le navire, l&#39;enfoncer dans le tissu dans une zone non utilisée du mésentère loin de tout navire de telle sorte que la pointe accumule une amende pad de tissu qui protège le navire expérimental au cours micro répétée occlusions. </li><li> Placer le dispositif de blocage au-dessus du récipient perfusé à proximité du bord inférieur du champ de microscope. </li><li> Consigner les renseignements suivants avec la vidéo et l&#39;audio. <ol><li> Enregistrer verbalement l&#39;emplacement du site de bloc et le bord inférieur de l&#39;écran comme on le voit sur le réticule d&#39;oculaire. </li><li> Avec la pointedu bloqueur placé juste au-dessus de la microvaisseaux, utilisez le z contrôle fin de l&#39;micromanipulateur pour abaisser doucement le bloqueur jusqu&#39;à ce que le flux dans la cuve est obstruée. Notez la pression du manomètre (P c) sur audio. Appliquer occlusion typiquement pour 3-10 secondes, puis relâchez, la restauration de la perfusion libre. Déplacez le site de bloc le navire vers la pointe de la pipette en 5-10 pm étapes en fonction du temps (&gt; 5 min après le bloc initial à un site), le nombre d&#39;occlusions (3-5), pour empêcher navire dommages murale sur le site de bloc . </li></ol></li></ol> 8. Analyse des données et la mesure de L p (perméabilité à l&#39;eau) <ol><li> Pendant la lecture vidéo, déterminer la distance initiale (ℓ 0) à partir d&#39;un marqueur cellulaire rouge pour le site de l&#39;occlusion par l&#39;utilisation d&#39;une image d&#39;un micromètre et les positions connues sur les images. Déterminer la vitesse initiale (dl / dt) de la cellule de marqueur à partir de sa position en plusieurs trames au cours de la seconde 10.3 des images enregistrées. Dissuadermienne rayon de la cuve (r) à partir des images prises pendant l&#39;occlusion (Figure 3). </li><li> Calculer J v / S pour chaque occlusion (dl / dt) x (1 / ℓ 0) x (r / 2). Calculer L p à une pression constante (J V / S) divisée par la pression de conduite (pression des microvaisseaux - pression osmotique colloïde efficace; voir Discussion). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Détails de L calculs p. Bien que le mouvement du fluide transvasculaire se produit alors que le navire est librement perfusé, tel échange est trop petite pour être mesurée pendant la perfusion libre car elle est généralement moins de 0,01% du taux de perfusion de navire. Toutefois, lorsque la perfusion est temporairement arrêté par occlusion de la microvaisseaux, écoulement transvasculaire (par exemple, filtration) est mesurée à partir de la circulation des globules rouges de mar...

Microperfusion dans le système vasculaire consiste à établir un écoulement d&#39;un liquide de perfusion de composition connue artificielle commandé par l&#39;intermédiaire d&#39;une micropipette dans un vaisseau sanguin généralement inférieure à 40 um de diamètre. Le récipient perfusé reste dans son environnement normal et de tissu est perfusé avec du sang de l&#39;animal jusqu&#39;à l&#39;heure de canulation le. Lorsqu&#39;il est utilisé en conjonction avec une gamme de l&#39;imagerie vidéo ou techniques fluorométriques, microperfusion in situ permet de mesurer des débits d&#39;eau et de solutés à travers les murs de microvaisseaux dans des conditions où les forces motrices de ces flux sont connus et les propriétés de perméabilité de la paroi vasculaire peuvent être directement évaluée. De plus, en contrôlant la composition du fluide entourant la microvaisseaux dans le tissu (perfusat et superfusat), la régulation de la perméabilité microvasculaire et l&#39;échange peut être étudiée en activant les cellules endothéliales qui forment la paroi de microvaisseaux à être exposée à une variété de econditions Xperimental (agonistes, conditions de perfusion modifiés, les indicateurs fluorescents pour mesurer la composition et la signalisation intracellulaire) pour des périodes mesurées précisément de temps (sec) à h. En outre, les évaluations ultrastructurales ou cytochimiques de structures moléculaires cellulaires clés régissant la barrière peuvent être étudiés dans les mêmes microvaisseaux dans lequel la perméabilité est mesurée directement. L&#39;approche forme ainsi un pont entre l&#39;enquête des mécanismes cellulaires et moléculaires de modifier la fonction de barrière endothéliale chez les monocouches de cellules endothéliales en culture et enquête microvaisseaux intactes. Voir les commentaires suivants pour une évaluation plus approfondie 1-6. Une limitation de microperfusion est qu&#39;il peut être utilisé que dans des lits microvasculaires qui sont minces, transparentes et ayant une intégrité structurelle suffisante pour permettre une canule avec une micropipette de verre. Alors que les premières enquêtes utilisées microvaisseaux de grenouilles dans mésentère et mince cutanée angine muscle 7,8, de loin la préparation la plus couramment utilisée dans les modèles de mammifères est le mésentère de rat 9-15. La plupart des enquêtes ont porté sur les changements aigus de la perméabilité vasculaire étudié sur des périodes de 1-4 heures, mais des études plus récentes ont été étendus à des mesures sur les navires individuels 24-72 h après une première perfusion 12,16. La technologie CRISPR récemment mis au point, qui promet de faire des modèles de rats plus génétiquement modifiés disponibles pour l&#39;étude de la régulation de la perméabilité vasculaire 17 devrait permettre aux méthodes décrites dans la présente communication à appliquer dans les microvaisseaux des veinules du mésentère dans ces nouveaux modèles importants de rat. La méthode nécessite un microscope inversé équipé d&#39;une platine de microscope construite sur mesure assez grand pour contenir à la fois la préparation des animaux et au moins trois micromanipulateurs utilisé pour positionner microtools à proximité de la cuve perfusé et d&#39;aligner une micropipette de perfusion avec le navirelumen. Par exemple, une plate-forme de commande pour un étage xy de microscope (environ 90 × 60 cm) peut être fabriqué à partir d&#39;une plaque d&#39;acier 1 cm d&#39;épaisseur avec un revêtement anti-rouille. La scène est attaché à une table d&#39;index d&#39;ingénierie ou deux diapositives en queue d&#39;aronde montés à angle droit et reposant sur des piliers en téflon ou les transferts de billes pour le déplacement dans le plan horizontal. Une installation typique (voir la figure 2) a beaucoup en commun avec l&#39;équipement de microscope et micropositionnement utilisée pour toute une gamme d&#39;expériences de la microcirculation intravitale tels que ceux de mesurer seul flux sanguin du navire et de l&#39;hématocrite, la livraison d&#39;oxygène locale par le sang perfusé microvaisseaux, réglementation des lisses vasculaires le tonus musculaire, et l&#39;accumulation de micro-vasculaire local des traceurs fluorescents injectés dans l&#39;ensemble de la circulation. 18-26 L&#39;aspect fondamental de la technique est la mesure de débit volumique (J v) sur une zone de surface définie (S) de la paroi de microvaisseaux. Accomplirce par la technique de Landis modifié décrit ici un microscope inversé simple, est adéquat. Une petite caméra vidéo est montée sur l&#39;orifice de l&#39;image et le signal vidéo, avec une base de temps supplémentaire, est affichée sur un moniteur vidéo et enregistrés soit sous forme numérique sur un ordinateur ou sous forme de signal numérique ou analogique sur un enregistreur vidéo. Une fois que la canule microvaisseaux est la partie de la microvaisseaux visible par la caméra peut être modifiée par déplacement de la platine et les manipulateurs en tant qu&#39;unité sans perturber la canulation. Mesure des flux de transvasculaires peut également être combiné avec des études plus détaillées à l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence avec filtres appropriés sophistiqués tels que les plates utilisées pour les mesures de perméabilité soluté, la surveillance de la fluorescence du calcium cytoplasmique rapport ou d&#39;autres mécanismes cellulaires, et l&#39;imagerie confocale 6,12,13, 27. Un avantage clé de toutes les approches de microperfusion est la capacité de faire des mesures répétées, sur le même navire, Sous changement contrôlé de la force motrice telles que des pressions hydrostatiques et oncotiques, ou changement induit dans les réponses des navires à des conditions inflammatoires. La conception la plus commune est une comparaison par paires de la conductivité hydraulique mesurée (L p) sur le même navire avec le premier récipient perfusées via une micropipette remplie d&#39;un liquide de perfusion de contrôle et la suspension de globules rouges à établir un état ​​de référence de perméabilité, puis avec un second pipette avec l&#39;agent de test ajouté au perfusat. Canulations multiples sont possibles avec le cycle répété après reperfusion avec la pipette de commande. Le présent protocole démontre la canule et microperfusion d&#39;un navire veinulaire dans mésentère de rat pour enregistrer les flux d&#39;eau à travers la paroi des microvaisseaux et mesurer la L p de la paroi de la cuve, un indice utile de la perméabilité de la voie commune pour l&#39;eau et de solutés à travers le intacte barrière endothéliale. La procédure est appelée la techniq modifié Landisue parce que le principe Landis originale d&#39;utiliser le mouvement relatif des globules rouges comme une mesure de l&#39;échange fluide transvasculaire après perfusion est bloqué est préservée 28, mais l&#39;éventail des conditions expérimentales (par exemple, les différences de pression oncotiques hydrostatiques et de l&#39;albumine à travers la paroi des microvaisseaux) disponible après microperfusion est beaucoup plus grande que dans le sang perfusé microvaisseaux uncannulated 8,29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK-40</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>narrow diameter, long working distance objective: example</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon E Plan 10&#215;/0.25 LWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td>
			<td>welding shop</td>
			<td></td>
			<td>this should be heavy to reduce vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unislide x-y table: dove tail slides</td>
			<td>Velmex</td>
			<td>AXY4006W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIDEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD video camera: example</td>
			<td>Pulnix</td>
			<td>TM-7CN (no longer available)</td>
			<td>no color needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video capture system with audio--generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small microphone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator, XYZ (3)</td>
			<td>Prior/Stoelting (no longer available)</td>
			<td></td>
			<td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydraulic probe drive, one way</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-1C</td>
			<td>need to buy either manual drive or electronic drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manual drum drive&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-9-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or hydraulic drive, 3 way</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td>
			<td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>connectors/rods/holders</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MXC-2.5, MXB etc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pin vise</td>
			<td>Starrett</td>
			<td>162C</td>
			<td>to hold restrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holder</td>
			<td>World Prescision Instruments</td>
			<td>MPH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water manometer ~120 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE TRAY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td>
			<td>Quartz Scientific Inc.</td>
			<td>custom</td>
			<td>&#160;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical adhesive for tissue well</td>
			<td>NuSil</td>
			<td>MED-1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&#34; L x 2&#34; W</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03125-20</td>
			<td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-01575-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET MANUFACTURE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vertical pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-30 with nichrome filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RX Honing Machine, System II</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td>MAC-10700 Rx System II Machine</td>
			<td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; with ceramic sharpening disc</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td></td>
			<td>use &#34;as is&#34; or attach lapping film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td>
			<td>3M</td>
			<td>part no. 051144 80827</td>
			<td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

Expériences pour mesurer les propriétés de perméabilité des microvaisseaux perfusés individuellement fournissent un pont entre l&#39;enquête des mécanismes moléculaires et cellulaires régulant la perméabilité vasculaire dans des monocouches de cellules endothéliales en culture et les propriétés des lits microvasculaires entiers de change fonctionnels. Une méthode pour canuler et perfuser microvaisseaux des veinules de mésentère de rat et de mesurer la conductivité hydraulique de la paroi des microvaisseaux est décrite. L&#39;équipement principal nécessaire comprend un microscope intravitale avec une grande scène modifiée qui prend en charge micromanipulateurs de positionner trois microtools différents: (1) une micro-pipette de verre biseauté à Cathétériser et perfuser l&#39;microvaisseaux; (2) un verre de micro-obturateur pour bloquer temporairement la perfusion et permet la mesure de mouvement d&#39;écoulement d&#39;eau transvasculaire à une pression hydrostatique mesurée, et (3) une tige de verre émoussé pour stabiliser le tissu mésentérique au niveau du site de ponction. La Landis micro-occlusion techniq modifiéeue utilise les globules rouges en suspension dans le liquide de perfusion artificielle comme marqueurs de mouvement fluide transvasculaire, et permet également des mesures répétées de ces flux conditions expérimentales sont modifiées et de la différence de pression osmotique colloïde hydrostatique et à travers les microvaisseaux sont soigneusement contrôlées. Les mesures de conductivité hydraulique première aide d&#39;un liquide de perfusion de commande, puis après une nouvelle ponction de même avec les microvaisseaux perfusats de test permettre des comparaisons de la réponse des microvaisseaux dans ces conditions bien contrôlées jumelés. Les tentatives visant à étendre la méthode de micro-vaisseaux dans le mésentère des souris avec des modifications génétiques prévus pour modifier la perméabilité vasculaire ont été sévèrement limitée à cause de l&#39;absence de longs microvaisseaux droites et non ramifiées dans le mésentère des souris, mais la disponibilité récente des rats avec des modifications génétiques similaires en utilisant la technologie / cas9 CRISPR est prévu d&#39;ouvrir de nouveaux domaines de recherche où les méthodes décrites ici peuvent être appliquées. </p&gt;

La figure 4 montre les résultats de la mesure de l&#39;évolution dans le temps des changements de L p dans un rat veinulaire microvaisseaux canule successivement avec quatre perfusats. 33 L&#39;amplitude de L p calculée à une pression constante a été utilisée comme mesure de l&#39;évolution des microvaisseaux paroi perméabilité, d&#39;une part dans l&#39;état de commande avec un liquide de perfusion contenant 1% d&#39;albumine de sérum bovin, puis lorsque le ...

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Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion Technique chargé d&#39;enquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K vues.  University of California Davis. The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions. 

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Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Préparation de la 2-dGuo cultures traitées orgue Thymus

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Recherche

Biologie

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Assay Rat angiogenèse Mésentère

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

La Ex vivo Préparation isolé microvaisseaux squelettique pour les enquêtes de la réactivité vasculaire

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Extériorisation Mésentère Rat: Un modèle pour étudier la dynamique cellulaires impliqués dans l&#39;angiogenèse

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolement du ribosome Bound polypeptides naissants<em&gt; In vitro</em&gt; Pour identifier les sites de pause de translation le long d&#39;ARNm

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilisation de la séquence d&#39;arrêt SecM comme un outil pour isoler les polypeptides Ribosome Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantifier simple microvaisseaux perméabilité d&#39;isolement de poumon de rat Préparation du sang perfusé

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

La mesure de la perméabilité à l&#39;eau Coefficient osmotique (P<sub&gt; F</sub&gt;) Des cellules sphériques: protoplastes de plantes isolées comme un exemple

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.