Michael Henry, Dublin City University, veuillez contribué à la collecte de données et l&#39;analyse de la figure 5. Ce travail a été soutenu en partie par (1) l&#39;Université George Mason, (2) l&#39;Italien IstitutoSuperiore di Sanita &#39;dans le cadre de l&#39;Italie / Etats-Unis accord de coopération entre le ministère américain de la Santé et des Services sociaux, de l&#39;Université George Mason, et le ministère italien de la Santé publique, (3) des NIH, les subventions du programme de IMAT 1R21CA137706-01 et 1R33CA173359-01 à LAL, et (4) Ceres Nanosciences, Inc .

Le plasma humain et l&#39;urine a été prélevé sur des donneurs volontaires sains, avec le consentement éclairé écrit, à la suite Institutional Review Board de l&#39;Université George Mason protocoles approuvé. Les bailleurs de fonds ont été répartis de manière égale entre les hommes et les femmes de race blanche âgés de 25 et 42 échantillons ont été analysés individuellement et n&#39;ont pas été regroupées. 1. nanoparticules traitement de sérum ou de plasma échantillons Faible abondance de marqueurs biologiques potentiels dans le plasma sont capturés, en solution, avec des nanoparticules d&#39;hydrogel. Les particules sont ajoutées au plasma, incubé, séparé par centrifugation, lavées, et les protéines capturées sont éluées. Les protéines éluées sont séchés sous un courant d&#39;azote pour le séquençage par spectrométrie de masse et en aval identification. <ol><li> Diluer 500 ul de sérum de 1: 2 avec du Tris-HCl 50 mM pH 7 (500 ul de sérum de 500 ul de Tris-HCl +) dans un microtube de centrifugation. </li><li> Ajouter 500 ul de poly (NiPAM / AAC) noyau nanoparticles. Incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Tourner l&#39;échantillon à 16 100 x g, 25 ° C pendant 10 min dans une centrifugeuse équipée d&#39;un rotor à angle fixe. Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 500 ul de thiocyanate de sodium (25 mM) à la pastille. Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois. </li><li> Tourner l&#39;échantillon à 16 100 x g, 25 ° C pendant 10 min dans une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe. Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;eau MilliQ à la pastille de nanoparticules. Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois. </li><li> Tourner l&#39;échantillon à 16 100 x g, 25 ° C pendant 10 min dans une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe. Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Préparer le tampon d&#39;élution frais: ajouter 700 ul d&#39;acétonitrile à 300 ul d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium dans un tube propre. Attention: l&#39;hydroxyde d&#39;ammonium est corrosif. Utiliser avec une ventilation appropriée. Remarque: Le tampon d&#39;élution doit être préparationared immédiatement avant utilisation. Ne pas stocker le tampon d&#39;élution. </li><li> Ajouter 300 ul de tampon d&#39;élution à la pastille de nanoparticules. Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois. Incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Tourner l&#39;échantillon à 16 100 x g, 25 ° C pendant 10 min dans une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe. Retirer et mettre de l&#39;éluat dans un tube à centrifuger propre, étiqueté. </li><li> Répétez les étapes 1.9 à 1.10. Combinez les deux éluats dans un tube à centrifuger. </li><li> Sécher les éluats sous flux d&#39;azote dans un collecteur d&#39;évaporateur d&#39;azote à 42,1 ° C, avec un débit d&#39;air fixé à 8 (Figure 2F). </li><li> Stocker l&#39;éluat séché à température ambiante pendant O / N stockage, ou à -20 ° C pour le stockage à long terme, avant la spectrométrie de masse, western blot ou dosages ELISA (en option). </li></ol> 2 Traitement des nanoparticules des échantillons d&#39;urine L&#39;urine normale contient moins de 30 mg / dl de protéine etmoins de 1 + sang. Cependant, de nombreuses maladies / conditions peuvent modifier les niveaux normaux de protéines dans l&#39;urine et le sang. Pour aider à déterminer le volume optimal de nanoparticules à ajouter à l&#39;échantillon d&#39;urine, une analyse d&#39;urine est réalisée avant la récolte nanoparticule. biomarqueurs d&#39;urine peuvent exister dans des concentrations extrêmement faibles, ce qui peut nécessiter l&#39;optimisation du ratio de nanoparticules au volume d&#39;urine. Cette procédure décrit nanoparticule récolte des échantillons d&#39;urine pour analyse western blot en aval. <ol><li> Prélever des échantillons d&#39;urine dans un endroit propre, sec gobelet en plastique. A 22 ml de volume minimum est nécessaire. urine de conserver les échantillons à -80 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;analyse. </li><li> Décongeler l&#39;urine congelés à température ambiante ou à 4 ° CO / N. Mélanger brièvement sur un vortex. Verser au moins 22 ml d&#39;urine dans un fond conique tube en polypropylene de 50 ml. </li><li> Produit dérivé de l&#39;urine dans une centrifugeuse à rotor pivotant à 3700 xg pendant 15 min. Décanter l&#39;urine, sans perturber le culot, dans un polypr fond conique de 50 ml propreTube opylene. Éliminer le culot. </li><li> Effectuer l&#39;analyse d&#39;urine en utilisant un multi-analyte &quot;urine jauge&quot; bandelette réactive. Remarque: stocker les bandelettes réactives dans un récipient hermétiquement fermé à l&#39;abri des rayons du soleil et de l&#39;humidité 17, 18 direct. <ol><li> Posez la bande de réactif, face vers le haut, sur une serviette en papier sec. </li><li> Utiliser une pipette jetable de 1 ml d&#39;aspirer l&#39;urine préparé à l&#39;étape 2.3. </li><li> Réglez une minuterie pendant 2 min, mais ne commencez pas. Passer rapidement 1 - 2 gouttes d&#39;urine sur chaque plot de test de la bandelette réactive. Commencer immédiatement la minuterie. Note: Ne pas plonger la bandelette réactive directement dans le récipient d&#39;urine. Les indicateurs de colorant / chimiques de la bandelette réactive peuvent potentiellement s&#39;écouler de la bandelette réactive dans le réservoir d&#39;urine. </li><li> À l&#39;heure indiquée sur le contenant de bandelettes réactives, enregistrer les résultats qualitatifs pour les différents analytes sur la bandelette réactive en comparant la couleur des bandelettes réactives individuelles à l&#39;indica code couleur correspondantteurs sur le conteneur de réactif. Les résultats d&#39;urine normales typiques sont: (normal ou négatif) pour le sang, les protéines, les leucocytes, nitrite, glucose, cétone, la bilirubine, et urobilinogen; PH de l&#39;urine (5,5 à 7,0); densité (1,001 à 1,020). Remarque: Les niveaux élevés de protéines dans un échantillon d&#39;urine peuvent rivaliser avec la protéine d&#39;intérêt pour les sites sur les nanoparticules de liaison. Afin de maximiser la récolte des protéines avec des nanoparticules, l&#39;/ volume volume d&#39;urine nanoparticule peut être ajustée soit à concurrence de fin de course à partir de protéines de grande abondance, ou peut être optimisé pour la récolte des protéines qui existent dans de très faibles concentrations. Si la valeur de la protéine de l&#39;urine est 1 + ou plus, ajouter des volumes 2x de nanoparticules dans l&#39;étape 2.5 ci-dessous. Si l&#39;analyte d&#39;intérêt est une protéine très abondante faible, il peut être nécessaire d&#39;augmenter le volume de nanoparticules jusqu&#39;à 2 ml (figure 3). </li></ol></li><li> Transférer 20 ml de l&#39;urine clarifiée provenant de l&#39;étape 2.3 dans 50 ml d&#39;un fond conique propre tube en polypropylène. Needs a contextperturber les débris / granulés qui peuvent être dans le fond du tube d&#39;urine. Ajouter 200 ul de nanoparticules à la 20 ml d&#39;échantillon d&#39;urine. Mélanger brièvement sur un vortex. Remarque: si la valeur de la protéine de l&#39;urine est 1 + ou plus, ajouter 400 pl de nanoparticules de 20 ml d&#39;urine. </li><li> Incuber le mélange urine / nanoparticule pendant 30 min à température ambiante, sans balancement / mélange. </li><li> Faites tourner la suspension urine / nanoparticules dans une centrifugeuse équipée d&#39;un rotor swing-out à 3700 g pendant 10 min. Remarque: Si un plomb n&#39;est pas visible de centrifugation suivant, tourner les échantillons pour un supplément de 2 - 7 min. </li><li> Retirer et jeter le surnageant. Ajouter l&#39;eau de 500 pi au culot de nanoparticules. </li><li> Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois. Transférer la solution de nanoparticules à un 1,5 ml microtube propre. </li><li> Tourner les nanoparticules dans une centrifugeuse équipée d&#39;un rotor à angle fixe à 16 100 xg pendant 10 min. Remarque: Si un plomb n&#39;est pas fol visibleLowing centrifugation, tourner les échantillons pour un supplément de 2 - 7 min. </li><li> Retirer et jeter le surnageant. </li><li> Répétez les étapes 2,8 et 2,11 (deux fois) avec 200 ul 18 MilliQ eau pour se laver les nanoparticules. </li><li> Préparer tampon d&#39;élution frais: Ajouter 970 ul d&#39;acétonitrile à 30 l&#39;hydroxyde d&#39;ammonium ul dans un tube propre. Attention: l&#39;hydroxyde d&#39;ammonium est corrosif. Utiliser avec une ventilation appropriée. Remarque: Le tampon d&#39;élution doit être préparée immédiatement avant utilisation. Ne pas stocker le tampon d&#39;élution. </li><li> Ajouter du tampon d&#39;élution de 20 ul de la pastille de nanoparticules. Remettre en suspension des nanoparticules par pipetage vigoureusement de haut en bas plusieurs fois. Incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Faites tourner les échantillons de nanoparticules à 16 100 g pendant 10 min. Retirer et conserver le surnageant dans un, 1,5 ml microtube propre. Ne pas perturber le culot de nanoparticules. Jeter le culot dans la poubelle de risque biologique. </li><li> Placer les échantillons dans un rack dans une hotte chimique. Ouvrir les bouchons et augmenterUbate à température ambiante pendant 30 min. Sinon, placez les échantillons sous flux d&#39;azote à 40 ° C jusqu&#39;à ce que sec (1 - 2 heures). </li><li> Ajouter 15 ul de Tris-glycine SDS tampon d&#39;échantillon (2x) pour les échantillons. Chauffer à 100 ° C dans un bloc chauffant pendant 5 minutes avec les couvercles ouverts ou jusqu&#39;à ce que le volume laissé dans le tube n&#39;est pas supérieure à 20 pl. Remarque: ne pas utiliser un bain d&#39;eau bouillante. L&#39;humidité du bain d&#39;eau permet d&#39;éviter l&#39;évaporation du tampon. </li><li> Placez le capuchon sur les tubes. Retirer les tubes du bloc de chauffage. L&#39;échantillon peut être conservé à -80 ° C ou utilisé immédiatement pour l&#39;analyse western blot en aval. </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue+kallikrein+5+is+a+member+of+a+proteolytic+cascade+pathway+involved+in+seminal+clot+liquefaction+and+potentially+in+prostate+cancer+progression.">Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).</li></ol>

Benjamin Espina is an employee of Ceres Nanosciences, Inc. that produces reagents used in this Article. Lance Liotta, Alessandra Luchini and Virginia Espina hold patents (US patent 7,935,518 and/or 8,497,137) on the nanoparticle technology used in this Article. As university employees they are entitled to receive royalty from these patents per university policy. Lance Liotta and Alessandra Luchini are shareholders in Ceres Nanosciences and serve on the Scientific Advisory Board.

Pertinence clinique Un échantillon de sérum ou de plasma est censé contenir faible abondance des protéines et des peptides qui peuvent fournir une riche source d&#39;information sur l&#39;état de l&#39;organisme dans son ensemble en circulation. Malgré la promesse de la protéomique sérique, il ya trois barrières physiologiques fondamentales et graves déjouant la découverte de biomarqueurs et de la traduction de bénéfice clinique 10, 11, 16, 25. <p...

Malgré l&#39;achèvement du séquençage du génome humain, des progrès significatifs ont pas été réalisés dans l&#39;identification des biomarqueurs prédictifs de la maladie à un stade précoce, ou qui en corrélation avec le résultat thérapeutique, ou le pronostic 1. Une des raisons de cette absence de progrès est que de nombreux biomarqueurs potentiellement importantes existent à une concentration inférieure à la limite de détection de la spectrométrie de masse conventionnelle et d&#39;autres plates-formes de découverte de biomarqueurs. La spectrométrie de masse (MS) et la sclérose en surveillance de réaction (MRM) ont une sensibilité de détection typiquement supérieure à 50 ng / ml alors que la majorité des analytes mesurés par des dosages immunologiques à une chute en laboratoire clinique dans la plage comprise entre 50 pg / ml et 10 ng / ml . Cela signifie que de nombreux biomarqueurs, en particulier dans les premiers stades d&#39;une maladie ne peuvent pas être détectés par MS conventionnelle et MRM 2. En outre, la présence de protéines de grande abondance telles que l&#39;albumine et les immunoglobulines dans des fluides biologiques complexes masquent souvent par milliard de fois excess faible abondance, des protéines de faible poids moléculaire et les peptides 3, 4. Pour cette raison, plusieurs étapes de préparation d&#39;échantillon sont nécessaires avant le séquençage par spectrométrie de masse et identification. Une telle étape préparatoire emploie l&#39;épuisement des protéines de haute abondance de commerce colonnes d&#39;épuisement 5-8. Malheureusement, cette étape conduit à la réduction du rendement des biomarqueurs candidats car elles sont souvent associées de manière non covalente avec des protéines de transport qui sont éliminés. Une autre difficulté est représenté par la stabilité de biomarqueurs candidats ex-vivo une fois que les échantillons sont prélevés. Les protéines sont soumises à une dégradation par des protéases endogènes ou exogènes 9. Des nanoparticules d&#39;hydrogel peuvent dépasser ces problèmes critiques en amplifiant la concentration des biomarqueurs putatif à un niveau dans l&#39;intervalle de l&#39;essai, tout en protégeant de la dégradation de la protéine de 10 à 13. Il est important de noter èmeprotéines à bas poids moléculaire dans le sang sont un mélange de petites protéines intactes ainsi que des fragments de protéines de grande taille. les protéines dérivées du tissu de plus de 60 kDa sont trop grands pour entrer passivement le flux sanguin à travers la membrane basale vasculaire, mais ils peuvent être représentés dans le sang en tant que peptides ou fragments de protéines 14. Notre objectif est de mesurer de nouveaux biomarqueurs circulants qui peuvent être candidats pour la détection précoce de la maladie, la stratification des patients pour le traitement et le suivi de la réponse au traitement. Les nanoparticules sont créés afin d&#39;exclure de manière sélective des immunoglobulines haut de l&#39;abondance de l&#39;albumine et, en même temps, tout en capturant les petites protéines et les peptides et les concentrer jusqu&#39;à 100 fois en fonction du volume de départ. Notre groupe a identifié un ensemble de petits colorants organiques qui peuvent agir avec succès comme appâts moléculaire élevé d&#39;affinité pour les protéines et les peptides. Liaison protéine-colorant est vraisemblablement due à une combinaison d&#39;interactions hydrophobes et électrostatiquess. Les noyaux aromatiques sur le colorant s&#39;intercalent avec des protéines par l&#39;intermédiaire des poches hydrophobes sur la surface de la protéine 11. Les appâts, en fonction de leur composition chimique, présentent une affinité particulière pour les classes d&#39;analytes sélectionnés. Les appâts sont en concurrence avec les protéines de transport, telles que l&#39;albumine, des protéines ou des peptides. Les protéines / peptides de poids moléculaire bas deviennent piégés dans la particule. Les protéines de haut poids moléculaire telles que l&#39;albumine et les immunoglobulines sont empêchés de pénétrer dans la particule en raison de la capacité de tamisage du fait de la porosité restrictive de l&#39;hydrogel 11 (figure 1). Hydrogel nanoparticules sont synthétisées par polymérisation par précipitation initiée par le persulfate d&#39;ammonium 11. AMsopropylacrylamide (NiPAM), co-monomères d&#39;acide acrylique (AAC) et allylamine (AA) et l&#39;agent de réticulation N, N&#39;-méthylène-(BRI) sont mis à réagir à 70 ° C pendant 6 heures dans des conditions diluées 11, 13. L&#39;affinité de liaison élevée en protéines de poly (N-isopropylacrylamide-co-acide acrylique) (poly (NIPAM-co-AAC) nanoparticlesis obtenue en incorporant de manière covalente des colorants contenant des groupes amino (par exemple., Les colorants sulfonatedanthraquinonetriazine) dans les nanoparticules par l&#39;intermédiaire une réaction d&#39;amidation réalisée dans des solvants aqueux ou organiques, selon les caractéristiques hydrophiles / hydrophobes des colorants 11, 13. substitution nucléophile des groupes amine dans la nanoparticule avec l&#39;atome de chlorure d&#39;un colorant anthraquinonetriazine est utilisé pour créer poly contenant un colorant (NIPAM -CO-allylamine) (AA) des nanoparticules 11, 12. Procédé de polymérisation en deux étapes est utilisée pour créer des nanoparticules d&#39;hydrogel contenant une coque extérieure de l&#39;acide vinylsulfonique (VSA) 11, 13. Des nanoparticules d&#39;hydrogel peuvent être appliqués à divers fluides biologiques, notamment le sang total, le plasma, le sérum, le liquide céphalo-rachidien, de la sueur et l&#39;urine. En une seule étape, en solution, le nanoparticles effectuer un rapide (quelques minutes), la séquestration et la concentration de bas poids moléculaire analytes 10, 11, 13, 15-18. Les protéines sont ensuite éluées à partir de nanoparticules et détectés en utilisant un transfert de Western 19 à 21, la spectrométrie de 10, 11, 13, 15, 18, ​​22 masse, 23, des analyses immunologiques / ELISA 10, 11, 15, 18, ​​ou protéine en phase inverse 16 microréseaux, 24 dosages. Les nanoparticules fonctionnalisées avec des appâts chimique, et présentant un noyau ou noyau architecture de coquille, la capture et concentrer les protéines en fonction des propriétés physico-chimiques de l&#39;appât / enveloppe. Différents colorants incorporés dans les nanoparticules seront donc capturer différents sous-ensembles de protéines avec efficacité sur la base de l&#39;affinité tinctoriale, le pH de la solution, et la présence / absence de protéines hautement abondante 13 concurrentes variable. En outre, la quantité de nanoparticules par rapport au volume de la solution aura une incidence sur le rendement de la protéine à partir des nanoparticules. Ces aspects de l&#39;Nanoparticule hydrogel récolte sont illustrés à l&#39;aide de nanoparticules trois appâts pour des protéines différentes de récolte à partir d&#39;échantillons de plasma qui contiennent des quantités élevées de protéines, et à partir d&#39;échantillons d&#39;urine, qui ne contiennent généralement pas de grandes quantités de protéine. Dans ce protocole, nous démontrons la récolte et la concentration de facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa) à partir des échantillons de plasma en utilisant le poly (NIPAM-co-AAC), le poly (NIPAM / colorant), et des nanoparticules d&#39;enveloppe core-(poly (NIPAM-co-VSA)) . Le poly (NIPAM / colorant) des nanoparticules sont présentés à concentrer l&#39;antigène de Mycobacterium espèce qui a été ajouté à des échantillons d&#39;urine humaine, pour imiter Mycobacterium tuberculosis individus infectés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="957">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">hydrogel nanoparticles</td>
			<td style="width:187px;">Ceres Nanoscience</td>
			<td style="width:119px;">CS003</td>
			<td style="width:336px;">NanoTrap ESP particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl, 50mM pH7.0</td>
			<td style="width:187px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">IC816116</td>
			<td>50mM, pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:187px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">BDH1103-4LP</td>
			<td>available from VWR</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium Hydroxide NH4OH</td>
			<td style="width:187px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">BDH3014</td>
			<td>available from VWR, assayed at 28-30% NH3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium thiocyanate 25mM</td>
			<td style="width:187px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">419675000</td>
			<td>for serum/plasma samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-analyte Urine Reagent Strips</td>
			<td style="width:187px;">Siemens</td>
			<td style="width:119px;">2161</td>
			<td style="width:336px;">for urine samples</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LC2676</td>
			<td style="width:336px;">use at room temperature to prevent SDS from precipitating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dry bath incubator (100 oC) with heating block</td>
			<td style="width:187px;">Barnstead</td>
			<td>11-715-125DQ</td>
			<td>do not substitute a boiling water bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrogen evaporator manifold</td>
			<td style="width:187px;">Organomation Associates</td>
			<td>Microvap118</td>
			<td>for serum/plasma samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge, swing-out rotor</td>
			<td style="width:187px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;">Legend series</td>
			<td>50ml tube capacity, rcf 3700 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge, fixed angle rotor</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td>1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">50ml conical centrifuge&#160;tubes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td>with screw caps for urine samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Disposable plastic transfer pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td>at least 1ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Timer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S04782</td>
			<td>seconds/minutes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrogel nanoparticle harvesting of plasma or urine for detecting low abundance proteins

La découverte de biomarqueurs roman joue un rôle crucial dans la fourniture de la détection de la maladie plus sensible et spécifique. Malheureusement, de nombreux biomarqueurs faible abondance qui existent dans les fluides biologiques ne peuvent pas être facilement détectés par spectrométrie ou immuno-essais, car ils sont présents en très faible concentration, sont labiles, et sont souvent masqués par des protéines de haute abondance comme l&#39;albumine ou immunoglobulines masse. Appât contenant du poly (N-isopropylacrylamide) (NiPAM) des nanoparticules à base sont en mesure de surmonter ces barrières physiologiques. En une seule étape, ils sont capables de capturer, de se concentrer et de préserver les biomarqueurs de fluides corporels. Analytes de faible masse moléculaire pénètrent dans le noyau de la nanoparticule et sont capturés par différents colorants chimiques organiques, qui agissent comme des appâts de haute affinité de la protéine. Les nanoparticules sont capables de concentrer les protéines d&#39;intérêt par plusieurs ordres de grandeur. Ce facteur de concentration est suffisante pour augmenter le niveau de protéine de telle sorte que les protéines sont dans l&#39;la limite de détection de courant de spectromètres de masse, un transfert de Western, et les dosages immunologiques. Les nanoparticules peuvent être incubées avec une grande variété de fluides biologiques et qu&#39;ils sont capables d&#39;enrichir considérablement la concentration de protéines et de peptides de faible poids moléculaire tout en excluant l&#39;albumine et d&#39;autres protéines de haut poids moléculaire. Nos données montrent que 10 000 fois l&#39;amplification de la concentration d&#39;un analyte particulier peut être réalisé, ce qui permet la spectrométrie de masse et des analyses immunologiques pour détecter les marqueurs précédemment indétectables.

Hydrogel nanoparticules Taille et uniformité Particules de poly (NiPAM-AAC) ont été produits à très haut rendement et la reproductibilité entre et au sein des lots. Les particules ont une très bonne stabilité colloïdale à température ambiante pendant le temps nécessaire à la capture, le stockage, et l&#39;élution des protéines (au moins 48 heures), et la précipitation de nanoparticules n&#39;a pas été observée (figure 1) 11. La ...

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Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hydrogel nanoparticules récolte de plasma ou l&#39;urine pour la détection des protéines de faible abondance

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

hydrogel-nanoparticle-harvesting-plasma-or-urine-for-detecting-low

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K vues.  George Mason University. Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

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Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Modélisation Plasma surface de lithographie pour la création des réseaux cellulaires

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Recherche

Bio-ingénierie

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

La culture de cellules progénitrices neurales humaines dans un hydrogel en 3 dimensions Peptide auto-assemblage

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Conception et construction de la matrice extracellulaire artificielle (AECM) Protéines de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Pour l&#39;ingénierie tissulaire de la peau

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations at the point of contact. It can be achieved by complementing traditional rigid grippers with soft robotic pneumatic gripper devices. This manuscript describes a rod-based approach that combined both 3D-printing and a modified soft lithography technique to fabricate the soft pneumatic gripper. In brief, the pneumatic featureless mold with chamber component is 3D-printed and the rods were used to create the pneumatic channels that connect to the chamber. This protocol eliminates the risk of channels occluding during the sealing process and the need for external air source or related control circuit. The soft gripper consists of a chamber filled with air, and one or more gripper arms with a pneumatic channel in each arm connected to the chamber. The pneumatic channel is positioned close to the outer wall to create different stiffness in the gripper arm. Upon compression of the chamber which generates pressure on the pneumatic channel, the gripper arm will bend inward to form a close grip posture because the outer wall area is more compliant. The soft gripper can be inserted into a 3D-printed handling tool with two different control modes for chamber compression: manual gripper mode with a movable piston, and robotic gripper mode with a linear actuator. The double-arm gripper with two actuatable arms was able to pick up objects of sizes up to 2 mm and yet generate lower compressive forces as compared to elastomer-coated and non-coated rigid grippers. The feasibility of having other designs, such as single-arm or hook gripper, was also demonstrated, which further highlighted the customizability of the soft gripper device, and it's potential to be used in delicate surgical manipulation to reduce the risk of tissue grip damage.

This protocol describes a rod-based approach, combining 3D-printing and soft lithography techniques for fabricating the soft gripper devices. This approach eliminates the need for an external air source by incorporating a chamber component and reduces the chance of occlusion during the sealing process, particularly for miniaturized pneumatic channels.

Fabrication à base de Rod personnalisables souples Robotic pneumatiques Dispositifs Gripper pour la manipulation des tissus Délicat

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Targeted Plasma Membrane Livraison d&#39;un Hydrophobe Cargo encapsulé dans un cristal liquide Nanoparticules Transporteur

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Structuration des protéines bioactives ou Peptides sur Hydrogel utilisant photochimie pour Applications biologiques

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

Appareil pour la récolte de tissus Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabrication d’un Hydrogel de dérivés de matrice extracellulaire rein Cortex

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to develop practical technologies that couple microscopic cell screening with cell isolation at high purity for downstream genetic analysis. Here, the use of photodegradable poly(ethylene glycol) hydrogels for screening and isolation of bacteria with unique growth phenotypes from heterogeneous cell populations is described. The method relies on encapsulating or entrapping cells with the hydrogel, followed by culture, microscopic screening, then use of a high-resolution light patterning tool for spatiotemporal control of hydrogel degradation and release of selected cells into a solution for retrieval. Applying different light patterns allows for control over the morphology of the extracted cell, and patterns such as rings or crosses can be used to retrieve cells with minimal direct UV light exposure to mitigate DNA damage to the isolates. Moreover, the light patterning tool delivers an adjustable light dose to achieve various degradation and cell release rates. It allows for degradation at high resolution, enabling cell retrieval with micron-scale spatial precision. Here, the use of this material to screen and retrieve bacteria from both bulk hydrogels and microfabricated lab-on-a-chip devices is demonstrated. The method is inexpensive, simple, and can be used for common and emerging applications in microbiology, including isolation of bacterial strains with rare growth profiles from mutant libraries and isolation of bacterial consortia with emergent phenotypes for genomic characterizations.

The use of photodegradable hydrogels to isolate bacterial cells by utilizing a high-resolution light pattering tool is reported. Essential experimental procedures, results, and advantages of the process are reviewed. The method enables rapid and inexpensive isolation of targeted bacteria showing rare or unique functions from heterogeneous communities or populations.

Interfaces d’hydrogel photodégradables pour le dépistage, la sélection et l’isolement des bactéries

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB) - which is mainly used for tissue regeneration and has been validated in animal models of corneal injury and inflammatory bowel disease. This is a novel hydrogel formed by modifying biological gelatin with o-nitrosobenzaldehyde (NB). Gelatin-NB was synthesized by activating the carboxyl group of NB-COOH and reacting with gelatin through 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The obtained compound was purified to generate the final product, which can be stably stored for at least 18 months. NB has a strong adhesion to -NH2 on the tissue, which can form many C = N bonds, thus increasing the adhesion of gelatin-NB to the tissue interface. The preparation process comprises steps for the synthesis of the NB-COOH group, modification of the group, synthesis of gelatin-NB, and purification of the compound. The goal is to describe the specific synthesis process of gelatin-NB in detail and to demonstrate the application of gelatin-NB to damage repair. Moreover, the protocol is presented to further strengthen and expand the nature of the material produced by the scientific community for more applicable scenarios.

The protocol presented here shows the synthesis of a strong adhesive hydrogel gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB). Gelatin-NB has rapid and efficient tissue adhesion ability, which can form a strong physical barrier to protect wound surfaces, so it is expected to be applied to the field of injury repair biotechnology.

Synthèse d’hydrogel adhésif fort, de gélatine O-nitrosobenzaldéhyde

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...