1. Dissociation cellulaire <ol><li> Un organigramme décrivant le protocole qui est affiché est la figure 1. Pour les numéros de catalogue des réactifs particuliers utilisés dans le présent protocole, s&#39;il vous plaît se référer au tableau 1. Disséquer la rétine dans un bain de PBS. Lors de la dissection, il est préférable d&#39;enlever le vitré et la lentille depuis les garder avec la rétine peuvent entraver la dissociation. Il n&#39;est pas toujours une importance cruciale pour supprimer tous les de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et, dans certains cas, il peut être impossible de le supprimer complètement. Toutefois, pour les simples expériences de profilage des cellules de photorécepteurs, l&#39;EPR devrait être supprimée. Si vous n&#39;enlevez pas l&#39;EPR peut conduire à une contamination des profils de cellules de tige avec des RPE gènes exprimés. C&#39;est probablement à cause de la connexion entre les photorécepteurs et l&#39;EPR. Pour la dissociation, l&#39;ensemble des adultes rétines de souris sont incubées à 37 ° C pendant 10 min dans un microtube de 1,5 ml contenant 20ul activé la papaïne, 20 pi 25 mM cystéine dans 5 mM d&#39;EDTA, et 360 ul de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) complétée par 10 mM de HEPES. Des pointes de pipette à bout filtre sont utilisés pour toutes les étapes à travers le protocole pour réduire au minimum la contamination potentielle. La concentration papaïne et le temps d&#39;incubation varie en fonction de l&#39;âge et la nature du tissu. Par exemple, de dissocier le développement rétines isolées au jour postnatal 0 (P0), incuber la rétine dans 10 ul papaïne activée, 10 pi 25 mM cystéine dans 5 mM d&#39;EDTA, et 380 Solution ul saline équilibrée de Hank (HBSS) complétée par 10 mM d&#39;HEPES pendant 10 min à 37 ° C. Rétines de différentes espèces requièrent également des conditions légèrement différentes. Rétines de poulet sont plus minces que la rétine de souris dans la plupart des stades de développement. Utilisation de 10 ul activé la papaïne, 10 pi 25 mM cystéine dans 5 mM d&#39;EDTA, et la solution de 380 ul saline équilibrée de Hank (HBSS) complétée par 10 mM de HEPES pendant 5 min à 37 ° C est suffisante pour dissocier trétines Hese. </li><li> Tapoter légèrement le tube pour déloger les cellules sédimentées, puis triturer doucement 10-20 fois avec une pipette P1000. Incuber pendant 10 min de plus à 37 ° C si de grosses touffes de tissu persistent et puis re-triturer 10-20 fois. </li><li> Ajouter 5 ul de DNase I (10 U / pl) et incuber pendant 5 min à température ambiante. Triturer doucement avec une pipette P1000. Le nombre exact de fois devra être déterminé de manière empirique, mais se situe généralement entre 10-20. </li><li> Centrifugeuse dans une centrifugeuse de table à 3000 tours par minute pendant 3 min Enlever le surnageant, laissant 100-200 pi de liquide au fond, puis sur le tube pour déloger la pastille. Ajouter 1 ml de HBSS et remettre en suspension le culot avec trituration douce. Exploiter le tube est critique ici comme une simple remise en suspension le culot avec beaucoup de lyser les cellules de la rétine. Cela est particulièrement vrai avec les adultes rétines de souris. </li><li> Centrifuger à 3000 rpm pendant 3 min Retirer délicatement le surnageant et remettre en suspension dans 450 ul de PBS contenantBSA ment 0,1%. Il est important d&#39;enlever autant de surnageant que possible afin de minimiser la présence d&#39;ARNm de cellules lysées et les produits de la dissociation qui pourraient inhiber les réactions futures. </li></ol> 2. La récolte des cellules individuelles <ol><li> Préparer deux boîtes de 6 cm contenant 5 ml de PBS additionné de 0,1% de BSA. Plate les cellules dissociées sur une seule antenne et permettent aux cellules de se contenter d&#39;au moins 5 min. La densité cellulaire utilisé dépend fortement de la nature des cellules individuelles étant profilées. Par exemple, pour les cellules très rares marqués avec un marqueur fluorescent une telle GFP, entières rétines dissociées sont étalées sur un plat unique de 6 cm. Pour les cellules qui sont un peu plus abondante, moins de cellules sont initialement ensemencées pour le rendre plus facile à récolter un (ou très proche de un) de cellules à la micropipette en premier. </li><li> Placer la plaque de cellules dissociées sur un microscope inversé. Nous utilisons le modèle IMT-2 de l&#39;Olympe. Utilisation de micropipettes qui ont été tirées à une fine pointe (diamètre intérieur de 0,5 mm, diamètre extérieur 1,04 mm) (figure 2) et avec un tube d&#39;aspiration, la récolte d&#39;une seule cellule. Les cellules facilement pénétrer dans la micropipette lorsqu&#39;il est placé à proximité de leur sur le plat. Il est essentiel que le tube d&#39;aspiration n&#39;est ni trop long ni trop court pour la distance à l&#39;étape associée avec le microscope inversé (Les tubes de prélèvement que nous utilisons avec notre microscope inversé sont 38,1 cm de long). Si le tube est trop long, les cellules ne peuvent être expulsés de manière efficace à partir de la micropipette dans le tube de collecte. La raison principale que nous utilisons plus l&#39;IMT-2 modèle microscope inversé, c&#39;est que nous avons trouvé qu&#39;il a la distance idéale à la scène pour nos tubes d&#39;assemblage d&#39;aspiration. Après être entré dans la micropipette, la cellule (ou des cellules) est expulsé vers une seconde plaque (plaque de lavage) de sorte que un et un seul est récoltée pour profil d&#39;expression génique. Sur la seconde plaque, il est souvent nécessaire pour éliminer les cellules superflues, soit avec une micropipette nouvelleou déplacer la cellule d&#39;intérêt à un emplacement différent pour veiller à ce que d&#39;une unique cellule entre dans la micropipette. </li><li> Lorsque une cellule individuelle est complètement isolé des cellules voisines, utiliser une micropipette nouvelle pour aspirer la cellule d&#39;intérêt que dans la section 2.2 et l&#39;expulsent ensuite directement dans un tube de 0,2 ml PCR contenant 4,5 pi de tampon de lyse cellulaire. La cellule est expulsé sur le côté du tube, en faisant attention de ne pas rompre la pointe de la micropipette dans le tube. Les échantillons peuvent être filée brièvement dans une microcentrifugeuse de paillasse pour plonger la cellule dans un tampon de lyse. Cette filage se fait généralement après chaque cellule 5 et ensuite à nouveau à la fin de collection.Tubes contenant des cellules individuelles dans un tampon de lyse doit être maintenu dans la glace pendant la durée de l&#39;isolement seule cellule. Pour des résultats optimaux, les cellules sont collectées dans une fenêtre de deux heures l&#39;après-dissociation. Passé ce délai s&#39;est écoulé, il est préférable de procéder à l&#39;étape de transcription inverse puisque le temps supplémentaire a été observed pour augmenter les chances de la dégradation de l&#39;ARN. </li></ol> 3. Transcription inverse <ol><li> Brièvement tourner les échantillons dans une surface de travail pour assurer minicentrifuge tous les cellules individuelles sont immergés dans le tampon de lyse cellulaire. Afin de promouvoir la lyse des cellules, incuber l&#39;échantillon à 70 ° C pendant 90 sec. dans un thermocycleur. Placer immédiatement les tubes de retour sur la glace. </li><li> Laisser reposer les tubes sur la glace pendant 2 min. Pour tous les ajouts de réactifs, utiliser le filtre à pointe des pointes de pipette pour éviter la contamination. Pour effectuer la transcription inverse, ajouter 0,33 ul Superscript III (200 U / pl), 0,05 pl inhibiteur de RNase (40 U / pl), et 0,07 ul gène 32 de T4 des protéines. Incuber le mélange réactionnel pendant 50 min à 50 ° C dans un thermocycleur. Inactiver l&#39;enzyme à 70 ° C pendant 15 min et le lieu sur la glace. </li><li> Pour enlever l&#39;apprêt libre, ajouter 0,1 Tampon Exonuclease ul (10X), 0,8 pi dH 2 0 (qualité biologie moléculaire), et 0,1 ul exonucléase I (20 U / pl). Incuber à 37 ° C pendant 30 min dansun thermocycleur. Inactiver l&#39;enzyme par incubation de la réaction à 80 ° C pendant 25 min, puis placer les tubes sur de la glace. </li></ol> 4. Tailing et des cellules individuelles PCR <ol><li> Ajouter 6 pi du mélange réactionnel de résidus et d&#39;utiliser un thermocycleur à incuber l&#39;échantillon à 37 ° C pendant 20 min, 70 ° C pendant 10 min, et le maintenir à 4 ° C </li><li> Ajouter 10 ml de l&#39;échantillon à queue au mélange réactionnel de PCR et d&#39;effectuer la synthèse du second brin et l&#39;amplification PCR en utilisant les conditions suivantes: <ol><li> 95 ° C pendant 2 min </li><li> 37 ° C pendant 5 min </li><li> 72 ° C pendant 16 min </li><li> 93 ° C pendant 40 secondes </li><li> 67 ° C pendant 1 min </li><li> 72 ° C pendant 6 minutes, en ajoutant 6 secondes par cycle </li><li> Passez à l&#39;étape 4 34 fois </li><li> 72 ° C pendant 10 min </li><li> Maintenir à 4 ° C </li></ol></li></ol> 5. Étiquetage pour les puces Affymetrix <ol><li> Étiquette 10-20 g d&#39;ADNc (la concentration de l&#39;ADNc amplifié résultatING à partir d&#39;une seule cellule est généralement ~ 1 ug / ul) pour obtenir une hybridation sur puces Affymetrix robuste. Tout d&#39;abord, un fragment de l&#39;ADNc en ajoutant 10-20 ul de l&#39;ADNc à cellule unique à 8 1X ul-One Phor-All tampon et 1 ul de dilution (1:10 dans 1X One-Phor-All tampon) DNaseI dans un 80 pi réactionnel. Incuber dans un thermocycleur pendant 13 min à 37 ° C. Désactiver la DNase I pendant 15 min à 100 ° C et le lieu sur la glace. </li><li> Ajouter 20 ul de tampon TdT 5X, 2,5 pi biotine N6-ddATP (Enzo Biosciences), et 1 ul TdT (dilué 1:8 dans un tampon TdT). </li><li> Incuber pendant 90 min à 37 ° C, puis 5 min à 65 ° C. Conserver à -20 ° C ou s&#39;hybrider immédiatement à une puce à ADN Affymetrix. L&#39;hybridation est réalisée en utilisant des protocoles standard d&#39;Affymetrix. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Pour évaluer la qualité de l&#39;ADNc, pl 10 de l&#39;échantillon d&#39;ADNc a été chargé sur un gel d&#39;agarose 1%. L&#39;ADNc est principalement jugé par la gamme de taille (500-2000 pb)et l&#39;intensité de l&#39;étalement d&#39;ADNc (Figure 1 et Figure 3a). Dans le gel décrite sur la figure 1, chaque voie de l&#39;autre représente un frottis ADNc à partir de cellules rétiniennes isolée E16.5. Les voies entre montrent les frottis résultant lorsque les médias seulement est aspiré dans l&#39;aiguille et déposés dans le tube de PCR. Ces voies ne sont jamais complètement dépourvue d&#39;un frottis faible, mais ils ne montrent pas de résultats lors de gènes spécifiques des amorces de PCR sont utilisés pour amplifier les gènes de leur part. En outre, l&#39;intensité de l&#39;étalement d&#39;ADNc peut varier quelque peu (comparer la figure 1 et figure 3a). Dans la figure 3A voies a, f, g, h et contiennent robustes frottis d&#39;ADNc alors voies b, c, d et e sont considérablement moins robuste. Spécifique du gène PCR est utilisé comme un écran secondaire de la qualité de l&#39;ADNc à partir d&#39;une seule cellule. Les ADNc de la figure 3 ont été isolés à partir fluorescentes cellules ganglionnaires de la rétine et ils étaient tested en utilisant des amorces de PCR pour la rétine marqueurs des cellules ganglionnaires Brn3b et Pax6. Pour cet essai, 1 pl de l&#39;ADNc a été soumis à une PCR pendant 30 cycles. Real-PCR quantitative en temps serait un test de préférence, mais il peut être prohibitif et n&#39;est pas nécessaire pour la simple évaluation de la qualité d&#39;ADNc. Tous les 8 des cellules individuelles ont été testés positifs pour Brn3b et 6 à 8 pour Pax6 (Figure 3b). Même les frottis d&#39;ADNc qui ont été moins robustes bandes produites pour Brn3b et Pax6. En dépit de ces résultats de la PCR, il est de notre expérience que les frottis d&#39;ADNc tels que ceux dans les couloirs b, c, d et e ne donnent pas hybridations robustes sur Affymetrix et sont généralement évités. Gene PCR spécifique pour la Crx photorécepteur marqueur a été utilisé pour déterminer le niveau de contamination dans les ADNc seule cellule (figure 3b). Un marqueur photorécepteur a été choisi parce que ces cellules constituent la majorité de la rétine (~ 70%) et, par conséquent, toute la lyse des cellules qui ont eu lieu très probablement impliquer tige photoreceptors. Il y avait seulement une quantité faible de l&#39;actuelle Crx dans ces préparations d&#39;ADNc, même après 30 cycles de PCR. Enfin, cet écran reposant sur la PCR peut être utilisée pour commencer à déterminer les sous-ensembles d&#39;un type cellulaire particulier les ADNc ont été dérivés à partir avant de les soumettre à un profilage microréseau intégral. Cela peut aider à prioriser les cellules qui sont profilées, car c&#39;est l&#39;étape la plus coûteuse dans le processus. Par exemple, nous avons identifié des sous-ensembles de cellules ganglionnaires de la rétine par eux le dépistage de la présence du gène Tachykinin1 (Figure 3b). De la petite à base de PCR écran, notamment des cellules simples sont choisis et leurs ADNc hybridé à un microréseau Affymetrix. Les données microarray est comparé et les modèles peuvent être découverts en utilisant des algorithmes de clustering standards. Heatmaps, comme dans la figure 4, sont générées pour représenter graphiquement les données. Il ya deux principales conclusions concernant les données de profilage simples cellules de la figure4. Tout d&#39;abord, les gènes exprimés dans des types cellulaires spécifiques se trouvent presque exclusivement dans ces types cellulaires après le protocole de cellule unique est effectué. Dans la plupart des cas où les gènes marqueurs d&#39;un type de cellule se trouvent également dans un second type de cellules, telles que l&#39;observation que les cellules bipolaires exprimer certains gènes «bâtonnet» à des niveaux inférieurs, cette expression dans le second type de cellules est facilement confirmé par soit in situ hybridation ou marquage par anticorps. Deuxièmement, au sein de la amacrines plus diversifiée et profils des cellules ganglionnaires, l&#39;hétérogénéité de l&#39;expression génique est immédiatement apparent. Pou4f1 est exprimé uniquement dans environ 1/4 des cellules ganglionnaires en développement, tout en NR4A2 et Scube2 sont deux exemples de gènes exprimés dans différents hétérogène des cellules amacrines. En fait, les gènes indiqués dans le heatmap sont juste un petit échantillon que plusieurs centaines de gènes ont été identifiés et confirmés en tant que marqueurs de cellules ganglionnaires en développement ou en tant que marqueurs de différentes populations de cellules amacrines 2,4. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig1.jpg" /> Figure 1. Organigramme de la méthode de profilage seule cellule. Rétines Premières sont isolées et dissociées en cellules individuelles en utilisant la papaïne. Deuxièmement, les cellules sont récoltées avec une aiguille de verre tiré et déposé dans des tubes PCR. Les cellules sont lysées et l&#39;ADNc amplifié en utilisant une transcription inverse suivie par PCR. La qualité ADNc résultant est évaluée sur un gel d&#39;agarose tel que celui montré. Après l&#39;échelle d&#39;ADN dans la première voie, les voies montrent frottis d&#39;ADNc à partir des cellules individuelles (indiqué par les parenthèses rouges) alternant avec des produits d&#39;amplification de contrôle des médias. Les frottis de cette qualité (entre parenthèses rouges) sont hybridées aux puces Affymetrix. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig2.jpg" /> Figure 2. Photos des aiguilles et l&#39;assemblage tube aspirateur. Cellules individuelles sont isolées en utilisant l&#39;action capillaire d&#39;untiré de verre micropipette (diamètre intérieur 0,5 mm, diamètre extérieur 1,04 mm) et sont transférées par la pression de soufflage dans l&#39;aspirateur. Il est important que le tube d&#39;aspiration est à la fois assez longtemps pour manipuler facilement et assez courte pour s&#39;acquitter de manière fiable des cellules individuelles. Une vue rapprochée du tube capillaire tiré dans une aiguille est indiqué dans B. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig3.jpg" /> Figure 3. Donner un exemple représentatif des frottis de cellules uniques d&#39;ADNc et PCR de gènes spécifiques. Pour déterminer la qualité de la cellule unique d&#39;ADNc après amplification, 10 ul de chaque échantillon cellule unique ont été exécutés sur un gel d&#39;agarose 1% avec un contrôle négatif (A). Un frottis devrait apparaître entre 500-2000 pb. Supplémentaire basée sur la PCR de dépistage des gènes spécifiques peuvent aider à identifier / confirmer le type de cellule qui a été isolé et la quantité de contamination de l&#39;échantillon (B). Des amorces spécifiques de la cellule ganglionnaire de la rétine marqueurs Brn3bet Pax6 ont été testés pour confirmer l&#39;identité de ces cellules (lignes 1 et 2). Pour évaluer le montant de la contamination photorécepteur dans la préparation, des amorces spécifiques pour la Crx photorécepteur marqueur ont été utilisés (ligne 3). Sous-ensembles de cellules ganglionnaires peuvent également être identifiés par le dépistage des marqueurs tels que Tachykinin1 (ligne 4). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig4.jpg" /> Figure 4. L&#39;expression cellule unique d&#39;un des gènes marqueurs. Les résultats microarray de gènes sélectionnés exprimées dans des cellules individuelles distinctes 22 sont présentés dans un format heatmap. Les intensités de signaux des puces ont été mis à l&#39;échelle pour correspondre à l&#39;intensité de la couleur rouge. Le noir indique l&#39;absence de signal sur la puce. Les rétiniennes ganglionnaires de cellules (RGC) précurseurs indiqués ont été isolés à partir de points de temps embryonnaires, tandis que les autres cellules ont été isolées à partir de rétines adultes.

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D., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profile+analysis+within+the+human+hippocampus:+comparison+of+CA1+and+CA3+pyramidal+neurons.">Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons.</a> J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).</li><li>Iscove, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+is+faithfully+preserved+in+global+cDNA+amplified+exponentially+from+sub-picogram+quantities+of+mRNA.">Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA.</a> Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).</li><li>Subkhankulova, T., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+linear+and+exponential+amplification+techniques+for+expression+profiling+at+the+single-cell+level.">Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level.</a> Genome Biol. 7, R18 (2006).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Un nombre sans cesse croissant d&#39;études révèlent robustes cellule à cellule variabilité des populations que l&#39;on croyait à être plus homogènes en ce qui concerne leur expression génique 6,8. Dans un cas au moins, cette expression du gène du «bruit» a été montré à jouer un rôle important biologique 13. Différences d&#39;expression des gènes entre les cellules individuelles sont obscurcies à l&#39;aide de tissus traditionnels ensemble des méthodes. Ces expériences de gé...

Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &mu;</td>
			<td>10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>10% NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.23 &mu;l</td>
			<td>0.1M DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>RNase Inhibitor (40 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05 &mu;l</td>
			<td>SUPERase-In (20U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.13 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer 
			(TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.09 &mu;l</td>
			<td>dNTPs (2.5 mM each)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.27 &mu;l</td>
			<td>dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tailing Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.18 &mu;l</td>
			<td>100 mM dATP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 &mu;l</td>
			<td>10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.62 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>TdT (400 U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 &mu;l</td>
			<td>RNase H (2 U/&mu;l)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
PCR Reaction Mixture
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l</td>
			<td>2.5 mM dNTPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;l</td>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (10 &mu;g/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &mu;l</td>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase (5U/&mu;l)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>68.8 &mu;l</td>
			<td>dH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
10X One-Phor All Buffer
<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M</td>
			<td>Potassium acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Tris acetate (pH 7.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M</td>
			<td>Magnesium acetate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl 
2g KCl 
14.4 g Na2PO4 
2.4 g KH2PO4 
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical needle puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 750</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0674</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning filter tips (100-1000 &mu;l</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-265</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank's balanced salt solution (1X)</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>10-508F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer (1M)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>091688449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04716728001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS03126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript III</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2682</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase-In</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>AM2694</td>
			<td>These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Oligo d(T) primer (gel purified)</td>
			<td>Oligos ETC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 gene 32 protein</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0300L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TdT</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3 333 574</td>
			<td>As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase H</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18021-014</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ex-Taq HS Polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR006A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin N6-ddATP</td>
			<td>Enzo Biosciences</td>
			<td>42809</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Specific reagents and equipment.

single-cell profiling of developing and mature retinal neurons

Populations hautement spécialisés, mais extrêmement faible de cellules jouent un rôle important dans de nombreux tissus. L&#39;identification de la cellule de type marqueurs spécifiques et des programmes d&#39;expression génique pour des sous-ensembles de cellules extrêmement rares a été un défi en utilisant des tissus entiers approches. Profilage de l&#39;expression génique des cellules individuelles permet un accès sans précédent à des types cellulaires qui composent seulement un petit pourcentage de l&#39;ensemble du tissu 1-7. En outre, cette technique peut être utilisée pour examiner les programmes de l&#39;expression des gènes qui sont exprimés dans transitoirement un petit nombre de cellules au cours de dynamiques de développement des transitions 8. Cette question de la diversité cellulaire se pose à plusieurs reprises dans le système nerveux central (SNC) où les connexions neuronales peuvent se produire entre les cellules très diverses 9. Le nombre exact de types cellulaires distincts n&#39;est pas connue avec précision, mais il a été estimé qu&#39;il pourrait y avoir jusqu&#39;à 1000 différents types dans le cortex itself 10. La fonction (s) de circuits neuronaux complexes peut s&#39;appuyer sur quelques-uns des types rares neurones et les gènes qu&#39;ils expriment. En identifiant de nouveaux marqueurs et d&#39;aider à classer les différents neurones moléculaire, l&#39;approche unique de cellules est particulièrement utile dans l&#39;analyse des types de cellules dans le système nerveux. Il peut aussi aider à élucider les mécanismes de développement du système nerveux par l&#39;identification des gènes différentiellement exprimés et les voies de gènes au cours des étapes précoces du développement progéniteur neuronal. En simple, le tissu facilement accessible avec la diversité neuronale considérable, la rétine des vertébrés est un excellent modèle pour étudier les processus de développement cellulaire, la différenciation neuronale et la diversification neuronale. Cependant, comme dans d&#39;autres parties du système nerveux central, cette diversité cellulaire peut présenter un problème pour la détermination des voies génétiques qui conduisent progéniteurs rétiniens d&#39;adopter un destin cellulaire spécifique, en particulier étant donné que les photorécepteurs tige forment le majorité de la population totale des cellules rétiniennes 11. Nous rapportons ici une méthode pour l&#39;identification des transcrits exprimés dans les cellules rétiniennes simples (figure 1). La technique de profilage à cellule unique permet pour l&#39;évaluation de la quantité de l&#39;hétérogénéité au sein de différentes populations cellulaires de la rétine 2,4,5,12. En outre, cette méthode a révélé une foule de nouveaux gènes candidats qui pourraient jouer un rôle (s) dans le destin des cellules aux processus décisionnels qui se produisent dans des sous-ensembles de cellules progénitrices rétiniennes 8. Avec quelques ajustements simples du protocole, cette technique peut être utilisée pour de nombreux tissus différents et des types de cellules.

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Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Procédé pour l&#39;isolement de cellules rétiniennes uniques et d&#39;amplification ultérieur de leurs ADNc est décrite. Monocellulaires transcriptomique révèle le degré de l&#39;actuelle hétérogénéité cellulaire dans un tissu et découvre de nouveaux gènes marqueurs de populations de cellules rares. Le protocole d&#39;accompagnement peut être ajustée en fonction de nombreux types cellulaires différents.

Une seule cellule de profilage de développer et d&#39;âge mûr neurones de la rétine

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

single-cell-profiling-of-developing-and-mature-retinal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K vues.  Iowa State University. Procédé pour l'isolement de cellules rétiniennes uniques et d'amplification ultérieur de leurs ADNc est décrite. Monocellulaires transcriptomique révèle le degré de l'actuelle hétérogénéité cellulaire dans un tissu et découvre de nouveaux gènes marqueurs de populations de cellules rares. Le protocole d'accompagnement peut être ajustée en fonction de nombreux types cellulaires différents.

Vidéo: Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Recherche

Neurosciences

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

Profilage voltage-dépendants expression d&#39;ARNm de potassium dans les neurones Canal nigrales utilisant une seule cellule de RT-PCR

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

Coupez-chargement: Un outil utile pour examiner l&#39;étendue du couplage Tracer Gap jonction entre neurones rétiniens

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Les enregistrements de cellules entières simultanées de photorécepteurs et les neurones de second ordre dans une préparation de tranches rétine Amphibian

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Enregistrement Light-réponses évoquées dans les neurones post-synaptiques dans Dark-adaptés, Préparations rétine de la souris tranche en utilisant des techniques de patch clamp

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

L&#39;ARN monocellulaire-séquentiel des sous-ensembles définis des cellules ganglionnaires rétiniennes

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolement des noyaux d’adultes de la moelle épinière pour séquençage massivement parallèle ARN simple-noyau

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

Séquençage de l’ARN des cellules individuelles des neurones de souris fluorescent étiquetés à l’aide de tri manuel et Double Transcription In Vitro de chefs absolus séquençage (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

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Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Électroporation unicellulaire à travers différentes cultures de tranches organotypiques de neurones excitateurs excitateurs de l’hippocampe de souris et de neurones inhibiteurs spécifiques à une classe

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...