Nous tenons à remercier Mathias S. Dick, Roland F. Dreier et Sebastian Rühl de discussion. Ce travail a été soutenu par un professeur FNS PP00P3_139120 / 1 et une Université de Bâle subvention de projet ID2153162 à PB

1. Digitonine Assay avec mCherry exprimant Salmonella (FACS-base Analyse) <ol><li> Préparation des bactéries Remarque: Salmonella de type sauvage SL1344 (Résistance à la streptomycine) exprimant mCherry partir d&#39;un plasmide (pFPV codant mCherry sous le promoteur de RPSM) est utilisé dans cet essai. Phagocytose bactérienne et la prolifération où pas modifiée par l&#39;expression constitutive de mCherry (données non présentées) 16. <ol><li> Inoculer la souche 1 jour avant l&#39;infection dans 3 ml de milieu LB additionné de streptomycine (90 ug / ml) et de l&#39;ampicilline (100 ug / ml, vecteur exprimant mCherry) dans un agitateur à 37 ° CO / N. </li></ol></li><li> Étalement des cellules de l&#39;infection. <ol><li> BMDMs de type sauvage de semences dans une plaque à 24 puits à une densité de 1,25 x 10 5 cellules / puits dans 1 ml de milieu de macrophages primaire (DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (FCS, inactivé à la chaleur, 56 ° C, 30 min ), 1% HEPES, 1% d&#39;acides aminés non essentiels (AENA), 1% de L-glutamine et 10% L929 surnageant (milieu conditionné à partir de facteur de stimulation des colonies (M-CSF des macrophages) produisant des cellules L929). puits de semences conformément au tableau 1 pour tenir compte des conditions individuelles. Ajouter des lamelles dans les puits utilisés comme témoins (Tableau 1). </li><li> Incuber les cellules pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Perméabilisation </td><td colspan="3"> Tachant </td></tr><tr><td></td><td> Lamelle de verre </td><td> Salmonella </td><td> Digitonine </td><td> Saponine </td><td> anti-Salmonella </td><td> anti-Calnexin </td><td> anti-PDI </td></tr><tr><td> A1 (échantillon) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2 (échantillon) </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3 (échantillon) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4 (pas de contrôle de perméabilisation) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5 (contrôle complet de perméabilisation) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1 (colorées pour la calnexine) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2 (colorées pour la calnexine) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3 (colorées pour la calnexine) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1 (coloréespour PDI) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2 (colorées pour PDI) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3 (colorées pour PDI) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Schéma de placage pour les macrophages dérivés de moelle osseuse (BMDMs) dans un format de 24 puits pour une infection ultérieure par la bactérie Salmonella, perméabilisation, et la coloration * Selon que le protocole 1 ou 2 du protocole est fait.. <ol start="3"><li> Préparer les bactéries de l&#39;infection. <ol><li> Le jour suivant, déterminer la concentration de Salmonella dans la culture d&#39;une nuit en diluant la culture 1:10 dans du PBS et mesure de la DO 600 contre seulement un témoin PBS. Cela garantit que la DO 600 est mesuré dans le lgamme inear du spectrophotomètre. </li><li> Calculer la concentration de Salmonella par ml. Une DO600 de 1 correspond à 1 x 10 9 bactéries. </li><li> Diluer les bactéries dans un milieu macrophage pour atteindre une concentration de Salmonella de 1,25 x 10 6 cellules / ml. </li></ol></li><li> L&#39;infection des cellules avec Salmonella. <ol><li> Éliminer le milieu de BMDMs. Ajouter 1 ml de milieu de macrophages dans les puits témoins non infectées (B1-B3, C1-C3). Ajouter 1 ml de suspension de Salmonella godets A1 - A5 pour accéder à une multiplicité d&#39;infection (moi) de 10 bactéries par cellule. </li><li> Centrifuger la plaque pendant 15 minutes à 300 xg à 37 ° C pour synchroniser l&#39;infection. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Tuer Salmonella extracellulaire avec la gentamicine. <ol><li> À 1 h post-infection, enlever la plaque de l&#39;incubateur et ajouter 0,1 ml de milieu macrophage contenant 0,1 mg / ml de gentamicinepour tuer les bactéries extracellulaires. Ajouter gentamicine à tous les puits, même à des témoins non infectés, afin de garantir que toutes les cellules sont traitées de la même manière. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Lavage des cellules. <ol><li> A 2 heures après l&#39;infection, retirez la plaque de l&#39;incubateur et laver tous les puits 2x avec 1 ml de DMEM brut (préchauffé à 37 ° C) et le remplacer par milieu macrophage (préchauffé à 37 ° C) contenant 10 pg / ml &#160; Gentamycine pour empêcher la croissance de toutes les bactéries extracellulaires restantes. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Préparation des tampons fraîches avec des détergents et des anticorps. <ol><li> Juste avant le point de temps désiré de l&#39;analyse, préparer une solution de pâte fraîche de digitonine à 1 mg / ml dans le tampon KHM (110 mM acétate de potassium, HEPES 20 mM, MgCl2 2 mM, pH 7,3). Filtrer le bouillon et diluer dans KHM tampon à une concentration de travailde 50 pg / ml de digitonine. En outre, préparer une solution à 0,1% de saponine dans du tampon KHM, un anticorps anti-Salmonella couplé au FITC (CSA-1-FITC) à 1/500, anti-calnexine à 1/100 ou anti-PDI à 1/100 dans KHM Tampon complété par 3% de BSA. </li></ol></li><li> Perméabilisation cellulaire. <ol><li> Retirer la plaque de l&#39;incubateur et laver les puits 3x avec 0,5 ml de tampon KHM (préchauffé à 37 ° C). Retirer KHM tampon et ajouter 0,25 ml de tampon plaine KHM aux puits A4 et B1 / C1, KHM tampon avec de la digitonine aux puits A1 - A3 et B2 / C2 ou KHM tampon avec de la saponine à godets A5 et B3 / C3 (selon le tableau 1). Incuber pendant exactement 1 min à température ambiante et laver immédiatement tous les puits 3x avec 0,5 ml de tampon KHM (pré-chauffé à 37 ° C). </li></ol></li><li> Coloration d&#39;anticorps primaire. <ol><li> Retirez le tampon KHM et ajouter les solutions d&#39;anticorps primaires (de chèvre anti Salmonella -FITC, 250 pl / puits, 0,1 pg / ml) dans les puits appropriés (Figure 1 </stRong&gt;, tableau 1). Incuber la plaque pendant 15 min dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Laver les cellules 1x avec 1 ml de PBS. </li></ol></li><li> Les cellules infectées (puits de A1 - A5): analyse de FACS <ol><li> Laver les cellules 3x avec PBS et ajouter 0,5 ml de PBS glacé contenant 0,1% de Triton. Transfert à un tube de 5 ml FACS avec bouchon de crépine de cellules pour briser des agrégats de cellules. Garder les échantillons sur la glace. </li><li> Analyser les échantillons d&#39;un FACS. Utilisation des commandes entièrement perméabilisées, réglez la porte pour le total des bactéries basée sur l&#39;avant et la dispersion latérale (FSC / SSC) en premier, et le signal mCherry (610 nm ± 20 nm de filtre). </li><li> Ensuite, analyser le signal FITC dans la population bactérienne totale en utilisant les contrôles perméabilisées entièrement perméabilisées et non pour régler les portes pour les bactéries cytosoliques (FITC +, mCherry +) et les bactéries vacuolaires (FITC, mCherry +) (Figure 3). </li><li> Avec les portes définies, analyser les échantillons et déterminer le pourcentage de vs cytosoliquevacuolaires bactéries en utilisant le logiciel FlowJo selon le protocole du fabricant. </li></ol></li><li> Contrôles de perméabilisation non infectées (puits B1 - B3, C1 - C3): microscopie <ol><li> Fixation <ol><li> Retirer du PBS et ajouter 250 microlitres de PFA 4% dans du PBS. Incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Laver les puits avec 2x 1 ml de PBS et on ajoute 250 ul de 0,1 M de glycine dans du PBS pendant 10 min à étancher le fixateur. Laver les puits avec 2x 1 ml de PBS. </li></ol></li><li> Coloration d&#39;anticorps secondaire. <ol><li> Contrôle de perméabilisation tache pendant une heure à température ambiante avec des anticorps secondaires couplés à des fluorophores appropriés dans du PBS supplémenté avec 0,1% de saponine et 3% de BSA à perméabiliser les cellules pleinement. </li><li> Laver lamelles de 3x avec 1 ml de PBS et le montage des lamelles couvre-objet pour l&#39;analyse dans un milieu de montage avec du DAPI (1,5 ug / ml). </li></ol></li><li> analyse par microscopie. <ol><li> Analyser les lamelles avec les contrôles à un grossissement de 63X 40X ou en utilisant un confocal fluomicroscope rescence. Si la perméabilisation a travaillé, il devrait y avoir aucune coloration pour des cellules non perméabilisées, Calnexin coloration pour les deux cellules et digitonin- saponine perméabilisées et PDI coloration uniquement pour les cellules de saponine perméabilisées (figure 4). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Digitonine Assay avec Unlabeled Salmonella (analyse basée Microscopie-) <ol><li> Préparation des bactéries pour O / N cultures. <ol><li> Inoculer non marqué Salmonella de type sauvage SL1344 (Résistance à la streptomycine) 1 jour avant l&#39;infection dans 3 ml de milieu LB additionné de streptomycine (90 pg / ml) dans un shaker à 37 ° CO / N. </li><li> Étalement des cellules de l&#39;infection. <ol><li> BMDMs de semences dans une plaque à 24 puits contenant des lamelles de verre stériles à une densité de 1,25 x 10 5 cellules / puits dans 1 ml de milieu macrophage (DMEM complété avec 10% de sérum de veau foetal (FCS, de-complétés, 56 ° C,30 min), 1% HEPES, 1% des acides aminés L-non-essentiels (NEAA), 1% de L-glutamine et 10% L929 surnageant). puits de semences conformément au tableau 1 pour tenir compte des conditions individuelles. </li><li> Incuber les cellules S / N, dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Préparer les bactéries de l&#39;infection. <ol><li> Le jour suivant, déterminer la concentration de Salmonella dans la culture O / N par dilution de la culture 1:10 dans du PBS et mesure de la DO 600 contre seulement un témoin PBS. Cela garantit que la DO 600 est mesurée dans la plage linéaire du spectrophotomètre. </li><li> Déterminer la concentration de Salmonella par millilitre. Une DO 600 de 1 correspond à 1 x 10 9 bactéries. </li><li> Diluer les bactéries dans un milieu macrophage pour atteindre une concentration de Salmonella de 1,25 x 10 6 cellules / ml. </li></ol></li><li> L&#39;infection des cellules avec Salmonella. <ol&gt; <li> Éliminer le milieu de tous les puits. Ajouter 1 ml de milieu de macrophages brut aux puits témoins non infectés (B1 - B3, C1 - C3). Ajouter 1 ml de suspension de Salmonella godets A1 - A5 pour accéder à une multiplicité d&#39;infection (moi) de 10 bactéries par cellule. </li><li> Centrifuger la plaque pendant 15 minutes à 300 xg à 37 ° C pour synchroniser l&#39;infection. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Tuer Salmonella extracellulaire avec Gentamycin. <ol><li> À 1 h post-infection, enlever la plaque de l&#39;incubateur et ajouter 0,1 ml de milieu macrophage contenant 1 mg / ml Gentamycin pour tuer les bactéries extracellulaires à tous les puits. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Lavage des cellules. <ol><li> À 2 heures post-infection, enlever la plaque de l&#39;incubateur et laver chaque puits 3x avec 1 ml de milieu macrophage frais contenant 10 pg / ml Pour empêcher la gentamycinela croissance de toutes les bactéries extracellulaires restantes. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Préparation des tampons fraîches avec des détergents et des anticorps. <ol><li> Juste avant le point de temps désiré de l&#39;analyse, préparer une solution de pâte fraîche de digitonine à 1 mg / ml dans le tampon KHM (110 mM acétate de potassium, HEPES 20 mM, MgCl2 2 mM, pH 7,3). Filtrer le bouillon et diluer dans KHM tampon à une concentration de travail de 50 pg / ml de digitonine. </li><li> En outre, à préparer une solution de 0,1% de saponine dans du tampon KHM, FITC anti- Salmonella (CSA-1, 0,1 ug / ml), anti-calnexine à 1/100 ou anti-PDI au 1/100 dans du tampon additionné de KHM 3% de BSA (voir le tableau des matériaux pour la concentration d&#39;anticorps). </li></ol></li><li> Perméabilisation cellulaire. <ol><li> Retirer la plaque de l&#39;incubateur et laver les puits 3x avec 0,5 ml de tampon KHM (préchauffé à 37 ° C). Retirer KHM tampon et ajouter 0,25 ml de tampon plaine KHMles puits A4 et B1 / C1, KHM tampon avec de la digitonine à godets A1 - A3 et B2 / C2 ou KHM tampon avec de la saponine à puits A5 et B3 / C3 (selon le tableau 1). Incuber pendant exactement 1 min à température ambiante et laver immédiatement tous les puits 3x avec 0,5 ml de tampon KHM (pré-chauffé à 37 ° C). </li></ol></li><li> Coloration d&#39;anticorps primaire. <ol><li> Retirer le tampon KHM et ajouter les solutions d&#39;anticorps primaire (anticorps de chèvre anti-FITC Salmonella CSA1, 250 ul / puits, 0,1 ug / ml) dans les puits appropriés (figure 2, tableau 1). Incuber la plaque pendant 15 min dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. Laver 3x avec 1 ml de PBS. </li></ol></li><li> Fixation. <ol><li> Retirer du PBS et ajouter 250 microlitres de PFA 4% dans du PBS. Incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Laver les puits avec 2x 1 ml de PBS et on ajoute 250 ul de 0,1 M de glycine dans du PBS pendant 10 min à étancher le fixateur. Laver les puits avec 2x 1 ml de PBS. </li></ol></li><li> TotalSalmonella coloration des échantillons infectés. <ol><li> Laver lamelles de 3x avec PBS avec 0,1% de saponine / 3% de SAB et les échantillons incuber avec un anticorps anti-CSA1 (chèvre anti-CSA1, 0,1 ug / ml, souris anti-LPS fonctionne aussi bien, 0,1 ug / ml) pendant 1 heure à température ambiante dans du PBS avec 0,1% de saponine / 3% de SAB. </li><li> Laver 3x dans PBS avec 0,1% de saponine / 3% de BSA. Incuber vos échantillons avec un anticorps secondaire anti-chèvre couplé à un fluorophore de choix dans de la PBS avec 0,1% de saponine / 3% de SAB pendant 30 minutes à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver lamelles de 3x avec 1 ml de PBS et le montage des lamelles couvre-objet pour l&#39;analyse dans un milieu de montage avec du DAPI (1,5 ug / ml). </li></ol></li><li> analyse par microscopie. <ol><li> Acquérir des données avec un microscope confocal en comptant Salmonella cytosolique (anti-Salmonella -FITC positif) et le total Salmonella (positive double) (Figure 5). contrôles de perméabilisation devraient montrer: pas de coloration pour les cellules non perméabilisées, Calnexin scontenant des cellules perméabilisées digitonine-PDI et la coloration pour des cellules de saponine perméabilisées (figure 4). Wells A4 et A5 se servir de témoins internes pour la coloration Salmonella. </li></ol></li></ol></li></ol>

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We have nothing to disclose.

Perméabilisation différentiel est une méthode simple et robuste pour analyser et de quantifier la distribution subcellulaire des bactéries pathogènes entre les compartiments vacuolaires et le cytosol. Le même essai a été utilisé avec succès par des bactéries telles que Francisella novicida 2,4 et 12 Shigella flexneri. Cependant, étant donné que beaucoup pathogène intracellulaire altérer ou modifier les structures endomembranaires d&#39;accueil, la robustesse de la p...

Les bactéries pathogènes intracellulaires se répliquent soit directement dans le cytosol de la cellule hôte, ou dans des compartiments spécialisés vacuolaires 1. Durant la phase initiale de l&#39;infection la plupart des pathogènes se internalisés soit par phagocytose par des cellules spécialisées (telles que les macrophages) ou par la promotion active de leur propre absorption dans des cellules non-phagocytaires. Dans les cellules phagocytaires, le phagosome fusionne généralement avec les lysosomes pour former un compartiment de dégradation, où les particules phagocytées sont digérés. Cytosoliques bactéries spécialisées, telles que Francisella novicida ou Shigella flexneri, échapper à la dégradation du phagosome en induisant la rupture du phagosome et d&#39;échapper par la suite dans le cytosol 2,3. Cela nécessite mécanisme de virulence associés tels que l&#39;île Francisella pathogénicité (FPI) ou Shigella flexneri SST3, qui injecte des protéines effectrices qui favorisent vacuolaire rupture 2-4. Les caractéristiques de cytosol de la cellule hôteun certain nombre de récepteurs conservés de reconnaissance des formes qui reconnaissent normalement la présence de pathogènes et induisent immunitaire inné signalisation 5. En outre, xenophagy, une forme anti-microbienne de l&#39;autophagie peut dégrader les bactéries qui pénètrent dans le cytosol. Cytosoliques bactéries sont normalement bien adaptés à émousser ou de contourner ces réponses en utilisant différentes stratégies. Par exemple, Francisella modifie ses LPS pour éviter la reconnaissance de l&#39;hôte et Shigella empêche le recrutement de l&#39;autophagie en utilisant des protéines effectrices sécrétées 6,7. Une autre stratégie pour échapper à la dégradation lysosomale est employé par le modèle vacuolaire pathogène Salmonella enterica sérotype Typhimurium, par la suite dénommée Salmonella typhimurium. Salmonella utilise un SST3 d&#39;injecter effecteurs qui remodèlent le phagosome initiale dans sa niche intracellulaire, la Salmonella contenant vacuole (SCV) 8,9. La manipulation continue des voies d&#39;accueil estnécessaire pour maintenir cette vacuole en recrutant des lipides et autres nutriments vers la vacuole. En effet, un mutant de Salmonella SIFA ne parvient pas à maintenir la stabilité vacuolaire, et pénètre dans le cytosol des cellules hôtes en quelques heures après l&#39;infection, ce qui conduit à l&#39;activation des voies immunitaires innées et le recrutement de autophagie 8. Évasion Vacuolar de Salmonella varie en fonction du type de cellule qui est des études, et plusieurs rapports ont montré que dans les cellules épithéliales même WT Salmonella peut échapper à la SCV et hyperreplicate dans le cytosol 10. Des rapports récents montrent que la détection immunitaire innée des pathogènes vacuolaires dépend aussi de la capacité de l&#39;hôte à reconnaître et à déstabiliser vacuoles contenant pathogènes (PCV) 11-14. Étant donné que l&#39;hôte ou des bactéries génotype peuvent affecter la distribution des bactéries intracellulaires entre le vacuolaire et le compartiment cytosolique, il est nécessaire de quantifier le nombre de vacuolaire vs.bactéries cytosoliques. Etant donné que, dans la plupart des configurations expérimentales cellules hôtes sont infectées avec plus d&#39;une bactérie, et par la suite peuvent abriter plusieurs bactéries dans différents compartiments sous-cellulaires, une technique est nécessaire qui permet la quantification de la teneur en bactéries simples. Perméabilisation sélective (également connu sous le nom d&#39;essai de protection phagosome) fournit cette résolution 2,4,10,12. Le dosage est basé sur la perméabilisation sélective de la membrane plasmique de la cellule hôte avec le détergent digitonine, ce qui laisse les membranes vacuolaires intact et permet ainsi la coloration sélective de bactéries avec des anticorps cytosoliques. Ici, nous fournissons deux protocoles de quantification des cytosolique et vacuolaire Salmonella typhimurium en utilisant perméabilisation différentiel. Le principe de cette méthode est décrite dans la figure 1: les macrophages de moelle osseuse dérivés (BMDMs) sont infectées avec phase stationnaire mCherry exprimant Salmonella. Phase stationnaire Salmonella besoin to être utilisés car ils régulent à la baisse l&#39;expression de la SPI-1 SST3, dont l&#39;activité serait autrement reconnu par l&#39;inflammasome NLRC4 et induire la mort cellulaire rapide (pyroptosis) de la BMDMs 15. Suite à l&#39;infection des cellules sont lavées et traitées avec 50 pg / ml de digitonine pendant 1 minute. Les cellules sont lavées de nouveau et immédiatement incubées avec des anticorps anti-Salmonella couplés au FITC pour marquer des bactéries avec accès au cytosol. Après un lavage supplémentaire cellules sont lysées de pas et le pourcentage de mCherry + (vacuolaire) et FITC + / + mCherry (cytosolique) de bactéries est déterminée par FACS. Nous présentons également une adaptation de ce procédé qui peut être utilisé en l&#39;absence de souches exprimant des protéines fluorescentes sont disponibles (Figure 2). Des étapes supplémentaires sont introduites après l&#39;étiquetage FITC dans lequel les cellules sont fixées et complètement perméabilisées. Par la suite, toutes les bactéries sont colorées avec des anticorps anti-Salmonella et des anticorps secondaires correspondantes. Detection se fait alors par microscopie à la place de l&#39;analyse FACS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td>50ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>mpbio</td>
			<td>219998380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>791733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Salmonella CSA-1-FITC</td>
			<td>KPL</td>
			<td>01-91-99-MG</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Salmonella CSA-1</td>
			<td>KPL</td>
			<td>02-91-99-MG</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calnexin</td>
			<td>Enzo Lifesciences</td>
			<td>SPA-860D</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PDI</td>
			<td>Enzo Lifesciences</td>
			<td>SPA-890</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vectorlabs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit antibody-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11070</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15710-49</td>
			<td>100ug/mL and 10ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Amimed</td>
			<td>5-13K00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>imaging done at 63x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fortessa</td>
			<td>BD technologies</td>
			<td></td>
			<td>detection mCherry 610 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fortessa</td>
			<td>BD technologies</td>
			<td></td>
			<td>detection FITC 530 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cytosolic vs. vacuolar salmonella in primary macrophages by differential permeabilization

Bactéries pathogènes intracellulaires peuvent se répliquer dans le cytosol ou dans les vacuoles contenant des agents pathogènes spécialisés (PCV). Pour atteindre le cytosol, des bactéries telles que Shigella flexneri et Francisella novicida besoin pour induire la rupture du phagosome. En revanche, Salmonella typhimurium se réplique dans un compartiment vacuolaire, connu sous le nom de Salmonella vacuole contenant (SCV). Cependant certains mutants de Salmonella ne parviennent pas à maintenir l&#39;intégrité SCV et sont ainsi libérés dans le cytosol. Le pourcentage de bactéries par rapport cytosolique vacuolaires sur le niveau de bactéries individuelles peut être mesurée par perméabilisation différentiel, également connu comme dosage phagosome-protection. L&#39;approche fait usage de la propriété de détergent digitonine à se lier sélectivement cholestérol. Étant donné que la membrane plasmique contient plus de cholestérol que les autres membranes cellulaires, la digitonine peut être utilisé pour perméabiliser sélectivement la membrane plasmique tout en laissant les membranes intracellulairesintact. En bref, suivant l&#39;infection par l&#39;agent pathogène exprimant une protéine marqueur fluorescent (par exemple mCherry entre autres), la membrane plasmique des cellules hôtes est perméabilisées par une courte incubation dans un tampon contenant de la digitonine. Les cellules sont ensuite lavées et incubées avec un anticorps primaire (couplé à un fluorophore voulue) dirigé contre la bactérie de choix (par exemple FITC anti- Salmonella) et lavées de nouveau. Si les bactéries non marquées sont utilisées, une étape supplémentaire peut être effectuée, dans lequel toutes les membranes sont perméabilisées et toutes les bactéries colorées avec un anticorps correspondant. Suite à la coloration, le pourcentage de bactéries vacuolaires cytosoliques et peut être quantifiée par FACS ou par microscopie compter les événements simples ou doubles-positives. Ici, nous fournissons des détails expérimentaux pour l&#39;utilisation de cette technique par la bactérie Salmonella typhimurium. L&#39;avantage de ce test est que, contrairement à l&#39;autre dosage, il fournit une quantification du niveau de seul bacteria, et si analysée par microscopie fournit le nombre exact de bactéries cytosolique et vacuolaires dans une cellule donnée.

Figure 1 et la Figure 2 montrent les schémas de l&#39;essai de digitonine décrites dans le protocole 1 et 2 du protocole illustrant les étapes critiques dans le protocole et les résultats obtenus. La figure 3 montre des résultats typiques FACS. Les contrôles positifs et négatifs sont utilisés pour définir les portes pour mCherry + / bactéries (FITC vacuolaire Salmonella) et mCherry + / FITC + bactéries Salmonella (cytosolique). Sur la base de ces portes, le pour...

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Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Quantification des cytosolique vs Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Dans les macrophages primaires par différentiel Perméabilisation

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

quantification-cytosolic-vs-vacuolar-salmonella-primary-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

10.8K vues.  University of Basel. We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

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Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

Mesure de cytosolique de Ca 2 + En isolé lymphatique contractiles

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Recherche

Immunologie et infection

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Simples mesures de cellules de rupture Vacuolar causées par des pathogènes intracellulaires

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

À haut débit de dosage de phénotype<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Association Typhimurium, Invasion, et la réplication dans les macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

La transfection très efficace des droits de THP-1 par les macrophages nucléofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Protéomique profilage des macrophages par électrophorèse 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

Phagosome Migration et Velocity Mesurée en direct primaire des macrophages humains infectés par le VIH-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

Caractérisation phénotypique des macrophages du Rat Kidney par cytométrie de flux

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-lapse imagerie 3D de phagocytose par les Macrophages de souris

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

Quantification de l’amélioration dépendante des anticorps du Virus dans les cellules humaines primaires Zika

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...