The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.

NOTE: Toutes les procédures décrites dans ce document sont effectuées conformément aux directives établies par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université d&#39;État du Michigan. Préparation 1. Système et configuration <ol><li> Ajouter 5 L d&#39;une solution de sel physiologique (PSS), qui est la quantité nécessaire pour une expérience de contraction de bain de tissu qui utilise jusqu&#39;à 50 ml bains de tissus; voir Tableau 2 pour PSS recette. Calculer le volume total requis en multipliant le nombre de bains de tissus fois le volume du bain et en multipliant ensuite par le nombre de lavages de tissus est requise. <ol><li> Utilisez le Tableau 2 comme un guide pour faire PSS. Dissoudre les sels dans environ quatre litres d&#39;eau. REMARQUE: HPLC - l&#39;eau de type I est recommandé </li><li> Ajouter 8 ml d&#39;une solution de CaCl 2 M (147 g / L si l&#39;on utilise le sel de dihydrate) à la solution, de sorte que la solution finale est de 1,6 mM de calcium. </li><li> PSS la solution de Quantum à 5 L. </li></ol&gt; </li><li> Préchauffer le système de bain de tissu à 37 ° C par mise sous tension du bain d&#39;eau chauffée à recirculation. Etape critique: Chaque composant du système est chemise d&#39;eau, se assurer qu&#39;ils sont connectés en série les uns aux autres. Le sens de circulation est essentielle - veiller à ce que les débits d&#39;eau dans chaque composante au plus bas connexion barbelés et sur la connexion au fer barbelé le plus élevé. </li><li> Activer le système d&#39;acquisition de données. Puissance sur les capteurs de force au moins 15 minutes avant l&#39;expérience pour équilibrer la température. REMARQUE: La plupart des capteurs de force emploient jauges de contrainte qui sont sensibles aux variations de température et présentent dérive thermique initialement après l&#39;alimentation est appliquée. </li><li> Lancement logiciel d&#39;acquisition de données et assurer une connexion avec le système d&#39;acquisition de données. Se il vous plaît suivre les instructions de fabrication pour permettre l&#39;enregistrement de données. </li><li> Assurez-vous que les capteurs de force sont étalonnés avant tissu est placé dans le bain de tissu et avant l&#39;enregistrement des données a commencé; foles instructions du fabricant pour l&#39;étalonnage llow. </li><li> Connectez le système de bain de tissu à un 95% O 2/5% CO 2 bouteille de gaz de qualité médicale et vérifier les fuites de gaz et le système sous pression. </li><li> Remplir les réservoirs de bain de tissu avec PSS et laisser le temps de solution atteindre la température optimale. Premier système et éliminer les bulles d&#39;air dans le système et les tubes. </li><li> Vérifiez aérateurs de bain de tissu pour assurer l&#39;aération de solution cohérente, qui oxygène le tampon PSS et fournit mouvement brownien à distribuer des médicaments qui seront introduites dans le bain de tissu pendant l&#39;expérience. Assurez-vous que l&#39;aération / bulles ne provoque pas de mouvement de tissu, ce qui va perturber les enregistrements de données; diminuer le débit de gaz que nécessaire. NOTE: Le bain de tissu et le système d&#39;acquisition de données sont maintenant prêts à commencer l&#39;expérience. </li></ol> 2. Préparation des tissus <ol><li> Idéalement, disséquer les tissus de l&#39;animal immédiatement avant d&#39;utiliser et directement iNto PSS. NOTE: Certains tissus peuvent être sauvegardés dans PSS nuit à 4 ° C, mais les contrôles appropriés doivent être effectués pour valider la fonction des tissus après un stockage prolongé; voir la section 6. </li><li> Utilisez l&#39;aorte thoracique que le tissu dans cet exercice. </li><li> Anesthésier le rat conformément aux directives institutionnelles et placer la face dorsale de rat bas. Confirmez anesthésie via un orteil-pincement et la perte de réponse réflexe à ce stimulus douloureux. NOTE: Ce protocole utilise 70 mg / kg de pentobarbital envoyé par une injection intrapéritonéale. Les directives institutionnelles pour rongeurs anesthésie peuvent différer. </li><li> Insérer un pneumothorax par la création d&#39;une incision aux ciseaux le long de la membrane au fond de la cage thoracique. Ensuite, continuer l&#39;incision à partir de la partie inférieure de la cage thoracique et de la couper en deux sternum. </li><li> Disséquer ou de placer de côté ces organes qui sont au sommet de la colonne vertébrale et de localiser l&#39;aorte, qui se trouve directement le long de la colonne vertébrale. NOTE: Ce step fournit un espace de travail clair pour disséquer l&#39;aorte. </li><li> Sever toutes les connexions à l&#39;aorte; de l&#39;œsophage, du poumon, etc., et couper l&#39;aorte perpendiculaire à la colonne vertébrale au niveau de la membrane. </li><li> Tenir délicatement l&#39;aorte avec une pince et utiliser des ciseaux à disséquer l&#39;aorte de la colonne vertébrale. Lancer la dissection dans la zone de membrane inférieure adjacente à la colonne vertébrale et le travail vers le cœur. Assurez-vous de prendre des précautions supplémentaires pour ne pas tirer ou tirer sur le tissu aortique, ce qui peut endommager les tissus. </li><li> Placer immédiatement l&#39;aorte dans le plat de dissection préparée contenant PSS. NOTE: La dissection de l&#39;aorte en anneaux est préférable de faire dans un plat de dissection qui a une fondation de silastic noir. Cela permet l&#39;utilisation de fils qui peuvent être utilisés pour cathétériser l&#39;aorte et être fixé à la cuvette, assurant la stabilité tandis que dans le plat de dissection. Le fond noir offre un contraste qui facilite la dissection. Il faut faire attention lors de l&#39;utilisation de fils de canulation selon la endothelialeial couche de cellules peut être enlevée avec un excès de frottement du fil contre la lumière du vaisseau. </li><li> Prenez un fil et faire un petit angle de 90 ° à une extrémité et pousser l&#39;extrémité coudée dans la fondation silastic pour ancrer le fil de guidage. Placez l&#39;ensemble de l&#39;aorte dans le plat de dissection. </li><li> Tenez l&#39;extrémité du fil de guidage avec une pince, puis enfilez doucement le fil dans la lumière de l&#39;aorte. </li><li> Utilisez une pince et faites glisser l&#39;aorte sur le fil. Lorsque l&#39;extrémité libre du fil de guidage est visible, courbe le fil doucement et placez l&#39;extrémité libre dans la fondation silastic du plat pour stabiliser le tissu. </li><li> Utilisation Vannas petits ciseaux et des pinces, enlever le tissu adipeux périvasculaire et tous les autres tissus étrangers, des caillots de sang, etc., jusqu&#39;à l&#39;aorte thoracique apparaît blanche et un peu fibreuse. </li><li> Retirer l&#39;aorte nettoyé de fil et utiliser des ciseaux pour couper l&#39;aorte dans les anneaux qui sont d&#39;environ 3-5 mm de largeur. </li><li> Placez un anneau aortique sur un d&#39;une paire de ticrochets SSUE en maintenant le crochet et l&#39;aide de pinces à glisser doucement l&#39;anneau sur le crochet. Répétez ce processus avec le deuxième crochet. Prenez soin de se assurer que les crochets ne pas se emmêler; voir la figure 3. </li><li> Vérifiez que chaque crochet a une suture de soie différente attachée. Vérifiez que un crochet a une petite boucle nouée de soie qui permet la fixation à une tige en verre ou en acier inoxydable, tandis que l&#39;autre est une pièce 10-4 cm de long suture qui sera pour le transducteur de force lié à la main; voir la figure 3. Remarque: Une fois que l&#39;aorte est fixé aux crochets, le tissu est prêt à être monté dans le bain de tissu; voir la figure 3. </li><li> Répéter les étapes 02.14 à 02.15, pour monter un deuxième anneau aortique dans la deuxième chambre de bain de tissu. </li></ol> 3. Placement des tissus à Bath <ol><li> A noter que dans ce système, les bains de tissus eux-mêmes sont stationnaires. A cette époque, remplissez les bains de tissus avec réchauffé, PSS aéré et permettre à la solution pour venir à TEMPERATURe. </li><li> Avec le fil de suture en soie, attacher l&#39;un des crochets de la préparation de tissu de la cheville sur la tige d&#39;acier inoxydable. Placer cette extrémité dans la chambre de bain de tissu. Connectez la tige à un stand de bague et placer l&#39;autre extrémité dans le bac à coloration avec PSS de garder tissu immergé dans un tampon; voir la figure 3. <ol><li> Placer la tige et du tissu dans la chambre de bain de tissu et se assurer que le tissu est complètement immergé dans PSS et la tige est sécurisé; voir la figure 3. </li><li> Attachez l&#39;autre suture pour le capteur de force et veillez à laisser du mou dans la suture entre le tissu et le capteur de force. NOTE: Ce jeu sera supprimé en ajustant le micromètre; voir la figure 3. </li></ol></li><li> Répétez ces étapes pour la deuxième chambre annulaire et un bain de tissu aortique. </li></ol> 4. Mise en tension passive Note: Chaque tissu a une longueur (Lo) au cours de laquelle les cellules musculaires lisses répondent optimally. Des expériences préliminaires pour déterminer la tension d&#39;étirage optimal qui permet d&#39;obtenir cette longueur doit être effectuée pour chaque type de tissu particulier à examiner. Le rat aorte thoracique a une tension d&#39;étirage passive optimale de 4 g. <ol><li> Utilisez le micromètre / pignon et crémaillère pour augmenter la tension à 2 g et attendre pour le tissu pour atteindre plateau. Une fois plateau est atteint, augmenter la tension une autre 2 g et attendre pour que le tissu plateau. NOTE: Dans les anneaux aortiques, après la tension initiale de 2 g est fixé et le plateau atteint, le tissu doit ensuite se détendre à ~ 1,6 g. Une deuxième application de 2 g porterait le tissu à ~ 3,6 g, à partir de laquelle le tissu sera de nouveau se détendre et la tension diminue. Ainsi, après avoir ajouté 4 g de tension totale, le logiciel devrait indiquer environ 3,2 g de tension. </li><li> Répétez ces étapes pour la deuxième chambre annulaire et un bain de tissu aortique. </li></ol> 5. équilibration et l&#39;élaboration de médicaments <ol><li> Equilibrer le tissu pour60 min après l&#39;application d&#39;une tension au tissu passive. </li><li> Pendant la phase d&#39;équilibre, lavez le tissu toutes les 15-20 minutes. Égoutter le bain de tissus et de remplacer le PSS avec PSS partir d&#39;un réservoir chauffé. REMARQUE: Pendant ce temps, le tissu va se détendre, ce qui est indiqué par la perte de tension passif. </li><li> Pendant ce temps, préparer des médicaments pour l&#39;expérience, qui doivent être d&#39;au moins 1 000 fois plus concentrée que la concentration réelle dans le bain, de sorte que seul un petit volume du stock de médicaments est nécessaire pour obtenir la concentration désirée. </li></ol> 6. Défi initiale <ol><li> À la fin de la période d&#39;équilibrage, lavez le tissu une dernière fois, enregistrer les données et remettre à zéro toutes les entrées. </li><li> Choisir un agoniste (composé qui provoque la contraction actif) auquel répond le tissu. NOTE: Dans le rat aorte thoracique, le muscle lisse artériel activement contracter à un agoniste de récepteur adrénergique alpha en raison de l&#39;innervation dutissus par le système nerveux sympathique. Un agoniste adrénergique ne serait pas utile dans les tissus intestinaux étant donné que les agonistes adrénergiques provoquent la relaxation. Dans ce cas, un agoniste du récepteur tel que l&#39;acétylcholine (récepteur cholinergique) peut être utilisé. Une alternative à la fois la phényléphrine et l&#39;acétylcholine est d&#39;utiliser un agoniste non-récepteur tel que riche en potassium (K) comme le premier défi. Dans le muscle lisse, haute K fonctionne pour indirectement canaux calciques ouverte et est donc considérée comme un indice général de l&#39;intégrité du muscle lisse. <ol><li> Effectuer le premier défi ou le défi de réveil en ajoutant 10 -5 M phényléphrine au bain de tissu. Pour atteindre cette concentration dans 50 ml de bain tissulaire, ajouter 50 ul d&#39;une solution de phenylephrine 10 -2 M. NOTE: 50 ul dans 50 ml de PSS est une dilution de 1/1000, de sorte que la concentration finale est 1,000x moins de stocks, ou 10 -5 M. La connaissance du volume et maintien cohérente du volume dans le bain de tissu chambre est critique pour la détermination de la concentration finale du médicament. </li></ol></li><li> Ajouter 10 -5 M à la phényléphrine bain de tissu et permettre la contraction de plateau pic, puis, lorsque la pente de données devient égal à zéro. Assurez-vous d&#39;enregistrer chaque événement expérimentale pour faciliter l&#39;analyse post-expérimentale. </li><li> Après plateau, laver l&#39;agoniste de manière approfondie par la vidange et le remplissage de la chambre de bain de tissu avec le nouveau PSS. Assurez-vous d&#39;enregistrer ces événements ainsi. REMARQUE: Une règle de base est que la concentration de l&#39;agoniste dans le bain est réduite de 10 fois à chaque lavage. Bien que, plus de 3-4 lavages peuvent être nécessaires pour ramener le tissu vers le bas à son ton de référence d&#39;équilibre (de tension). </li><li> Laisser reposer le tissu au ton de référence pour ~ 10 min avant de continuer. </li></ol> 7. Expérience NOTE: La prazosine, un antagoniste des récepteurs adrénergiques alpha, sera introduit dans la chambre de bain de tissu pour déplacer le resp de concentrationcourbe onse à la phényléphrine (PE); ce est un antagonisme démontrable. <ol><li> Pour une salle de bain, ajouter du véhicule (H 2 O) dans laquelle a été dissous prazosine. À un autre, ajouter la concentration appropriée de la prazosine. Dans ce cas, ajouter 25 ul de véhicule à une salle de bain et 25 ul de 10 -5 M de concentration prazosine à l&#39;autre pour obtenir un 5 x 10 -9 M ou une concentration de 5 nM dans le bain. REMARQUE: Bien que l&#39;ajout d&#39;un véhicule semble inutile dans cet exemple, il est impératif de le faire lors de l&#39;utilisation d&#39;autres véhicules qui ont un potentiel pour être vasoactif (par exemple, le DMSO, l&#39;éthanol, l&#39;acétate). Ajouter le véhicule correspondant, même si peu de preuves existe pour qu&#39;il soit vasoactif. </li><li> Laissez véhicule / prazosine dans les bains et ne pas laver le tissu pendant 1 heure. <ol><li> Alors que les tissus sont équilibrage, préparer plusieurs concentrations de l&#39;agoniste (PE). Inclure une large gamme de concentrations, à partir des concentrations suscitant pas de réponse (par exemple, &lt;/ Em&gt; 10 -9 M PE) à des concentrations qui dépassent la réponse maximale (par exemple, 10 -4 M PE). Depuis courbes concentration-réponse sont logarithmiques dans la nature, faire six solutions séparées d&#39;achat d&#39;actions de PE (10 -6 -10 -1 M) par des dilutions en série à partir de la solution mère à 10 M -1. Assurez-vous que le volume nécessaire pour chaque concentration est légèrement supérieure à tripler le volume total nécessaire pour tous les bains (c.&gt; 300 pi). </li></ol></li><li> Procéder à l&#39;ajout de l&#39;agoniste, tel que décrit dans le Tableau 1. NOTE: Cette expérience va générer une courbe de réponse de concentration cumulative à PE; chaque itération tient compte de la quantité de matière déjà ajouté au bain. Ajouts se produisent jusqu&#39;à ce qu&#39;ils augmentent plus la contraction, ou toute la courbe a atteint un plateau. <ol><li> Ajouter chaque concentration de médicament individuellement jusqu&#39;à ce que le seuil de tissu est atteinte. </li><li> Si aucun changement ne se produit, ajouter la prochaine concentration dans lesérie; voir le tableau 2. NOTE: Le calendrier de ces ajouts dépend de l&#39;agoniste utilisé. Par exemple, la noradrénaline et la phényléphrine contraction se développe rapidement, et devraient se stabiliser en quelques minutes. En revanche, l&#39;endothéline-1 contraction se développe lentement et peut ne pas se stabiliser à près de 45 min. Autres expérimentation peut être effectuée sur le tissu après la construction d&#39;une courbe de ce type, pour autant que (1) la substance hors lavages; et (2) il peut être démontré que le tissu revient au comportement contractile normale et ne est pas affecté par les sollicitations précédentes. </li></ol></li></ol> 8. Analyse des données <ol><li> Assurez-vous de sauvegarder les données immédiatement avant et après une intervention (par exemple, réveil ou la courbe pleine). </li><li> Trouver et mettre la ligne de base de tissu pour chaque canal chambre / d&#39;entrée de bain de tissu, ce qui contribuera à l&#39;analyse des données. </li><li> Une fois la ligne de base est réglé, trouver la réponse maximale pour chaque concentration, et enregistrer le change de base. Déplacer successivement à travers chacune des concentrations et enregistrer le décalage vertical. </li><li> Graphiquement des données résultantes. Pour ce faire, dans tout programme graphique. REMARQUE: Graph Pad Prism est conçu pour pharmacologues, et ce est idéal pour le type d&#39;expérience présentée ici. </li></ol>

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Authors have nothing to disclose.

Mesure de la force isométrique comme un outil de recherche est plus de 150 ans, mais il continue d&#39;être la technique prototype pour la caractérisation des récepteurs dans les tissus contractiles 2. La puissance de cette technique réside dans sa simplicité et sa polyvalence: en enregistrant les réponses induites par des concentrations croissantes d&#39;un agoniste en présence ou en l&#39;absence d&#39;un antagoniste, une multitude d&#39;informations peuvent être obtenues sur les caractéristiques pharmacologiques de chaque médicament et le récepteur auquel 5.3 il se lie. Des expériences de ce type Garner également des informations sur la concurrence face à la nature non-concurrentielle des antagonistes utilisés, ainsi que l&#39;hétérogénéité des récepteurs et des effets des médicaments non spécifiques 6-8. Ainsi, avec permutations simples à cette expérience de bain de tissu isolé, un profil pharmacologique relativement complet des récepteurs qui médient induite par l&#39;agoniste contraction musculaire peut être généré. En termes de agonisme, ee efficacité relative (E max) et la puissance (CE50) d&#39;un agoniste dans un tissu donné peut être calculé et comparé à d&#39;autres agonistes de réponses à une même tissu. Dans notre expérience, le rat aorte thoracique a été incubée avec le véhicule ou la α 1 adrénergique antagoniste du récepteur de la prazosine (5 nM) pendant une heure avant l&#39;addition de l&#39;α 1 adrénergique phenylephrine dans le bain de tissu et pour générer la contraction. La figure 2 présente modifié résultats de la figure 1. Les réponses verts ont été marquées avec la contraction maximale atteinte par PE marqué comme max, la contraction maximale ½ marqué comme tel, puis associé à la concentration de PE qui a provoqué cette réponse. L&#39;identification de ces valeurs est l&#39;identification de la concentration efficace d&#39;un agoniste qui réalise une demi-max (50%) ou réponse CE 50 valeur. Malheureusement, en utilisant le paramètre agoniste-dépendanteest seul pour déterminer les caractéristiques de liaison aux récepteurs peuvent être compliqués neuf. Idéalement, des expériences supplémentaires en utilisant des antagonistes du récepteur permettent le calcul de deux paramètres importants que sont la clé de la définition de l&#39;interaction entre un médicament et un récepteur: l&#39;-log 10 de la dissociation de l&#39;antagoniste constante (pK B) et le -log 10 molaire de l&#39;antagoniste concentration nécessaire pour provoquer une double déplacement vers la droite de la courbe concentration-réponse (pA 2) 10. Les deux B et K pA 2 de gain leur utilité dans le fait que ce sont des valeurs agonistes indépendante, et reste constante, même entre 11 différents tissus. D&#39;après les données de la figure 2, pK B peut être calculée en utilisant l&#39;équation suivante et basée sur CE 50 valeurs calculées ailleurs: EC 50 en l&#39;absence de la prazosine = 2 x 10 -8 M CE 50 dans le préle sens de la prazosine = 7 x 10 -6 M Résolvez K B dans l&#39;équation suivante: log (DR-1) = log [B] - log K B Où: [B] = concentration antagoniste, ou 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8,3 dr = rapport de dose de CE 50 valeur, en présence de l&#39;antagoniste / CE 50 dans l&#39;absence. Se il ya un déplacement vers la droite, cette valeur sera supérieur à un. Ainsi: dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M ou 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350 Substituer à [B] et dr: log (350-1) = -8 - log K B 2,54 = -8 - log KB pK B = 10,54 Cette valeur de la prazosine est compatible avec les valeurs obtenues lorsque la prazosine interagit avec un α 1 adrénergique receptou 12,13, ce qui suggère que le récepteur adrénergique médiation contraction à la phényléphrine est le récepteur adrénergique α 1. Plusieurs étapes sont essentielles à la réussite de ces expériences. Les tissus doivent rester dans PSS après la dissection afin d&#39;éviter la perte de viabilité tissulaire. Toute préparation musculaire isométrique a un rapport longueur-tension optimale qui génère la force maximale contre tension passive 14,15. Pour l&#39;expérience décrite dans ce protocole, la tension passive optimale a déjà été déterminée par incréments brièvement l&#39;ajout de 0,5 g de tension passive au tissu. Le tissu doit commencer sans tonalité et puis après 30 min d&#39;équilibration, le tissu a été contestée avec une concentration maximale de KCl (80 mM), qui a généré tonalité actif. Ensuite, le tissu a été lavé et laisse revenir à la tonalité de référence. Après 15 min au départ, a été placée un autre 0,5 g de tension passive et ce processus est répété jusqu&#39;à ce qu&#39;un plateau detension active a été obtenue avec une tension passive supplémentaire. Dans des expériences préliminaires, 4 g total de tension passive a été déterminé à atteindre maximale génération de tension active dans les anneaux aortiques, et donc ce montant total de tension est placé sur les anneaux avant équilibration. La procédure, il est préférable de zéro demande de tension passive avant, mais peut être fait à tout moment avant l&#39;expérience. Sur-étirement des tissus, en tout point de l&#39;expérience ou de dissection, aura un impact négatif viabilité des tissus et les résultats expérimentaux. Ce est plus impératif lorsque plaçant les tissus dans le bain, car cette étape a la plus forte probabilité d&#39;étirement excessif. Un lavage adéquat, en nombre et en durée est nécessaire pour les effets reproductibles. Un deuxième défi trop tôt après un premier défi, ou avant tissus sont retournés à la tension de base, se traduira dans les réponses aberrantes. Si l&#39;étude antagonistes / inhibiteurs réversibles, des tissus doivent pas être lavés avant agoniste outre, comme l&#39;INHIBIconcentration Tor sera diminué. Il ya des avantages et des inconvénients notables aux essais isolés de bain de tissu. Inconvénients: Les tissus peuvent éprouver différents degrés de dommages pendant l&#39;ablation chirurgicale ou le placement d&#39;anneaux sur des crochets. Depuis la cellule endothéliale est la doublure intérieure de l&#39;anneau aortique, il faut veiller sur le placement de l&#39;anneau sur des crochets afin de ne pas endommager cette couche cellulaire. Les tissus peuvent également avoir nettement différentes longueurs de temps dans lequel elles sont viables dans le bain de tissu, et cela doit être déterminé; pas tous les tissus sont les mêmes. Le long de ces lignes, les tissus peuvent changer dans leur réactivité tout au long de la journée tels que les contrôles de temps deviennent un contrôle nécessaire pour chaque expérience. Un bon exemple en est le cochon de Guinée trachée qui permet d&#39;améliorer la contractilité maximale de 100% lors d&#39;une expérience typique de 8 heures. Les médicaments qui sont faiblement solubles dans l&#39;eau peuvent précipiter dans le PSS. Enfin, un cumulatife ajouts non cumulatifs d&#39;un médicament qui est un agoniste pourrait entraîner des résultats différents si désensibilisation du récepteur à l&#39;agoniste se produit; angiotensine II est un de ces médicaments qui montre tachyphylaxie rapides. Avantages: Un des principaux avantages des expériences de bain de tissu, ce est qu&#39;il est en temps réel; on peut voir l&#39;expérience telle qu&#39;elle se déroule et peut rapidement tirer des conclusions et de planifier les prochaines étapes, ainsi que dépanner pendant une expérience. Une expérience prend un jour à faire. Tissus multiples peuvent généralement être préparés à partir d&#39;un animal tel qu&#39;un animal peut servir comme son propre contrôle, et qui ajoute la force à une expérience. On peut également isoler le tissu à partir d&#39;autres facteurs afin de tester une réponse relativement pur du tissu au médicament. Expériences in vitro, tels que le système de bain de tissu permettent également l&#39;utilisation d&#39;une petite quantité de médicament par rapport à une expérience in vivo. Le dispositif expérimental de base décrits ici peuvent êtrelargement modifié pour permettre l&#39;enregistrement de paramètres supplémentaires ou l&#39;introduction d&#39;autres stimuli externes. Par exemple, l&#39;addition d&#39;électrodes pour permettre la stimulation électrique des nerfs innervant de 16,17 terrain. Avec l&#39;ajout de sondes thermiques ou de pH, les effets de la température et du pH sur les réponses contractiles peuvent également être mesurés 18,19. De même, l&#39;oxygène peut être substitué partiellement ou en totalité avec N 2 pour évaluer les effets induits par l&#39;hypoxie. En outre, les mêmes principes de base de la mesure de la contractilité isométrique utilisés dans cette vidéo peuvent être utilisés pour développer des systèmes qui permettent la mesure concomitante de développement et les changements de tension isométrique en calcium intracellulaire 20. la transduction de signal est également facilement étudié, étant donné que les systèmes existent qui peuvent congeler rapidement un échantillon de tissu au cours d&#39;une réaction, de telle sorte que l&#39;activité d&#39;un système de voie de transduction de signal peut être vérifiée biochimiquement. La variation de equipment qui peut être utilisé pour ce faire est énorme. Tout ce système, soit la main construit ou automatisé, peut être acheté auprès de plusieurs sociétés différentes. Les bains de tissu et les détenteurs de tissus utilisés dans ce protocole étaient (bains de tissus) et main construit (titulaires) soufflé à la main par un atelier d&#39;usinage en interne Michigan State University.

La discipline de la pharmacologie a utilisé le système de bain de tissu isolé depuis plus de 150 ans. La polyvalence de ce système a permis aux scientifiques à travers le monde pour caractériser les récepteurs et signal du récepteur de transduction, avec cette connaissance à la base de thérapies qui ont traité des millions de personnes souffrant de maladies ou de troubles tels que l&#39;hypertension, l&#39;insuffisance cardiaque, le diabète, les maladies gastro-intestinal, de la vessie dysfonction, l&#39;asthme, et de troubles de la déglutition, pour ne en nommer que quelques-uns. À ce jour, le bain de tissu isolé reste un aspect important du développement de médicaments et la recherche fondamentale, car elle permet le tissu de fonctionner comme un tissu. Dans cette leçon JoVE, un protocole officiel est partagée pour démontrer une expérience visuelle et virtuelle en utilisant les données d&#39;une expérience isolée de tissu de bain qui mesure la contraction isométrique, qui permet la caractérisation du récepteur. Le principal avantage de cette technique est que le tissu est une visnd fonctions en tant que tissu ensemble, avec un résultat physiologique (contraction ou la relaxation) qui est pertinent pour le corps. Ce est une synthèse des étapes (sur les interactions médicament-récepteur, transduction du signal, la deuxième génération de messagerie, les changements dans l&#39;excitabilité musculaire lisse, et les changements dans la fonction des tissus). Alors que d&#39;autres techniques permettent l&#39;étude de chacune de ces étapes (par exemple, la liaison de radioligand pour l&#39;affinité du médicament, la mesure de messagers secondaires), la technique du bain de tissu isolé permet une intégration de l&#39;ensemble de ces étapes 1. Un autre avantage est que le maintien de la fonction des tissus permet de calculer des variables pharmacologiques importantes qui sont plus significative dans un tissu par rapport à un cadre cellulaire; il se agit de plus près à la façon dont les médicaments examinés travailleraient dans le corps dans son ensemble.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabChart Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td></td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PowerLab (4 channel)&#160;</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadBridge (4 channel)</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML112</td>
			<td>ML112</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Adapter Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC11</td>
			<td>MLAC11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Force-Displacement Transducer</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>FT03</td>
			<td>FT03</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Transducer Cable</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>TAC-7 REV-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BNC to BNC Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IsoTemp 2100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>IC-2100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Bath</td>
			<td>Multiple Sources&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Physiological Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Braided Silk Suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7615</td>
			<td>SP104</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ring Stand</td>
			<td>Humboldt MFG Co</td>
			<td>H-2122 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Dishes</td>
			<td>Handmade with Silicone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tygon Tubing</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>63010-100</td>
			<td>R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hose Clamps</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co</td>
			<td>06832-08</td>
			<td>SNP-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Muscle Bath</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250ml Warming Chambers</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas Dispersion Tube</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7202-06</td>
			<td>7202-02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Custom Stands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Three-Prong Clamps</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-Connector</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Hooks</td>
			<td>Hand Made in House</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica Stereomicroscope MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>10447254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12562-36</td>
			<td>12562-36</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Petri Dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td>7740 Glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 170 Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-150</td>
			<td>160-150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Splinter &#38; Fixation Forceps</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-55</td>
			<td>160-55</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of smooth muscle function in the isolated tissue bath-applications to pharmacology research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

En termes d&#39;agonisme, l&#39;efficacité relative (E max) et la puissance (CE 50) d&#39;un agoniste dans un tissu donné peuvent être calculées et comparées aux réponses d&#39;autres agonistes de la même tissu 1. Dans notre expérience, le rat aorte thoracique a été incubée avec le véhicule ou la α 1 adrénergique antagoniste du récepteur de la prazosine (5 nM) pendant une heure avant l&#39;addition de l&#39;α 1 adrénergique phenylephrine dans le bain de tissu et pour générer contraction (figure 1). La figure 2 présente les résultats de la figure 1 modifiées. Les réponses verts ont marqué la contraction maximale atteinte par PE marqué comme max, la contraction maximale ½ marqués comme tels, puis associé à la concentration de PE qui a provoqué cette réponse. L&#39;identification de ces valeurs est l&#39;identification de la concentration efficace d&#39;un agoniste qui réalise une demi-max (50%) ou CE réponse <sub&gt; 50 valeur. Ce est dans cette donegraphically example.Computer logiciel qui utilise des fonctions logistiques pour les courbes sigmoïdes peuvent être utilisés pour l&#39;ajustement des courbes et le calcul des valeurs de CE50. Dans la génération et l&#39;interprétation de ces résultats, il est important d&#39;utiliser à la fois basses et hautes concentrations d&#39;agoniste pour créer la courbe concentration-réponse. Sans suffisamment de points pour afficher une ligne de base stable et le plateau au maximum, 50 CE et E MAX ne peuvent être estimés. Cela a été fait sous forme graphique dans cet exemple. Logiciels qui utilise les fonctions logistiques pour les courbes sigmoïdales peut être utilisé pour l&#39;ajustement de courbe et le calcul des valeurs de CE 50. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" /> Figure 1:. Tissue Bath schématique Cartoon représentant un anneau de tissu placé dans la double paroi, ba de tissus de chemise d&#39;eaue. Buffer entrées et sorties sont réglementées par un robinet en verre à 3 voies intégré dans la base de la chambre. O 2 / CO 2 est mis à barboter à travers un aérateur qui est scellé avec un joint d&#39;étanchéité pour empêcher la fuite de gaz ou PSS. entrée de remise en circulation est inférieure à la sortie pour maintenir la recirculation correcte et empêcher la formation de poches d&#39;air susceptibles d&#39;entraîner un dérèglement de la température. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" /> Figure 2:. Rat aorte thoracique + endothélium La figure ci-dessus montre quatre expériences distinctes (différents animaux et effectuées par différents chercheurs sur différents set up tels que représentés par des couleurs différentes) pour tester la capacité de la prazosine pour décaler une contraction induite par PE. Prazosine (5 nM) induit clairement décalée PE courbe de contraction vers la droite de façon parallèle. Figure 3: Rat aorte thoracique + endothélium de l&#39;estimation graphique des valeurs de CE 50 pour le PE en l&#39;absence (véhicule) et la présence (de prazosine) de l&#39;antagoniste.. Ligne verte (groupe C) ne est marqué. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sel </td><td> MW (g / mole) </td><td> 5 Litres </td><td> FINAL mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> (grammes) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,45 </td><td> 37,99 </td><td> 130 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 1,75 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td> 136,1 </td><td> 0,8 </td><td> 1,18 </td></tr><tr><td> MgSÛ4• 7H20 </td><td> 246,5 </td><td> 1,45 </td><td> 1,17 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,21 </td><td> 6,25 </td><td> 14,9 </td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> 180,16 </td><td> 5 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 380 </td><td> 0,05 </td><td> 0,03 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: physiologique normal de Salt Solution (PSS) Recette Contenu de la PSS de bicarbonate tamponnée utilisée dans cette expérience.. Sont inclus les masses moléculaires de tous les sels et la quantité ajoutée de 5 L de dH 2 O pour obtenir la concentration désirée. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Concentration dans le bain </td><td> Ajout de l&#39;agoniste fait pour salle de bain </td></tr><tr><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 50 ml 1 x 10 -6 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -9 M </td><td> 100 ml 1 x 10-6 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -5 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -8 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -5 </td></tr><tr><td> 1 x 10 -7 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -7 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -6 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -6 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -5 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -4 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -1 M </td></tr></tbody></table> Tableau 2:. Tissue Bath Additif agoniste concentrations Le montant de l&#39;agoniste à ajouter à chaque bain de proconstruire Perly courbes cumulatives concentration-réponse. La concentration désirée du bain est réalisé par addition de quantités successives consistant à augmenter les concentrations de l&#39;agoniste. Chaque addition tient compte de la concentration de l&#39;agoniste déjà présent dans le bain. Ceci est fait pour minimiser l&#39;augmentation de volume dans le bain de tissu qui résulterait de l&#39;utilisation de volumes croissants d&#39;une seule concentration de l&#39;agoniste.

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Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Mesure de la fonction musculaire lisse dans les tissus isolés Bath-applications à la pharmacologie de recherche

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

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Unit 1

Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Adrenergic Agonists and Antagonists Agents

SCIENTISTS IN ACTION

135.8K vues.  Michigan State University. This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition. 

Vidéo: Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

Ca focale 2 + Détection de transitoires dans le muscle lisse

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Recherche

Biologie

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

La préparation de la souris crémaster pour l&#39;imagerie intravitale de la microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Évaluation ex vivo de la contractilité, fatigabilité et isolées du Alternans muscles squelettiques

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Explorer muscle lisse artériel KV7 fonction des canaux potassiques à l&#39;aide d&#39;électrophysiologie patch-clamp et myographie pression

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Mesure de la force lors de la contraction d&#39;évaluer la fonction musculaire en poisson zèbre

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Deux photons imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipulation et production d&#39;oxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse d&#39;un Rat aorte isolée

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l&#39;intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La perfusé Technique du rein de souris isolé

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...