Ce protocole vous donne un aperçu étape par étape sur la façon de préparer les billes pour le nettoyage d’affinité et la protéolyse protéique et comment les utiliser dans la détermination des protéines de faible abondance à partir de microéchantillons séchés. Le principal avantage est que vous disposez des outils nécessaires pour préparer et effectuer un échantillonnage très efficace d’échantillons complexes à partir de très petits volumes. Cette méthode peut être adaptée à d’autres biomarqueurs protéiques tant que vous avez accès à des anticorps efficaces pour capturer la protéine ou le peptide protéotypique.
Vous devez être très prudent lorsque vous ajustez le pH pour le traitement acide de l’anticorps, surtout si vous préparez un petit volume de billes. Pour commencer, transférez le volume souhaité de solution d’anticorps dans un tube microcentrifuge à faible liaison aux protéines de cinq millilitres et ajoutez une petite barre d’agitation magnétique à la solution d’anticorps. Utilisez un pH-mètre avec une microélectrode pour mesurer le pH et ajustez le pH en ajoutant d’abord 10 microlitres d’acide chlorhydrique monomolaire, puis en réduisant le volume lorsque le pH approche 2,5.
Enregistrer le volume total d’acide chlorhydrique monomolaire nécessaire pour ajuster le pH à 2,5. Retirez la microélectrode et incuber l’anticorps acidifié sur de la glace sur un agitateur magnétique pendant une heure. Pour neutraliser la solution d’anticorps, mesurez le pH et ajustez-le à sept en ajoutant d’abord 10 microlitres d’hydroxyde de sodium à une molaire, puis en réduisant le volume d’hydroxyde de sodium lorsque le pH approche sept heures.
Noter le volume total d’hydroxyde de sodium monomolaire ajouté. Bien mélanger la suspension de billes magnétiques sur un mélangeur vortex et prélever un volume contenant la quantité désirée de suspension de billes. Par exemple, pour préparer un millilitre de suspension de billes, prélevez un volume contenant 20 milligrammes de perles.
Placez la suspension du cordon sur un support magnétique pendant une minute et retirez le surnageant. Lavez les billes deux fois avec un volume égal d’eau de type I et mélangez à l’aide d’un mélangeur vortex après chaque ajout de la solution de lavage. Ensuite, placez à nouveau la solution sur un support magnétique pendant une minute et retirez le surnageant comme indiqué précédemment.
Ajouter un anticorps traité à l’acide, un tampon de borate 0,5 molaire et un tampon de couplage pour le couplage des anticorps aux billes magnétiques. Mélanger à l’aide d’un mélangeur vortex et faire pivoter à température ambiante pendant la nuit à l’aide d’un mélangeur d’échantillons de bout en bout, de préférence avec rotation et vibration réciproques. Ensuite, centrifuger pendant 10 minutes à 239 g.
Placez le tube sur l’aimant pendant deux minutes et retirez le surnageant. Après avoir lavé les perles, placez à nouveau le tube sur l’aimant pendant une minute et suivez la même procédure pour retirer le surnageant. Conservez-le dans le tampon souhaité en utilisant la concentration de billes souhaitée dans un réfrigérateur.
Laisser recueillir 10 microlitres de sérum dans une pointe de microéchantillonnage volumétrique absorbant de 10 microlitres, ou VAMS, en suivant les directives du fabricant, et sécher à l’air libre à température ambiante pendant au moins deux heures. Retirez le VAMS du support et placez-le dans un tube microcentrifuge de deux millilitres à faible liaison aux protéines. Ajouter 1 000 microlitres de solution de bicarbonate d’ammonium 100 millimolaires et extraire VAMS pendant une heure à 22 degrés Celsius à l’aide d’un mélangeur à température contrôlée à 1 000 tr / min.
Transférer l’extrait dans un nouveau tube microcentrifuge à faible liaison aux protéines de 1,5 millilitre pour la protéolyse tryptique. Ajouter 30 microlitres de billes de trypsine lavées à chaque extrait VAMS pour initier la digestion, et incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 1 000 tr / min à l’aide d’un mélangeur à température contrôlée ou similaire. Centrifuger à 2 655 g pendant cinq minutes et transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de deux millilitres à faible liaison aux protéines.
Ajouter 25 microlitres de 14 nanogrammes par millilitre d’étalon interne, ou IS, solution contenant le peptide marqué par un isotope stable dans une solution de bicarbonate d’ammonium de 100 millimolaires. Ajouter deux 20 microlitres de suspension de billes magnétiques lavées à chaque tube microcentrifuge à faible liaison aux protéines contenant un extrait VAMS digéré et IS. Effectuer l’immunoextraction pendant une heure à l’aide d’un mélangeur d’échantillons de bout en bout à température ambiante. Lavez les billes magnétiques en ajoutant 500 microlitres de PBS avec 0,05% de polysorbate 20.
Retirer du support magnétique le tube microcentrifuge à faible liaison aux protéines contenant des billes et la solution de lavage, puis retourner délicatement jusqu’à homogénéité. Ensuite, placez le tube microcentrifuge à faible liaison aux protéines sur l’aimant pendant 30 secondes, inversez-le pendant 30 secondes et placez-le à nouveau sur l’aimant pendant une minute. Retirez la solution de lavage et lavez à nouveau les billes magnétiques avec du PBS, de l’acide chlorhydrique tris et du bicarbonate d’ammonium.
Ajouter 15 microlitres d’acide formique à 2% dans de l’eau de type I à chaque échantillon et incuber pendant cinq minutes à 22 degrés Celsius et 1 000 tr / min à l’aide d’un mélangeur à température contrôlée ou similaire pour éluer les peptides capturés. Après avoir placé l’éluat sur l’aimant pendant une minute, transférez-le dans un nouveau tube microcentrifuge à faible liaison aux protéines de 1,5 millilitre. Répéter une fois et transférer le deuxième éluat dans le même tube microcentrifuge à faible liaison aux protéines que le premier éluat.
Ajouter 20 microlitres de bicarbonate d’ammonium 100 millimolaires à chaque éluat. Centrifugez-le et transférez 40 microlitres de l’éluat dans des microinserts pour flacons de CLHP. Dans le logiciel de l’instrument, réglez la température du four à colonne à 25 degrés Celsius et le débit à 50 microlitres par minute.
Ensuite, placez les échantillons dans l’échantillonneur automatique. Préparez une séquence contenant les échantillons à exécuter à l’aide du logiciel disponible pour le système LC-MS/MS et réglez le volume d’injection sur 10 microlitres. Appuyez sur Run Sequence dans le logiciel de l’instrument pour démarrer la séquence et enregistrer la zone du pic du peptide tryptique ProGRP capturé par affinité, spécifique au ProGRP, et de son IS. Les chromatogrammes de spectrométrie de masse, ou MS, du peptide protéotypique et de l’IS après échantillonnage VAMS et de taches de sérum séché, ou DSS, ainsi que pour un échantillon de sérum enrichi ajouté directement dans la solution d’extraction sont présentés ici.
Les résultats représentatifs du rapport de surface maximale du peptide ProGRP protéotypique à IS pour les échantillons de sérum enrichis de ProGRP et appliqués à VAMS, DSS ou directement à la solution d’extraction sont présentés dans cette figure. À partir de ces résultats, on peut voir que VAMS fournit des rapports de surface similaires à ceux de l’échantillon témoin, indiquant qu’il n’y a aucune perte pour le matériel d’échantillonnage, tandis que le DSS fournit un rapport de surface significativement inférieur, indiquant une perte pour le matériel d’échantillonnage. Une comparaison des chromatogrammes de pic de base après extraction de protéines intactes et extraction de peptides épitopiques protéotypiques est présentée dans cette figure.
Lorsque vous préparez vous-même des perles enrobées d’anticorps ou d’enzymes, vous pouvez adapter les perles à vos besoins spécifiques. Ceci est pertinent pour la détermination ciblée des protéines et l’analyse protéomique globale. Les méthodes sensibles de détermination des protéines à partir de la SMAV et des gouttes de sang séché rendent possibles des approches axées sur le patient, telles que les tests extrahospitaliers, dans le suivi d’un plus large éventail de maladies.
