Les cellules musculaires lisses de detrusor forment la paroi de la vessie urinaire qui facilite finalement l’annulation et le stockage d’urine. Notre protocole fournit une méthode validée et fiable pour l’isolement frais des cellules musculaires lisses simples. Les cellules musculaires lisses du détruseur humain fraîchement isolées offrent l’occasion d’examens électrophysiologiques et moléculaires au niveau d’une seule cellule.
En étudiant les cellules musculaires lisses du détruseur unique à partir de vessies urinaires humaines contrôlables, normales et malades, nous avons la possibilité de valider des cibles pharmacologiques telles que les canaux iions. Les cellules musculaires lisses du détruseur humain sont idéales pour des expériences électrophysiologiques telles que l’électrophysiologie patch-clamp. Ici, nous allons présenter un exemple d’étude d’un canal ionique unique nommé TRPM4, récepteur transitoire potentiel mélastatine quatre canaux, qui est un canal de cation non sélectionné.
Les novices peuvent avoir du mal avec la dissection et les étapes de traitement enzymatiques qui exigent l’efficacité et la familiarité comprenant la reconnaissance des étapes importantes critiques pour obtenir les cellules dsm fraîches et isolées. Il est important de se familiariser avec l’histologie de la vessie humaine, les étapes du protocole pour isoler les cellules individuelles restent résilientes, et s’attendent initialement à obtenir des cellules sous-optimales en utilisant ce protocole. Commencez par examiner l’ensemble de l’épaisseur de l’échantillon de vessie urinaire.
Épinglez le spécimen, muqueuse orientée vers le haut et serosa vers le bas sur un plat rond en enantiomer en silicone enduit de 150 mm rempli de DS glacé et retirez soigneusement toute la muqueuse par dissection aiguë. Découpez plusieurs morceaux de muscle lisse ou de DSM sans muqueuse. Placez trois à six morceaux de DSM dans un tube avec un à deux millilitres de DS préchauffé contenant de la papaïne et du dithiothreitol, ou DS-P.
Incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 30 à 45 minutes, en vous assurant de secouer le tube toutes les 10 à 15 minutes. Après l’incubation, retirer le DS-P du tube et laver brièvement les morceaux de DSM avec du DS froid de glace. Transférez le DS avec des morceaux DSM dans un nouveau tube et retirez le DS, en laissant les morceaux DSM au fond du tube. Ajouter un à deux millilitres de DS contenant du collagène de type II, ou DS-C, au tube.
Et l’incuber à 37 degrés Celsius avec des secousses occasionnelles. Jetez le DS-C et lavez les morceaux de DSM traités enzymatique cinq à dix fois avec du DS froid de glace. Après le dernier lavage quitter le DS à l’intérieur du tube, et triturer doucement les morceaux avec une pipette Pasteur polie par le feu pour libérer des cellules DSM unique. Pipette 0,25 à un millilitre de suspension cellulaire sur une chambre inférieure en verre assis sur la scène d’un microscope inversé et l’incuber pendant au moins 45 minutes pour permettre aux cellules d’adhérer.
Ensuite, retirez le DS du bain et remplacez-le par une solution E par superfusion. Tirez plusieurs électrodes de correction, polir le feu les bouts d’électrode, et enrober les bouts dans la cire dentaire si nécessaire. Remplissez le bout d’une électrode patch avec la solution pipette sans amphotericine-B en trempant brièvement l’électrode dans la solution.
Le succès de l’électrophysiologie de pince de correction dépend de la qualité de cellules de DSM et de la solubilization d’amphotericin-B. Remplissez l’électrode avec la même solution pipette contenant de l’amphotericine-B et montez l’électrode sur un support relié à un étage avant de l’amplificateur à pinces patch. Utilisez un micromanipulateur pour placer l’électrode juste sous la surface de la solution extracellulaire de sorte que la pointe de l’électrode soit simplement submergée.
Ensuite, déterminez la résistance à l’électrode à l’aide de la fonction de fenêtre d’essai membranaire du logiciel d’acquisition commerciale et avancez l’électrode vers la cellule d’intérêt. Lorsque vous touchez la surface de la cellule avec l’électrode, former un giga-joint en appliquant une légère pression négative rapide sur l’électrode par tube. Il en résulte une pression négative à l’extrémité de l’électrode résultant en un giga-joint réussi tel que confirmé par le test membranaire.
Laisser 30 à 60 minutes pour que l’amphotericine-B diffuse la pipette et soit insérée dans la membrane plasmatique, formant des pores principalement sélectifs aux cations monovalentes. Continuez à surveiller le giga-joint avec la fonction d’essai de membrane. Lorsque la perforation du patch est optimale, annulez les transitoires de capacitance en ajustant les cadrans pour la capacité cellulaire et la résistance en série sur l’amplificateur.
Une fois que les courants stables de cation de tension-étape sont observés, enregistrez des courants avec le protocole de tension-étape de routage tel que décrit dans le manuscrit. Appliquez un composé ou une condition d’essai physiologique pour tester par superfusion et enregistrer les réponses pour les conditions de contrôle et d’essai ainsi que le lavage. Ce protocole peut être utilisé pour isoler des cellules DSM saines et fraîches pour des études fonctionnelles et moléculaires.
Les cellules DSM simples en bonne santé se caractérisent par une morphologie en forme de fuseau, des bords nets bien définis, un halo bien défini autour de la cellule et une apparence semi-contractile lorsqu’on les regarde au microscope. En outre, les cellules DSM fraîchement isolées répondent à la stimulation mécanique et au carbachol. Les fragments cellulaires et les cellules non viables ou sur-digérées devraient être évités dans les expériences subséquentes de pince à timbres.
Les cellules isolées ont été utilisées dans des expériences perforées d’amphotericine-B où des courants de cellules entières ont été mesurés avec un protocole de tension-étape induite ou de rampe dans trois cellules humaines différentes de DSM. Les expériences ont indiqué que le 9-phenanthrol, un inhibiteur de canal TRPM4, a inhibé efficacement et réversiblement les courants humains de cation de DSM. Le composant courant sensible au 9 phénoménhrol illustre une inhibition plus forte aux tensions positives et à la rectification extérieure.
L’état des étapes enzymatiques de traitement, les étapes 2.2 et 2.3, y compris la température, la durée des traitements enzymatiques, les sources de lot enzymatique et la qualité des cellules de DSM, sont des déterminants clés pour obtenir des cellules humaines de DSM de haute qualité. Les cellules humaines de DSM sont également idéales pour évaluer les niveaux intracellulaires de deuxième messager comprenant l’AMP de calcium et cyclique, la détection des expressions de protéine par immunocytochimie, et la co-expression par l’essai proximal in situ de litige, et l’expression d’ARNm par RT-PCR, qRT-PCR, microréseau, et séquençage de prochaine génération. Les cellules humaines de DSM ont avancé notre compréhension des rôles des canaux BK, calcium, TRPM4 dans la vessie urinaire.
Les développements futurs permettront de relier spécifiquement les propriétés électrophysiologiques ou pharmacologiques aux profils transcriptome ou protéome.
