We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.

Déclaration d&#39;éthique animale: Les protocoles décrits dans ce manuscrit suivent les directives de protection des animaux établies par l&#39;Université d&#39;Auckland et de l&#39;Université de Stanford. Les ratons P7 ont été euthanasiés par décapitation rapide. Dissection de l&#39;hippocampe est alors immédiatement effectué comme décrit ci-dessous. 1. organotypique hippocampe Slice Culture <ol><li> Préparation <ol><li> Préparer dissection moyen (utilisé seulement pour la dissection du cerveau). Mélanger 200 ml de milieu essentiel minimum, 2 ml de solution de pénicilline-streptomycine (10 000 unités de chaque, dans 0,85% de NaCl), 5 ml de solution tampon HEPES, 2 ml de Tris 1 M solution stock (pH 7,2), et stériliser par filtration avec filtre de 0,22 um . Effectuer une dissection de l&#39;hippocampe dans le milieu de dissection glacée. </li><li> Refroidir le milieu de dissection. Placer le support de dissection au congélateur environ 1 heure avant le début de la dissection jusqu&#39;à ce que le liquide est très froid. Ne pas laisser grand cr de glaceystals à former. Stocker sur la glace jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Préparer le milieu de culture (utilisé pour tout, sauf de dissection hippocampes). Mélanger 100 ml de milieu essentiel minimum (concentration de 1 x, liquide) w / des sels de Hank, w / L-glutamine, 2 ml de solution de pénicilline-streptomycine (liquide, 10 000 unités de chaque, dans NaCl à 0,85%), 2,5 ml de HEPES 1 M de tampon solution, 50 ml solution saline équilibrée de Hank, 50 ml de sérum de cheval (défini, inactivé par la chaleur), et stériliser par filtration avec filtre de 0,22 um. </li><li> Préparer les boîtes de culture. Placer 1 ml de milieu de culture par boîte de 35 mm de la culture, et ajouter un insert de membrane à chaque plat. Mettre en place à sept de ces plats dans une boîte de Pétri de 150 mm (ci-après comme «plaque»). Placer la plaque dans un incubateur à CO 2 pendant au moins une heure avant le début de la dissection, afin que le milieu de culture dans les plats atteint la température et le pH approprié. </li></ol></li><li> Dissection de la hippocampes de rats chiots à Jour Post-natal 7 (P7) <ol><li> Pré-stériliser tous les outils de dissection sous lumière UV avant la procédure. </li><li> Après décapitation rapide, retirer le cerveau et le lieu dans un milieu réfrigéré dans un plat, et puis la retirer pour un morceau de papier filtre humidifié pour la dissection. Taquiner le cortex loin du mésencéphale utilisant émoussés lisses spatules décoratifs recouverts de plastique, ce qui expose l&#39;hippocampe. Couper le cul de sac, puis retirez doucement la spatule sous l&#39;hippocampe pour la retourner (Figure 1A). NOTE: Le succès des cultures de tranche peuvent être préparés en utilisant des animaux jusqu&#39;à P10. </li><li> Coupez l&#39;hippocampe isolé loin du reste du cerveau. Transférer la hippocampes dans un nouveau plat contenant médias de dissection froide à l&#39;aide d&#39;un pinceau doux humide (par exemple, blanc sable # 4). </li><li> Nettoyez le dessous (c&#39;est à dire le côté plat) de l&#39;hippocampe de plexus choroïde lors de la dissection, comme ces tissus spongieux, Meninge-comme il est difficile de séparer l&#39;hippocampedes tranches les unes des autres par la suite. REMARQUE: Laissez ces tissus en place si elles ne peuvent pas être taquiné loin doucement. </li><li> Effectuer l&#39;ensemble de dissection aussi rapidement que possible sans endommager le hippocampes. REMARQUE: Une dissection minutieuse est plus important que d&#39;un, rapide, aussi longtemps que les conditions expérimentales sont refroidis. Trancher le hippocampes de rats trois simultanément. L&#39;état de santé de la tranche ne soit pas affectée aussi longtemps que le temps total du début à lorsque les tranches étalées entrent dans l&#39;étuve est de moins de 30 min. </li></ol></li><li> Tranchage <ol><li> Couper les hippocampes transversalement en 400 um sections en utilisant une trancheuse manuelle des tissus. La méthode par laquelle le découpage est réalisé n&#39;est pas important, tant qu&#39;il n&#39;est pas trop dommageable pour le tissu et produit des tranches d&#39;épaisseur uniforme avec une architecture laminaire facilement visible (c&#39;est à dire la corne d&#39;Ammon est facile de voir à conserver dans le tissu). </li><li> Allongez la hippocampes sur la scène du tissuhachoir sur une triple épaisseur de # 2 de papier-filtre. Le hippocampes sont entièrement tranché sans retirer les tranches individuellement (c&#39;est à dire l&#39;ensemble de l&#39;hippocampe est laissé sur la scène de l&#39;hélicoptère jusqu&#39;à ce que toutes les coupes ont été faites, mais plutôt comme des miches de pain tranché à ce stade, figure 1B). </li><li> Transférer la hippocampes dans le milieu de dissection à l&#39;aide d&#39;un pinceau doux posé à côté de l&#39;hippocampe (blanc sable 2 #). Poussez doucement chaque hippocampe sur le côté pour briser l&#39;adhérence entre l&#39;hippocampe et le papier filtre sous-jacent. Rouler la brosse sous chaque hippocampe à ramasser sur la scène. Placez tous les hippocampes dans la même boîte de Pétri de 35 mm de milieu de dissection froide. Séparez les hippocampes en tranches individuelles en agitant manuellement le plat en alternant mouvements droite et à gauche. </li><li> Inspectez les tranches sous un microscope à dissection et supprimer tout ce qui est endommagé, petit, ou qui ne possèdent pas de cellule visiblecouches de corps. NOTE: Il sera souvent le cas que toutes les tranches sont séparés de leur fratrie avec succès de cette façon. Dans ce cas, ils peuvent être séparés en les tournant sur le bord et à les pousser du bout des pinces fines. Les «bons» des tranches sont ensuite transférés dans un autre plat propre Petri contenant un milieu de dissection froide à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur coupée et polie à la flamme (figures 1C-E). </li></ol></li><li> Stockage <ol><li> Placez les tranches individuelles sur les cartouches filtrantes à membrane. Avec une pipette Pasteur coupée et le feu poli pour donner un plus gros calibre, transférer individuellement tranches les inserts de culture. REMARQUE: La taille du trou créé lors de la coupe et la pipette de polissage-le-feu est important. Trop petit et les tranches ne seront pas facilement quitter la pipette pour la membrane. Fluide trop grand excès et est placé sur la surface de la membrane avec la tranche. Le diamètre de l&#39;alésage mieux est généralement d&#39;environ la moitié de la diammètre du cylindre de la pipette. Lors de la coupe, ce diamètre peut être choisi en coupant au bon endroit sur le cône de la pipette. </li><li> Transfert tranche <ol><li> Remplir la pipette avec le milieu, et ensuite aspirer une seule tranche de petites forces d&#39;aspiration. Cela permet de maintenir la tranche près de l&#39;ouverture de la pipette et empêche l&#39;expulsion trop fluide dans l&#39;insert de placer la tranche. </li><li> Appliquez une légère pression sur l&#39;ampoule afin de former une petite goutte de suspension, permet la tranche de s&#39;installer dans cette gouttelette, puis touchez que des gouttelettes de la membrane et laisser la tranche «chute» sur la membrane. Généralement trois tranches sont placées sur chaque insert de membrane. REMARQUE: si la gouttelette de liquide est trop importante, les gouttes provenant des trois tranches ont tendance à fusionner sur la surface de la membrane, et les tranches seront donc tout rassembler vers le centre de la membrane, ce qui rend plus difficile de les séparer pour l&#39;enregistrement électrophysiologique par la suite. </li></ol></li><li> Enlev fluideal <ol><li> Aspirer tout milieu en excès de la partie supérieure de l&#39;insert de plaque de culture de toutes les tranches en ce que la plaque (3 tranches par plaquette = 21 tranches par plaque), de sorte que les tranches ne sont pas immergés dans ou entourés par un réservoir de milieu de dissection. </li><li> Effectuez ce soit avec un non coupée, mais poli-feu pipette Pasteur. Laisser la tranche de régler et d&#39;adhérer à la membrane pendant une minute avant pipetage. Prenez soin de ne pas aspirer la tranche dans la pipette. Effectuer le retrait de fluide pour les inserts qui sont immatriculés en premier lieu, à laisser suffisamment de temps pour les tranches de s&#39;installer. </li></ol></li><li> Tranche de stockage <ol><li> cultures tranche de magasin dans un incubateur à CO2 de 5,0% à 37 ° C. Observez la disposition finale des cultures de la figure 1E. Les tranches individuelles reposent sur un insert de plaque de culture qui a une membrane poreuse d&#39;un fond, et s&#39;ajuste à l&#39;intérieur de cette pièce une boîte de Pétri remplie avec une petite quantité de milieu; par ce moyen, les tranches ne sont pas immergés dans la medium, mais elle est ouverte uniquement à travers la membrane au fond de l&#39;insert de plaque de culture. </li><li> Eventuellement, retirer les tranches de l&#39;étude peut, soit en retirant l&#39;insert de plaque de culture ou en découpant une section de la membrane de l&#39;insert contenant une tranche. </li></ol></li></ol></li><li> Entretien <ol><li> Remplacer le milieu dans les boîtes de Pétri jours après la prise de cultures. Transfert de l&#39;insert de plaque de culture à une nouvelle boîte de Pétri contenant 1 ml de milieu de culture frais qui est équilibrée dans l&#39;incubateur pendant au moins une heure avant le transfert. </li><li> Changer le milieu de nouveau de la même manière, le troisième jour après la prise de cultures. Le troisième jour, le transfert des cultures à un incubateur réglé à 34 ° C. Changer le support deux fois par semaine (tous les 3-4 jours). </li><li> Identifier les cultures saines. Sélectionnez cultures saines pour les enregistrements de cellules entières paires. REMARQUE: Les cultures en bonne santé ont un bord bien défini et une couche de cellules pyramidales clairement définie. Cultures d&#39;esprith foncé (nécrotique probable) zones présente un aspect ou vacuole avec des frontières aplaties sont rejetées. En utilisant ces critères, normalement les deux tiers de cultures de tranches sont suffisamment saine pour l&#39;enregistrement. </li><li> Utiliser ces cultures dans un délai assez petite fenêtre de temps. Ne pas les tissus utilisés qui sont cultivées depuis plus de deux semaines que les neurones commencent à afficher un comportement légèrement épileptique qui s&#39;aggrave lentement avec le temps. La limite supérieure exacte de la survie neuronale n&#39;est pas connu, mais il est possible d&#39;enregistrer le fonctionnement des cellules pyramidales aussi tard que 16 semaines en culture. </li></ol></li></ol> 2. paires enregistrements de cellules entières <ol><li> ACSF et Solutions intracellulaires <ol><li> Préparer la solution d&#39;électrode présynaptique en mélangeant (en mM) 120 gluconate de potassium, 40 HEPES, 5 MgCl2, 2 NaATP, et 0,3 NaGTP (pH 7,2 avec KOH, osmolarité: 290 mOsm). Alors que la même solution de l&#39;électrode est utilisée pour les neurones post-synaptiques, gluconate de césium (120 mM) Est généralement utilisé comme le principal sel dans l&#39;électrode post-synaptique, plus mM QX314 5. NOTE: Ceci permet de serrage de tension stable à des potentiels positifs pour enregistrer les courants NMDAR médiation post-synaptiques 8-10,13. Elle empêche également l&#39;hyperexcitabilité induite par le potassium, le neurone présynaptique de la solution en écoulement interne de l&#39;électrode d&#39;enregistrement avant un joint postsynaptique de giga ohm est faite. </li><li> Préparer la solution d&#39;électrode postsynaptique composition (en mM) 120 gluconate de césium, 40 HEPES, 5 MgCl2, 5 QX314, NaATP 2, et 0,3 NaGTP (pH 7,2 avec CsOH, osmolarité: 290 mOsm). Tirez microélectrodes de verre à 5-10 résistance de MQ et remplir avec une solution interne filtré. </li><li> Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) composition (en mM) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1,3 MgSO 4, 2,4 CaCl2, 1 Na 2 HPO 4, 26,2 NaHCO 3, 11 glucose, pH 7,4, saturé avec 95% O 2, 5 % de CO 2. REMARQUE: Si r AMPAR médiationEPONSES doivent être bloquées pour l&#39;examen des NMDAR EPSCs, comprennent 10 uM CNQX ou NBQX dans l&#39;ACSF. </li></ol></li><li> Obtenir jumelés entiers enregistrements cellulaires <ol><li> Pour examiner la transmission synaptique entre deux neurones individuels, désigner un neurone comme le neurone présynaptique et maintenir pince de courant pour induire des potentiels d&#39;action et de lancer la transmission synaptique. </li><li> Désigner le deuxième neurone, comme le neurone post-synaptique, et le maintenir en pince de courant ou de tension en fonction de l&#39;information requise par le chercheur. Obtenir un examen détaillé des courants glutamatergiques, avec EPSCs AMPAR médiation examinés à -65 mV et EPSCs NMDAR médiation examinés à +30 mV 6-16 en tenant le neurone post-synaptique de la tension de serrage </li><li> Établir un enregistrement associé. Pour établir un enregistrement associé, l&#39;enregistrement de la cellule entière présynaptique on obtient toujours la première, permettant à plusieurs neurones post-synaptiques séquentielles à obtenir jusqu&#39;à celui qui est synaptique actuellement connectésd est obtenu. Si la réalisation d&#39;expériences de plasticité synaptique, il est particulièrement important d&#39;obtenir le premier neurone présynaptique comme l&#39;induction de la LTP dans le neurone post-synaptique doit être initiée dans les 10 minutes de l&#39;obtention de l&#39;ensemble des enregistrements de cellules de lavage pour éviter les facteurs cytoplasmiques nécessaires à 8,19 LTP. </li><li> Éviter la perte cellulaire induite par le mouvement. Un défi majeur lors de l&#39;exécution des enregistrements de cellules entières paires est d&#39;éviter les vibrations et les perturbations induites mouvement du premier enregistrement de la cellule entière tout en obtenant le deuxième enregistrement. <ol><li> Obtenir le premier enregistrement de cellules entières et de passer ensuite au microscope objectif 10-200 pm de l&#39;axe x de telle sorte que l&#39;enregistrement créé est situé au bord de la zone visible sur l&#39;écran (figure 2A). </li><li> Soulevez la lentille du microscope ~ 5-10 mm, tout en assurant que le ACSF maintient toujours le contact avec la lentille. Montez la seconde électrode et de guider dans le ménisque de fluide (figure 2B </strong&gt;). </li><li> Déplacer l&#39;électrode dans le plan xy jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit directement sous le trajet de la lumière à travers la lentille, mais encore de façon significative au-dessus de l&#39;électrode d&#39;enregistrement établi. Une fois que l&#39;électrode est visible au microscope, est de veiller à la pointe à l&#39;extrémité de l&#39;écran éloignée de la première électrode. </li><li> Déplacer la deuxième électrode vers le bas dans l&#39;ordre de la mise au point du microscope jusqu&#39;à ce que les deux électrodes sont dans le même plan focal. Il est important que le niveau de pression positive est suffisamment forte pour éviter le blocage pointe, mais pas trop forte de manière à interrompre le premier enregistrement de cellules entières. Cela se traduit par la pression positive induire un mouvement à 2-3 neurones à partir de l&#39;électrode quand il pénètre dans la tranche. </li><li> Trouver un partenaire post-synaptique dans un plan focal similaire au premier enregistrement pré-synaptique (figure 2C). L&#39;enregistrement est généralement jumelé obtenir des enregistrements entre les neurones pyramidaux CA3 la deuxième de cellules entières d&#39;un 0-200 mm neurone de la première rnregistrement (figures 2C, D). REMARQUE: La transmission synaptique entre deux neurones sont stables sur des périodes allant jusqu&#39;à 3-4 heures lors de l&#39;utilisation de ces techniques d&#39;enregistrement de cellules standards entiers. </li></ol></li></ol></li><li> Plasticité synaptique: Once Upon obtenir un succès paire de cellules pyramidales synaptique connecté (3A Figures, B), examiner les caractéristiques de transmission et la plasticité synaptique. <ol><li> Induction de LTP. <ol><li> Induire la LTP en associant des potentiels d&#39;action présynaptiques (1 Hz) avec une dépolarisation post-synaptique à -10 à 0 mV pendant 1 min (figure 3C) 7-9,12-14. Procédez au couplage à moins de 10 min de pause dans le neurone post-synaptique. REMARQUE: LTP peut aussi être induite par les neurones qui s&#39;est tenue à pince de courant en associant des potentiels d&#39;action présynaptiques et post-synaptiques à 1 Hz pendant 1 min, avec des potentiels d&#39;action post-synaptiques suscité 10 ms après l&#39;injection de courant dans le neurone présynaptique 8 </sjusqu&#39;à&gt;. </li></ol></li><li> En outre induire LTD par une faible stimulation de fréquence (EPA) à 1 Hz combinée à une légère dépolarisation du neurone post-synaptique à -55 mV pendant 5-10 min (figure 3C) 9. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+in+the+induction+of+long-term+potentiation+and+depression+of+synaptic+excitation+between+hippocampal+CA3-CA1+cell+pairs+in+vitro.">Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).</li><li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+enhancement+shown+by+whole+cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices.">Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).</li><li>DeBello, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP-mediated+protein-protein+interactions+essential+for+neurotransmitter+release.">SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release.</a> Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).</li><li>Bekkers, J. M., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+variability+in+quantal+size+in+cultured+hippocampal+neurons+and+hippocampal+slices.">Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).</li><li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+between+pairs+of+hippocampal+slice+neurons:+quantal+levels,+oscillations,+and+LTP.">Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP.</a> Science. 252, 722-724 (1991).</li><li>Debanne, D., Gu&#233;rineau, N. C., G&#228;hwiler, B. H., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures.">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li><li>Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+altered+inhibition+in+Ts65Dn,+a+mouse+model+of+Down+syndrome.">Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome.</a> Brain Research. 1440, 1-8 (2012).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down's+syndrome.">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Ici, nous avons décrit les exigences pour établir des enregistrements cellulaires succès paires entières dans les cultures de tranches d&#39;hippocampe organotypiques. Les enregistrements par paires peuvent également être effectuées dans plusieurs préparations, y compris les tranches aiguës et des systèmes de culture 26,27 dissociées. Si l&#39;accent a été mis sur l&#39;induction de formes plus longues de la plasticité synaptique (à savoir LTP et LTD), il est important de souligner que les enre...

Les récepteurs du glutamate médient la majorité de la transmission synaptique excitatrice dans les synapses du système nerveux central. Les deux principaux sous-types de récepteurs ionotropiques du glutamate localisées à la tête de la colonne vertébrale de la membrane post-synaptique sont la N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et α-amino-3-hydroxy-5-méthylisoxazole-4-propionique acide (AMPA) des récepteurs. A des potentiels de membrane au repos, les récepteurs AMPA portent plus du courant post-synaptique au cours de la transmission synaptique. Dans l&#39;hippocampe, le récepteur NMDA joue un rôle clé dans le déclenchement de l&#39;évolution du nombre de récepteurs de l&#39;AMPA dans la membrane post-synaptique: en agissant comme un &quot;détecteur de coïncidence&quot; 1 à initier des changements dans la force synaptique 1, le récepteur NMDA participe aux mécanismes synaptiques qui sont pensés pour soutenir l&#39;apprentissage et la mémoire à un niveau subcellulaire. En réponse à la dépolarisation du neurone post-synaptique en parallèle avec la libération du transmetteur présynaptique, le calcium pénètre par le NMDArécepteur pour lancer l&#39;insertion du récepteur AMPA ou d&#39;enlèvement 2. Cette dynamique des récepteurs à la base de plasticité synaptique: une augmentation de la force synaptique est potentialisation à long terme 2,3 (LTP), alors qu&#39;une diminution de la force synaptique est la dépression à long terme 4 (LTD). Par conséquent, le mouvement du récepteur AMPA est considéré comme responsable de l&#39;expression de la plasticité synaptique, tandis que les récepteurs NMDA sont considérées pour contrôler son induction. Déterminer les mécanismes précis qui sous-tendent la transmission synaptique et la plasticité nécessite l&#39;étude de petites populations de synapses, idéalement synapses individuelles. Alors que certaines synapses sont parfaitement adaptés pour l&#39;étude à ce niveau, par exemple, le calice de Held 5, pour les populations les plus synaptiques ce qui est extrêmement difficile en raison de la petite et diffuse la nature des connexions synaptiques. Deux principales techniques d&#39;électrophysiologie ont été développés pour examiner les connexions synaptiques simples: La première est la stimulation minimale, where une fibre présynaptique est présumé stimulée extracellulaire. La deuxième technique est jumelé enregistrements, où deux enregistrements simultanés de cellules entières de neurones reliés par des synapses est effectuée. Un avantage majeur de stimulation minimal est qu&#39;elle est rapide et relativement simple à réaliser, comportant le placement d&#39;une électrode de stimulation extracellulaire dans le tube tout en enregistrant simultanément des axones d&#39;un neurone post-synaptique. La principale préoccupation lors de l&#39;utilisation de cette technique est que la stimulation fiable d&#39;une seule cellule peut rarement être garantie procès après procès. Au cours des quinze dernières années, nous avons utilisé couramment associé enregistrements de cellules entières de deux neurones pyramidaux reliés par des synapses 6-17. L&#39;avantage majeur de cette technique est que seul neurone présynaptique est stimulée cohérente et fiable. Il permet aussi non seulement la caractérisation électrophysiologique, mais aussi la manipulation pharmacologique du neurone présynaptique 6,18 &lt;/ Sup&gt;. Cependant, la probabilité de la connectivité synaptique entre les neurones est faible, ce qui rend difficile les paires connectées à obtenir 19. L&#39;utilisation de cultures de tranches de cerveau organotypiques de contourner cet obstacle comme la connectivité synaptique peut rétablir in vitro et d&#39;ailleurs la nature de la connexion qui en résulte est semblable à celle dans le tissu cérébral 20 native. En outre, les cultures organotypiques expriment LTP, LTD 7-10,12-15,21 et d&#39;autres formes de plasticité synaptique à court terme, y compris la facilitation double choc (PPF) et la dépression (PPD) 6,22,23, permettant mécanismes de plasticité à être étudiée dans des paires de neurones. Nous décrivons ici en détail la méthodologie nécessaire pour atteindre des succès enregistrements appariés dans ce système in vitro. Cette information peut aisément être adapté à d&#39;autres systèmes expérimentaux, y compris les tranches aiguës et d&#39;autres régions du cerveau.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Organotypic cultures</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:64px;">Paired recordings</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable motorized micromanipulators&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Shallow tissue bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DIC camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M Tris stock solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vibration isolation table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic-coated miniature spatulas&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Upright microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">soft paintbrush&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Data acquistion and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">manual tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrode puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#2 filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5&#160; forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane inserts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CO2 incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Class II hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paired whole cell recordings in organotypic hippocampal slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Connectivité synaptique est évident en stimulant le neurone présynaptique de tirer un potentiel d&#39;action en passant une impulsion de courant de dépolarisation (typiquement 20-50 pA pour 20 ms) via l&#39;électrode d&#39;enregistrement. La trace de courant post-synaptique est alors examiné pour rechercher la présence d&#39;un RPEC monosynaptique évoquée à court (&lt;5 ms) et des temps de latence cohérents après le pic du potentiel d&#39;action présynaptique (Figure 3A). Dans la plupart de...

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Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Appariés enregistrements de cellules entières dans organotypiques coupes d&#39;hippocampe

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

paired-whole-cell-recordings-in-organotypic-hippocampal-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K vues.  University of Auckland. Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Vidéo: Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Jumelés Recordings Patch Clamp du motoneurone et de muscle ciblé squelettiques chez le poisson zèbre

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Recherche

Neurosciences

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Cultures organotypiques d&#39;hippocampe Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Enregistrement à partir de cellules entières une préparation de tranches organotypiques du néocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Enregistrements tableau multi-électrodes des Avalanches neuronale dans des cultures organotypiques

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Hippocampe organotypiques comme modèle d’étude Neuroprotection et son caractère invasif des cellules tumorales

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.