Cette étude a été soutenue par le NIH R37 DK54824 et R01 DK57284 subventions à LB

Toutes les procédures décrites ici sont approuvés par le comité IACUC à l&#39;Université de Pittsburgh. 1. Solutions <ol><li> Préparer une solution de Krebs selon la recette. Composition en mM: NaCl 118, KCl 4,7, CaCl2 1,9, MgSO4 1,2, NaHCO 3 24.9, KH 2 PO 4 1,2, dextrose 11,7. </li><li> Aérer Krebs avec 95% de O 2, 5% de CO 2 et le placer dans un bain à 37 ° C de l&#39;eau pour être utilisé tout au long de l&#39;expérience. Placer côté ~ 200 ml de solution de Krebs aérée à la température ambiante pour être utilisés pour la dissection de tissus. </li><li> Mesurer le pH (~ 7.4) et l&#39;osmolarité (~ 300 mOsm) aérée de Krebs. </li></ol> 2. expérimental (Schéma Figure 1A) <ol><li> Remplir aérée (95% O 2, 5% CO 2) chambres avec 10 ml de Krebs. </li><li> Démarrer la pompe à circulation d&#39;eau pour chauffer les chambres à 37 ° C; allumer l&#39;équipement nécessaire: amplificateur (s), stimulateur (s) et le logiciel d&#39;enregistrement. </li><li> Calibrer les capteurs avec un poids de 1 g. </li></ol> 3. tissus (Figure 1B) Retirer la vessie d&#39;une femme adulte naïf Sprague Dawley (200-250 g; ~ 10-12 semaines) en suivant ces étapes: <ol><li> Préparer la zone de dissection et instruments nécessaires: les rasoirs électriques, des pinces à dents, lame de scalpel, ciseaux de dissection, microciseaux, deux pinces à disséquer (auteurs préfèrent Dumont forceps 3 #), les clips de tissus (ou suture de soie), un plat de dissection enduit Sylgard avec Krebs et repères de la dissection du tissu. </li><li> Anesthésier l&#39;animal avec l&#39;inhalation d&#39;isoflurane (4% de O 2) dans la chambre d&#39;induction. Utilisez pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse alors que sous anesthésie. Surveiller en permanence le niveau de l&#39;anesthésie en observant le taux de respiration, réponse à des stimuli externes, et perte d&#39;un membre arrière retirer réflexe. </li><li> Lorsque l&#39;animal est anesthésié rasage du bas de l&#39;abdomen unerea. Exposer les organes pelviens par une incision abdominale médiane. Identifier la vessie et de l&#39;urètre. Retirer la vessie en coupant au niveau du col de la vessie près de l&#39;urètre proximal. Placez le tissu immédiatement dans le plat recouvert Sylgard rempli de solution aérée Krebs. </li><li> Si nécessaire, enlever le tissu supplémentaire à cette époque: l&#39;urètre, des morceaux de gastro-intestinal (GI) et / ou de la prostate, etc </li><li> Sacrifier l&#39;animal en utilisant des méthodes IACUC approuvés (par exemple surdose d&#39;anesthésique ou CO 2 asphyxie suivie par une méthode secondaire). </li><li> Insérer les broches de tissus disséquer à travers les dômes vessie, le cou et les uretères, pour stabiliser le tissu pour plus de dissection. Ne pas étirer le tissu. Enlever la graisse, le tissu conjonctif, de l&#39;urètre proximal, et les uretères s&#39;il est présent. </li><li> Ouvrez la vessie de la base au dôme de créer une feuille plate, côté séreuse descente côté / luminale (Figure 1B). Placer les repères de dissection à chaque coin du tissu. Retirer la vessie dome et le tissu du col. </li><li> Si le but de l&#39;expérience est de déterminer la contribution de la muqueuse (urothélium et de la lamina propria - voir schéma figure 1C) de la contraction du muscle lisse, comparer les propriétés des bandes du détrusor avec et sans la muqueuse attachée. Pour cela, avant de couper le tissu en bandes, retirez soigneusement la couche muqueuse en utilisant l&#39;iris printemps ciseaux et des pinces fines sous un microscope à dissection. A la fin de l&#39;expérience, fixer les bandes de coloration H &amp; E pour confirmer la suppression complète de la muqueuse. A noter que cette procédure est plus facile dans la vessie de la souris dans la vessie de rat. </li><li> Couper le tissu de la longueur de la base au dôme en bandes de ~ 2 x 8 mm (figure 1B). Attachez ou fixez un clip de tissus aux deux extrémités de chaque bande. REMARQUE: Une vessie de rat peut généralement être découpé en 4 bandes, mais le nombre de bandes peut augmenter ou diminuer en fonction de la taille des animaux / vessie. </li><li> Transférer les bandes à la experchambres imental. Attacher une extrémité de chaque bande à un transducteur de force, qui mesure la contraction des tissus, et l&#39;autre à une tige fixe verre / métal. REMARQUE: chambres de tissus varient en taille (0,2 ml à 20 ml ou plus). Chambres typiques de vessies de rongeurs sont 5-20 ml, qui offrent une hauteur suffisante pour les bandes d&#39;être complètement immergés dans une solution. Certaines chambres sont équipées de haut-électrodes de stimulation, d&#39;autres non. Il faut prendre soin de s&#39;assurer que toutes les connexions des électrodes sont en bon état, sinon, une stimulation de champ électrique n&#39;est pas fiable. </li><li> Appliquer une quantité définie de la force pour chaque bande par étirement en douceur le tissu jusqu&#39;à ce que la tension de référence atteint 1 g (~ 10 mN). Initialement, le tissu a tendance à se détendre qui est enregistré comme une diminution de la tension de référence. Laver le tissu environ toutes les 15 minutes en utilisant la chaleur aérée Krebs et ajuster la tension de référence à 1 g après chaque lavage. Laisser le tissu à s&#39;équilibrer pendant ~ 1-2 heures ou jusqu&#39;à ce que la tension de référence est stable (c&#39;est à dire pas plus de relâchement des tissus). </li><li> Test de viabilité du tissu par l&#39;addition de KCl (80 mM) directement au bain de ~ 5 min, ou jusqu&#39;à ce qu&#39;une réponse de plateau est atteinte. Les réponses à de fortes concentrations de KCl peuvent aussi être répétées au cours de l&#39;expérience ou à la fin de l&#39;expérience et utilisés pour normaliser les réponses à d&#39;autres médicaments ou entre les bandes (voir normalisation vertu de l&#39;article d&#39;analyse de données). </li><li> Plusieurs fois de tissu de lavage (3-5x) avec la chaleur de Krebs aérée pour permettre au tissu de revenir à des conditions de pré-traitement. </li></ol> 4 Protocoles de stimulation <ol><li> Pour étudier les effets de la pathologie sur l&#39;activité myogène spontanée ou tonus des muscles lisses, utiliser des bandes de muscles lisses de différents modèles animaux, comme le PCA, BOO, ou le nouveau-né. Figure 2 illustre l&#39;utilisation de cette méthode pour étudier les changements dans la vessie activité spontanée au cours du développement et après la SCI. En outre, des agents pharmacologiques peuvent être utilisés pour moduler spactivité ontaneous. Figure 3 illustre l&#39;effet des modulateurs des canaux KCNQ, flupirtine et XE991, sur l&#39;activité spontanée et tonus des muscles lisses. </li><li> Pour les courbes lisses pharmacologiques stimulation musculaire construct de réponse à la concentration par addition de composés à partir de solutions mères concentrées directement dans le bain à des intervalles de temps définis. Utilisez la drogue et le véhicule en bandes parallèles à tenir compte des effets de véhicules et de temps. <ol><li> Faire des solutions mères de composés de test souhaités à 1000x la concentration de travail finale. Pour carbachol (CCh), un agoniste des récepteurs muscariniques, de préparer des stocks suivants: 10 -5 M, 3 x 10 -5 M, 10 -4 M, 3 x 10 -4 M, 10 -3 M, 3 x 10 -3 M , 10 -2 M. Les concentrations finales dans le bain est de 10 -8 M à 10 -5 M (figures 4C et D). Pour neuromédine B (NMB), un sous-type de récepteurs de la bombésine une agoniste, préparer des stocks suivants: 10 -8 M, 10 -7M, 10 -6 M, 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M et des concentrations finales dans la salle de bain sont 10 -11 M à 10 -6 M. Les deux CCh et NMB devraient augmenter la contractilité des tissus. </li><li> Pour un bain de tissu de 10 ml, ajouter 10 ul de chaque solution mère CCh dès que la réponse atteint un plateau (figure 4C, D). En bandes parallèles ajouter des quantités égales de véhicule (eau). De même, ajouter 10 ul de chaque solution neuromédine B du stock chaque ~ 5 min. REMARQUE: Observez l&#39;effet excitateur du NMB et CCh sur le tonus musculaire lisse en bandes de différentes espèces dans la figure 4. </li><li> Étudier les propriétés de relaxation des muscles lisses dans les tissus pré-traitées avec un agent excitateur, généralement CCh ou KCl. </li><li> Pour bloquer une réponse agoniste, prétraiter les tissus pour 10-20 min avec l&#39;antagoniste pour permettre la pénétration de tissu, avant agoniste stimulation. </li></ol></li><li> Pour stim neuronesulation du muscle lisse, aussi appelée stimulation de champ électrique (EFS) suivre les étapes 1 à 3.13 et continuer comme décrit ci-dessous. EFS est destiné à activer sélectivement les nerfs contre le muscle lisse. Paramètres de stimulation doivent être choisis avec soin pour éviter la stimulation des muscles lisses direct. <ol><li> Établir des paramètres de stimulation: type de stimulus (des impulsions uniques ou des trains), la durée (durée de l&#39;impulsion et de la durée de train), la fréquence et l&#39;intensité, comme décrit dans les étapes ci-dessous et illustré sur les figures 5A, B. <ol><li> Pour la stimulation unique d&#39;impulsion, définissez la durée d&#39;impulsion, intervalle inter-stimulus et le nombre de stimuli souhaités. Paramètres de durée de stimulation habituels sont des impulsions uniques de 0,05-0,3 msec livré à des intervalles souhaités (figure 5A). Suivez l&#39;étape 4.3.1.4 pour l&#39;intensité du stimulus. </li><li> Pour la stimulation de train, régler la durée de train et l&#39;intervalle de train inter. Des valeurs typiques pour les tissus de la vessie sont livrés 10.03 sec au moins 1 mdans l&#39;autre (Figure 5B). Si la fatigue des tissus se produit (c.-à-EFS contractions diminuent pendant la période de contrôle), augmenter l&#39;intervalle de train inter. </li><li> Établir la fréquence des stimuli de train (nombre d&#39;impulsions dans un train - La figure 5B). Exécution d&#39;une courbe de réponse en fréquence allant de 0,5 à 50 Hz. Fréquences typiques de la vessie sont 10-20 Hz, ce qui donne des contractions reproductibles et stables médiation par l&#39;ATP et l&#39;acétylcholine. Respecter les réponses dépendant de la fréquence à EFS stimulation en bandes de la vessie de la souris dans la figure 5 montrant comment cette méthode peut être utilisée pour évaluer la contribution des cholinergique et mécanismes purinergiques à la neurotransmission. </li><li> Établir l&#39;intensité de la stimulation: systématiquement augmenter l&#39;intensité (tension) du stimulus jusqu&#39;à ce que l&#39;amplitude de la contraction atteint un plateau (si l&#39;on utilise des trains de maintenir constante la fréquence). </li><li> Régler l&#39;intensité de la stimulation en fonction de l&#39;but de l&#39;expérience. Si l&#39;objectif est d&#39;augmenter les contractions neuronale évoquée, puis utilisez intensité sous-maximale telle que l&#39;amplitude de la contraction est d&#39;environ 50% de la contraction maximale. Si l&#39;objectif est de diminuer les contractions neuronale évoquée, puis réglez l&#39;intensité de ~ 80% de l&#39;amplitude maximale pour éviter la fatigue des tissus. </li></ol></li><li> Une fois les paramètres de stimulation (durée, fréquence et intensité) sont établies, permettra ~ 20-30 min pour EFS- évoqué contractions se stabiliser avant de dépistage des drogues. REMARQUE: Pour vérifier la sélectivité de l&#39;EFS pour la transmission neuronale, transmission nerveuse bloc avec le bloqueur des canaux Na +, la tétrodotoxine (TTX; 0,5-1 M). Effectuer cette étape au début de l&#39;expérience, comme TTX s&#39;enlève relativement facilement. De plus, réaliser cela à la fin de l&#39;expérience (voir l&#39;étape 4.3.5. Ci-dessous). </li><li> Préparer des solutions de 1,000x à des concentrations finales de travail pour: alpha, bêta-méthylène ATP (ABMA, un activateur de récepteurs purinergiqueset désensibilisant) 10 -2 M, l&#39;atropine (un antagoniste des récepteurs muscariniques) 10 -3 M (Figure 5C). Observer les autres exemples dans la figure 6. L&#39;agoniste des récepteurs de 5HT4, le cisapride (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 -5 M, 10 -5 M, 3 x 10 -4 M, 10 -4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), augmente la contractilité du tissu et le SB-203186 (3 x 10 -3 M), un antagoniste du récepteur 5HT4, inverse les effets de cisapride. </li><li> Pour tester les effets de l&#39;atropine et ABMA sur EFS (figure 5C), effectuer deux courbes de réponse en fréquence de contrôle. Ajouter 10 ul de 10 -2 M dans le bain ABMA pour une concentration finale de 10 uM. Ce tissu se contracte en raison de la stimulation directe des récepteurs purinergiques dans les muscles lisses. Après le retour de réponse à la ligne de base, répéter courbes de réponse en fréquence. Ajouter 10 ul de 10 -3 M atropine pour un concentrat finaleion de 1 uM. Après ~ 10 min (nécessaire pour l&#39;atropine pour bloquer les récepteurs muscariniques), les courbes de réponse en fréquence de répétition. Dans bandes parallèles ajouter 10 ul du véhicule, de l&#39;eau, à chaque étape. REMARQUE: Pour d&#39;autres exemples de la figure 6, ajouter 10 ul de chaque solution cisapride des stocks à des intervalles définis de temps (~ toutes les 15 min; voir la discussion), suivis par 10 pi de SB-203186 solution stock directement dans le bain et de surveiller leur effet sur contraction EFS-induite. Dans bandes parallèles ajouter 10 ul du véhicule, le DMSO. Observer les effets du cisapride, un agoniste des récepteurs 5HT4, sur les contractions EFS évoquées dans les tissus de la vessie et l&#39;iléon des droits de la figure 6. Outre, observer l&#39;effet de DMSO, le véhicule pour le cisapride, sur EFS évoqués contractions de la vessie et des tissus humains de l&#39;iléon . </li><li> A la fin du protocole EFS vérifier la sélectivité de EFS en bloquant la transmission nerveuse de l&#39;agent de blocage des canaux Na +, la tétrodotoxine (TTX; 0,5-1 et# 181; M). Si les contractions résistants TTX sont toujours présents, il est recommandé d&#39;ajuster la durée et de l&#39;intensité du stimulus dans les expériences suivantes. </li></ol></li><li> Pour déterminer les effets des médicaments sur des sites pré ou post-synaptiques (figure 7A) suivez les étapes 1 à 4.3.2. Établir des réponses reproductibles au carbachol et EFS, puis ajouter médicament X. </li><li> A la fin de l&#39;expérience, déclipser ou défaire les bandes, éponger délicatement sur un morceau de papier de soie pour éliminer davantage de liquides et de mesurer le poids de chaque bande en utilisant une balance. Mesurer également la longueur de tissu en utilisant un pied à coulisse à déterminer surface de section transversale. Cette information est utilisée pour la normalisation des données (voir section 5.4). </li></ol> Analyse 5. données Analyser les données en utilisant un logiciel adéquat (par exemple, Windaq, LabChart). <ol><li> Pour l&#39;activité spontanée, sélectionner une fenêtre d&#39;au moins 30 secondes avant et à l&#39;apogée de la réponse induite par les médicaments et moiasure amplitude et la fréquence de l&#39;activité myogène (figure 3). <ol><li> Utilisez rapide analyse de la transformation de Fourier pour déterminer le spectre de fréquences qui contribuent à la contraction des réponses et s&#39;il existe des différences entre les différentes parties de la vessie (par exemple, le dôme vs cou) ou avec le développement, la pathologie et la drogue 8. </li></ol></li><li> Pour les effets sur le tonus musculaire lisse sélectionner une fenêtre d&#39;au moins 10-30 secondes avant et à l&#39;apogée de la réponse induite par les médicaments et de mesurer l&#39;amplitude de la contraction. </li><li> Pour les effets sur les contractions syncope évoqués mesurer l&#39;amplitude, la durée et l&#39;aire sous la courbe des contractions (au moins 3) avant et pendant le pic de la réponse induite par le médicament. NOTE: Il est nécessaire de mesurer à la fois l&#39;amplitude et l&#39;aire sous la courbe des contractions EFS-induites parce que les composants purinergiques et cholinergiques ont une cinétique différente. La composante purinergiques est rapide et transitoire (ATP active purinergic canaux ionotropiques tels que P2X1 afflux rapide qui permettent de calcium, puis ils désensibiliser), ce qui contribue davantage à la réponse d&#39;amplitude de crête inférieure et de la surface sous la courbe. La composante cholinergique est plus lente et soutenue (ACh active les récepteurs muscariniques métabotropiques, qui nécessitent plus de temps pour activer les voies intracellulaires qui activent finalement canaux ioniques qui dépolariser le muscle lisse pour induire une contraction). Ainsi, le composant muscarinique est capturée par une meilleure mesure de l&#39;aire sous la courbe. </li><li> Normaliser les données pour être en mesure de comparer les résultats entre les bandes et les traitements pharmacologiques. Le paramètre choisi pour la normalisation ne doit pas être influencé par les composés d&#39;essai, l&#39;état pathologique ou de la conception expérimentale étudiée. Parmi ces paramètres, le poids utilisation de la bande, surface de section transversale, les réponses au KCl (Figure 4B),% de la réponse maximale (Figure 7B) ou% de la réponse maximale à un autre agent contractile(Par exemple, CCH) ou des agents de détente (par exemple, la papavérine). </li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Dans cet article, nous avons décrit une in vitro simple lisse méthode de la contractilité du muscle qui peut être utilisé pour répondre à un certain nombre de questions scientifiques importantes liées à la vessie physiologie et la pathologie, ainsi que la complicité de la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les dysfonctionnements de la vessie. Nous avons illustré l&#39;utilisation de cette méthode pour évaluer les propriétés de développement, pathologiques et pharmacologiques de co...

La lisse de la vessie muscle se détend pour permettre le stockage de l&#39;urine, et les contrats de susciter l&#39;urine élimination. Relaxation est médiée par des propriétés musculaires lisses intrinsèques et par la libération tonique de la noradrénaline (NA) des nerfs sympathiques, qui active les récepteurs bêta-adrénergiques (β de 3 AR chez l&#39;homme) dans le détrusor. Annulation est réalisé par l&#39;inhibition de l&#39;entrée sympathique et l&#39;activation des nerfs parasympathiques qui libèrent l&#39;acétylcholine / ATP de contracter le muscle lisse de la vessie 1. De nombreux états pathologiques, y compris le cerveau et / ou une blessure de la moelle épinière, les maladies neurodégénératives, le diabète, l&#39;obstruction de la sortie de la vessie, ou de la cystite interstitielle peuvent modifier profondément la fonction de la vessie, avec de graves répercussions sur la qualité de vie du patient 2. Ces conditions altèrent la contractilité du muscle lisse en affectant un ou plusieurs composants de la vessie: le muscle lisse, les nerfs afférents ou efférents et / ou lemuqueuse. Plusieurs in vivo et des méthodes in vitro pour étudier la fonction de la vessie ont été développés. In vivo, cystometry est la principale mesure de la fonction de la vessie. Bien que ce soit une préparation intacte qui permet la collecte d&#39;informations dans des conditions proches physiologiques, il ya un certain nombre de circonstances dans lesquelles l&#39;utilisation de bandes de muscle lisse est préférable. Il s&#39;agit notamment des situations où chirurgical et / ou des manipulations pharmacologiques pourraient affecter la survie et la stabilité de la préparation in vivo, ou lorsque les études nécessitent l&#39;utilisation de tissu humain ou des produits chimiques coûteux. Cette méthode facilite également l&#39;examen des effets de la drogue, de l&#39;âge et de la pathologie de chaque composante de la vessie, c&#39;est à dire le muscle lisse, les muqueuses, les nerfs afférents et efférents. bandes de la vessie ont été utilisés au cours des années par de nombreux groupes de répondre à un certain nombre de questions scientifiques. Ils ont été utilisés pour evachangements de luer l&#39;activité spontanée myogénique induits par la pathologie. Cette activité est censé contribuer à l&#39;urgence et la fréquence des symptômes de la vessie hyperactive (OAB), et est donc une cible pour les médicaments en cours de développement pour la vessie hyperactive 3-9. bandes de la vessie ont également été utilisés pour étudier les facteurs myogéniques et neuronaux qui modulent le tonus musculaire lisse dans le but de découvrir les canaux ioniques et / ou des récepteurs et / ou des voies intracellulaires qui pourraient être ciblées pour induire soit la relaxation ou la contraction du muscle lisse 3,10- 13. D&#39;autres études se sont concentrées sur la nature de la neurotransmission, notamment des émetteurs et des récepteurs impliqués et les changements induits par la pathologie 14,15. En outre, la méthode a été utilisée pour les comparaisons entre les tissus de différentes espèces de 16 18, entre les organes 19-21, et l&#39;évaluation des médicaments relations structure-activité 22-24. Une extension de cette méthode a été utilisée pour MEASURe l&#39;effet des médicaments sur la libération du transmetteur de nerfs efférents 25. En outre, une variété de tissus (vessie, l&#39;urètre, le tube digestif, GI) récoltées à partir d&#39;animaux ou d&#39;humains (de chirurgies ou de tissus de donneurs d&#39;organes approuvés pour la recherche) et d&#39;une variété de modèles animaux, y compris des blessures de la moelle épinière (SCI), l&#39;obstruction de sortie de vessie (BOO), ou la cystite interstitielle (IC) peuvent être étudiés en utilisant cette technique. Dans cet article, nous illustrons l&#39;utilisation de cette méthode ainsi que des protocoles expérimentaux nécessaires, à répondre à plusieurs questions scientifiques mentionnées ci-dessus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:123px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:180px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Equipment</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Tissue Bath System with Reservoir</td>
			<td>Radnoti, LLC</td>
			<td style="width:119px;">159920</td>
			<td style="width:180px;">isolated tissue baths</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Warm water recirculator pump</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TPZ-749</td>
			<td style="width:180px;">to keep tissue baths to 37 C</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Computer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Data Acquisiton System</td>
			<td style="width:123px;">DataQ Instruments</td>
			<td style="width:119px;">DI-710-UH</td>
			<td style="width:180px;">To view, record and analyze data</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Transbridge Transducer Amplifier</td>
			<td style="width:123px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SYS-TBM4M</td>
			<td style="width:180px;">Transducer amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Grass stimulator</td>
			<td style="width:123px;">Grass Technologies</td>
			<td>Model S88</td>
			<td style="width:180px;">Stimulator</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Anesthesia System</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td>ACV-1205S</td>
			<td style="width:180px;">To anesthetesize the animal</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:237px;"><a name="RANGE!A10">Anesthetizing Box</a></td>
			<td style="width:123px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">500116</td>
			<td style="width:180px;">To anesthetesize the animal</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Anesthesia Masks</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">AC-09508</td>
			<td style="width:180px;">To anesthetesize the animal</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Materials and surgical instruments</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">sylgard</td>
			<td>Dow Corning Corp</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT</td>
			<td style="width:180px;">To pin, dissect &#38; cut tissue</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3160-152</td>
			<td style="width:180px;">To dissect/cut tissue</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:237px;">Insect Pins</td>
			<td style="width:123px;">ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins</td>
			<td style="width:119px;">Size 5</td>
			<td style="width:180px;">To pin tissue</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Bench Pad</td>
			<td style="width:123px;">VWR International</td>
			<td style="width:119px;">56617-014</td>
			<td style="width:180px;">Absorbent bench underpads</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Rat surgical Kit</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INSRATKIT</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">2 Dumont #3 Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INS500064</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Tissue Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INS500092</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Scalpel</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INS500236</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Scalpel blade</td>
			<td style="width:123px;">Kent Scientific Corporation&#160;</td>
			<td style="width:119px;">INS500239</td>
			<td style="width:180px;">To remove and dissect tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Professional Clipper&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">CLP-223&#160;45</td>
			<td style="width:180px;">To remove fur</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Suture Thread</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">18020-50</td>
			<td style="width:180px;">Tie tissue</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Tissue Clips</td>
			<td>Radnoti, LLC</td>
			<td style="width:119px;">158802</td>
			<td style="width:180px;">Attach tissue to rod/transducer</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">1g weight</td>
			<td style="width:123px;">&#160;Mettler Toledo</td>
			<td>11119525</td>
			<td style="width:180px;">For transducer calibration</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Chemicals</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="170">
			<td height="170" style="height:170px;width:237px;">Krebs Solution:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Sodium Chloride 
			Potassium Chloride 
			Monobasic Potassium Phosphate 
			Magnesium Sulfate 
			Dextrose 
			Sodium Bicarbonate 
			Calcium Chloride 
			Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 
			Fisher 
			Fisher 
			Fisher 
			Fisher 
			Sigma 
			EMD 
			Baker</td>
			<td style="width:119px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; S7653 
			P217-500 
			P285-3 
			M65-500 
			D16-500 
			S5761 
			CX0130-2 
			2444</td>
			<td style="width:180px;">To prepare Krebs solution</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:237px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:123px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">029405</td>
			<td style="width:180px;">To anesthetesize the animal</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">&#160;Oxygen tank</td>
			<td style="width:123px;">Matheson Tri Gas</td>
			<td style="width:119px;">ox251</td>
			<td style="width:180px;">To use with anesthesia system</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:237px;">Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Matheson Tri Gas</td>
			<td style="width:119px;">Moxn00hn36D</td>
			<td style="width:180px;">To aerate Krebs solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bladder smooth muscle strip contractility as a method to evaluate lower urinary tract pharmacology

Nous décrivons une méthode in vitro pour mesurer la vessie contractilité du muscle lisse, et son utilisation pour l&#39;étude des propriétés physiologiques et pharmacologiques des muscles lisses ainsi que les changements induits par la pathologie. Cette méthode fournit des informations essentielles pour comprendre le fonctionnement de la vessie tout en surmontant les grandes difficultés méthodologiques rencontrées dans des expériences in vivo, comme les manipulations chirurgicales et pharmacologiques qui affectent la stabilité et la survie de la préparation, l&#39;utilisation de tissus humains, et / ou l&#39;utilisation de produits chimiques coûteux. Il fournit également un moyen d&#39;étudier les propriétés de chaque composant de la vessie (c.-à-muscle lisse, les muqueuses, les nerfs) dans des conditions saines et pathologiques. La vessie est enlevée d&#39;un animal anesthésié, placé dans une solution de Krebs et couper en lanières. Les bandes sont placées dans une chambre remplie avec une solution tiède de Krebs. Une extrémité est fixée à un tensio isométriquen transducteur pour mesurer la force de contraction, l&#39;autre extrémité est fixée à une barre fixe. Le tissu est stimulée par addition de composés directement dans le bain ou par des électrodes de stimulation de champs électriques qui activent les nerfs, similaire au déclenchement des contractions de la vessie in vivo. Nous démontrons l&#39;utilisation de cette méthode d&#39;évaluation de contractilité des muscles lisses spontanée au cours du développement et après une lésion de la moelle épinière expérimental, la nature de la neurotransmission (émetteurs et récepteurs impliqués), les facteurs impliqués dans la modulation de l&#39;activité du muscle lisse, le rôle des différents composants de la vessie, et les espèces et les différences d&#39;organes en réponse aux agents pharmacologiques. De plus, il pourrait être utilisé pour l&#39;étude des voies intracellulaires impliqués dans la contraction et / ou de relaxation des muscles lisses, les relations structure-activité et l&#39;évaluation de médicaments libération du transmetteur. La méthode de la lisse de la contractilité du muscle in vitro a été largement utilisée for plus de 50 ans, et a fourni des données qui ont contribué de manière significative à notre compréhension de la fonction de la vessie ainsi que pour le développement pharmaceutique de composés actuellement utilisés en clinique pour la gestion de la vessie.

Activité spontanée Myogenic L&#39;activité myogène spontanée est une caractéristique importante du muscle lisse qui subit des variations avec le développement postnatal 6-9 et pathologie (par exemple, SCI, BOO) 3-5. Parce que cette activité est estimé à contribuer aux symptômes de la vessie hyperactive (OAB) 2, une évaluation des récepteurs, des voies intracellulaires et des agents pharmacologiques qui modulent il, est d...

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Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Ce manuscrit présente un simple, mais puissant, méthode in vitro pour l&#39;évaluation de contractilité du muscle lisse en réponse à des agents pharmacologiques ou la stimulation du nerf. Les principales applications sont le dépistage des drogues et de la physiologie des tissus compréhension, la pharmacologie et la pathologie.

Vessie muscle lisse bande de contractilité comme une méthode pour évaluer urinaires inférieures Pharmacologie

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

bladder-smooth-muscle-strip-contractility-as-method-to-evaluate-lower

Research

JoVE Journal

Medicine

26.1K vues.  University of Pittsburgh School of Medicine.  Ce manuscrit présente un simple, mais puissant, méthode in vitro pour l'évaluation de contractilité du muscle lisse en réponse à des agents pharmacologiques ou la stimulation du nerf. Les principales applications sont le dépistage des drogues et de la physiologie des tissus compréhension, la pharmacologie et la pathologie. 

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Manual Muscle Testing:  A Method of Measuring Extremity Muscle Strength Applied to Critically Ill Patients

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, and persistent nerve and muscle impairments after hospital discharge.1-6 Using an explicit protocol with a structured approach to training and quality assurance of research staff, manual muscle testing (MMT) is a highly reliable method for assessing strength, using a standardized clinical examination, for patients following ARDS, and can be completed with mechanically ventilated patients who can tolerate sitting upright in bed and are able to follow two-step commands. 7, 8 
This video demonstrates a protocol for MMT, which has been taught to &ge;43 research staff who have performed &gt;800 assessments on &gt;280 ARDS survivors. Modifications for the bedridden patient are included. Each muscle is tested with specific techniques for positioning, stabilization, resistance, and palpation for each score of the 6-point ordinal Medical Research Council scale.7,9-11 Three upper and three lower extremity muscles are graded in this protocol: shoulder abduction, elbow flexion, wrist extension, hip flexion, knee extension, and ankle dorsiflexion. These muscles were chosen based on the standard approach for evaluating patients for ICU-acquired weakness used in prior publications. 1,2.

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and critical illness frequently develop long-lasting muscle weakness. Manual muscle testing (MMT) is a standardized clinical examination commonly used to measure strength of peripheral skeletal muscle groups. This video demonstrates MMT using the 6-point Medical Research Council scale.

Test musculaire manuel: une méthode de mesure la force musculaire des extrémités appliquée aux patients gravement malades

Survivors of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other causes of critical illness often have generalized weakness, reduced exercise tolerance, ...

Recherche

Médecine

Probe-based Confocal Laser Endomicroscopy of the Urinary Tract: The Technique

Probe-based confocal laser endomicroscopy (CLE) is an emerging optical imaging technology that enables real-time in vivo microscopy of mucosal surfaces during standard endoscopy. With applications currently in the respiratory1 and gastrointestinal tracts,2-6 CLE has also been explored in the urinary tract for bladder cancer diagnosis.7-10 Cellular morphology and tissue microarchitecture can be resolved with micron scale resolution in real time, in addition to dynamic imaging of the normal and pathological vasculature.7
The probe-based CLE system (Cellvizio, Mauna Kea Technologies, France) consists of a reusable fiberoptic imaging probe coupled to a 488 nm laser scanning unit. The imaging probe is inserted in the working channels of standard flexible and rigid endoscopes. An endoscope-based CLE system (Optiscan, Australia), in which the confocal endomicroscopy functionality is integrated onto the endoscope, is also used in the gastrointestinal tract. Given the larger scope diameter, however, application in the urinary tract is currently limited to ex vivo use.11 Confocal image acquisition is done through direct contact of the imaging probe with the target tissue and recorded as video sequences. As in the gastrointestinal tract, endomicroscopy of the urinary tract requires an exogenenous contrast agent&mdash;most commonly fluorescein, which can be administered intravenously or intravesically. Intravesical administration is a well-established method to introduce pharmacological agents locally with minimal systemic toxicity that is unique to the urinary tract. Fluorescein rapidly stains the extracellular matrix and has an established safety profile.12 Imaging probes of various diameters enable compatibility with different caliber endoscopes. To date, 1.4 and 2.6 mm probes have been evaluated with flexible and rigid cystoscopy.10 Recent availability of a &lt; 1 mm imaging probe13 opens up the possibility of CLE in the upper urinary tract during ureteroscopy. Fluorescence cystoscopy (i.e. photodynamic diagnosis) and narrow band imaging are additional endoscope-based optical imaging modalities14 that can be combined with CLE to achieve multimodal imaging of the urinary tract. In the future, CLE may be coupled with molecular contrast agents such as fluorescently labeled peptides15 and antibodies for endoscopic imaging of disease processes with molecular specificity.

Probe-based confocal laser endomicroscopy enables real-time microscopy of the human urinary tract during cystoscopy, providing dynamic, intravital imaging of pathological states such as bladder cancer with cellular resolution. Endomicroscopy may augment the diagnostic accuracy of standard white light endoscopy and provide intraoperative image guidance to improve surgical resection.

Basée sur sonde endomicroscopie confocale laser de l&#39;appareil urinaire: La Technique

Probe-based  confocal laser endomicroscopy (CLE) is an emerging optical imaging technology  that enables real-time in vivo microscopy of mucosal surfaces ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Un procédé de précipitation modification pour isoler les exosomes urinaire

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized by increased urgency and frequency of urination, as well as nocturia and general pelvic pain, especially upon bladder filling or voiding. Despite years of research, the cause of IC/BPS remains elusive and treatment strategies are unable to provide complete relief to patients. In order to study nervous system contributions to the condition, many animal models have been developed to mimic the pain and symptoms associated with IC/BPS. One such murine model is urinary bladder distension (UBD). In this model, compressed air of a specific pressure is delivered to the bladder of a lightly anesthetized animal over a set period of time. Throughout the procedure, wires in the superior oblique abdominal muscles record electrical activity from the muscle. This activity is known as the visceromotor response (VMR) and is a reliable and reproducible measure of nociception. Here, we describe the steps necessary to perform this technique in mice including surgical manipulations, physiological recording, and data analysis. With the use of this model, the coordination between primary sensory neurons, spinal cord secondary afferents, and higher central nervous system areas involved in bladder pain can be unraveled. This basic science knowledge can then be clinically translated to treat patients suffering from IC/BPS.

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized in part by pelvic pain. In order to study nervous system contributions to the condition, a physiological model of urinary bladder pain is used in mice and rats.

Réponses vessie distension évoqués viscéromotrice comme modèle pour douleur à la vessie chez la souris

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

Calcification vasculaire des cellules musculaires lisses et imagerie de Aortic calcification et Inflammation

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We describe methods to measure ex vivo myometrium contractility. This assay can be used to investigate factors and molecules involved in the modulation of myometrial contraction and to determine their excitatory or inhibitory actions, and hence their therapeutic potential in vivo. Biopsies are obtained from women undergoing cesarean section delivery with informed consent. Fine strips of myometrium are dissected, clipped and attached to a force transducer within 1 mL organ baths superfused with physiological saline solution at 37 &#176;C. Strips develop spontaneous contractions within 2&#8211;3 h under set tension and remain stable for many hours (&#62;6 h). Strips can also be stimulated to contract such as by the endogenous hormones, oxytocin and vasopressin, which cause concentration-dependent modulation of contraction frequency, force and duration, to more closely resemble contractions in labor. Hence, the effect of known and novel drug leads can be tested on spontaneous and agonist-induced contractions.
This protocol specifically details how this assay can be used to determine the potency of known and novel agents by measuring their effects on various parameters of human myometrial contraction. We use the oxytocin- and V1a receptor antagonists, atosiban and SR49059 as examples of known compounds which inhibit oxytocin- and vasopressin-induced contractions, and demonstrate how this method can be used to complement and validate pharmacological data obtained from cell-based assays to aid drug development. The effects of novel agonists in comparison to oxytocin and vasopressin can also be characterized. Whilst we use the example of the oxytocin/ vasopressin system, this method can also be used to study other receptors and ion channels that play a role in uterine contraction and relaxation to advance the understanding of human uterine physiology and pathophysiology.

This article describes experimental protocols to study ex vivo contractions of human myometrium and their application in drug discovery. This technique is used to improve the understanding of myometrial physiology and pathophysiology as well as to validate pharmacological data from novel research probes or drug leads.

Mesures de contractilité du Human Muscle lisse utérin à l’aide le développement de médicaments

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ion channels and electrogenic pumps that regulate Vm in disease conditions could potentially alter Vm, vascular tone, and blood flow. Thus, a basic understanding of electrophysiology and the methods necessary to accurately record Vm in healthy and diseased states are essential. This method will allow modulating Vm using different pharmacological agents to restore Vm. Although there are several methods, each with its advantages and disadvantages, this article provides protocols to record Vm from cannulated resistance vessels such as the middle cerebral artery using the microelectrode impalement method. Middle cerebral arteries are allowed to gain myogenic tone in a myograph chamber, and the vessel wall is impaled using high resistance microelectrodes. The Vm signal is collected through an electrometer, digitized, and analyzed. This method provides an accurate reading of the Vm of a vessel wall without damaging the cells and without changing the membrane resistance.

The primary goal of this article is to provide details of how to record membrane potential (Vm) from the middle cerebral artery using the microelectrode impalement method. The cannulated middle cerebral artery is equilibrated to gain myogenic tone, and the vessel wall is impaled using high resistance microelectrodes.

Méthode d'empalement de microélectrode pour enregistrer le potentiel de membrane d'une artère cérébrale moyenne cannulated

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

Analyse quantitative de la Composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées de Muscle lisse Cell Lineage-Tracing souris

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Ultrasonography of the Adult Male Urinary Tract for Urinary Functional Testing

The incidence of clinical benign prostatic hyperplasia (BPH) and lower urinary tract symptoms (LUTS) is increasing due to the aging population, resulting in a significant economic and quality of life burden. Transgenic and other mouse models have been developed to recreate various aspects of this multifactorial disease; however, methods to accurately quantitate urinary dysfunction and the effectiveness of new therapeutic options are lacking. Here, we describe a method that can be used to measure bladder volume and detrusor wall thickness, urinary velocity, void volume and void duration, and urethral diameter. This would allow for the evaluation of disease progression and treatment efficacy over time. Mice were anesthetized with isoflurane, and the bladder was visualized by ultrasound. For non-contrast imaging, a 3D image was taken of the bladder to calculate volume and evaluate shape; the bladder wall thickness was measured from this image. For contrast-enhanced imaging, a catheter was placed through the dome of the bladder using a 27-gauge needle connected to a syringe by PE50 tubing. A bolus of 0.5 mL of contrast was infused into the bladder until a urination event occurred. Urethral diameter was determined at the point of the Doppler velocity sample window during the first voiding event. Velocity was measured for each subsequent event yielding a flow rate. In conclusion, high frequency ultrasound proved to be an effective method for assessing bladder and urethral measurements during urinary function in mice. This technique may be useful in the assessment of novel therapies for BPH/LUTS in an experimental setting.

We describe the use of high frequency ultrasound with contrast imaging as a method to measure bladder volume, bladder wall thickness, urine velocity, void volume, void duration, and urethral diameter. This strategy can be used to assess voiding dysfunction and treatment efficacy in various mouse models of lower urinary tract dysfunction (LUTD).

Ultrasonographie de l'appareil urinaire masculin adulte pour l'essai fonctionnel urinaire

The incidence of clinical benign prostatic hyperplasia (BPH) and lower urinary tract symptoms (LUTS) is increasing due to the aging population, resulting ...

Palatable Western-style Cafeteria Diet as a Reliable Method for Modeling Diet-induced Obesity in Rodents

Obesity is rapidly increasing in incidence in developed and developing countries and is known to induce or exacerbate many diseases.&#160;The health burden of obesity and its comorbid conditions highlight the need for better understanding of its pathogenesis, yet ethical constraints limit studies in humans. To this end externally valid models of obesity in laboratory animals are essential for the understanding of being overweight and obesity.&#160;While many species have been used to model the range of changes that accompany obesity in humans, rodents are most commonly used. Our laboratory has developed a western-style cafeteria diet that consistently leads to considerable weight gain and markers of metabolic disease in rodents. The diet exposes rodents to a variety of highly palatable foods to induce hyperphagia, modeling the modern western food environment. This diet rapidly induces weight gain and body fat accumulation in rats allowing for the study of effects of overeating and obesity. While the cafeteria diet may not provide the same control over macronutrient and micronutrient profile as purified high-fat or high-fat, high-sugar diets, the cafeteria diet typically induces a more severe metabolic phenotype than that observed with purified diets and is more in line with metabolic disturbances observed in the overweight and obese human population.

This protocol describes the use of a highly palatable, western-style cafeteria diet to model overeating and obesity in rodents. Here, we provide a detailed outline of food selection, preparation and measurement, and explain methodological factors that assist in generating a robust and reproducible phenotype.

Obesity is rapidly increasing in incidence in developed and developing countries and is known to induce or exacerbate many diseases.&#160;The health ...