Name: real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy
Uploaded: 2014-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy at JoVE.com

Wir möchten Ying Yu für Apc Min / + Mäusen Genotypisierung danken. Diese Studie wurde durch Mittel aus INSERM und Zuschüsse (CA057621 und AI053194) von den National Institutes of Health.

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit Verfahren, die von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC), UCSF genehmigt durchgeführt. Alle Abbildungsexperimente waren Nichtlebens Verfahren und die Tiere unmittelbar nach dem Ende der Bildaufnahme getötet. 1. Generierung von Mäusen HINWEIS: APC Min / + Mäusen, die eine Mutation des APC-Gens auf, entwickeln spontan 50-100 Adenomen im Dünndarm. <ol><li> Quer Apc Min / +-Mäusen mit dem ACTB-ECFP Linie, die ECFP unter der Actin-Promotor exprimiert, und ferner mit dem c-fms-EGFP-Linie, die EGFP unter die c-fms-Promotor exprimiert, die myeloiden Zellen zu detektieren. Heterozygote Tiere für ACTB-ECFP und c-fms-EGFP werden verwendet, um Fluoreszenz zu erkennen. </li><li> Verwenden Mäusen bei 3-4 Monate alt sein, um Bild deutlich nachweisbar Adenome. </li></ol> 2. Herstellung von Materialien Vor der Operation HINWEIS: Die Details des Mikroskops Set-up zuvor beschriebenen 6,7 gewesen. <ol><li> Mikroskop <ol><li> Schalten Sie die Heizdecke. Schalten Sie den Argon-Laser für 488 nm-Anregung und der Festkörper 405 nm, 561 nm und 640 nm Laser. Einschalten des Mikroskops, die Spinnplattensteuereinheit, die AOTF, der Lasersteuereinheit und die Kamerasteuerung. </li><li> Öffnen Sie die Verschluss Mikroskop, das die LED rot wird. Schalten Sie den Computer und die Kamera-Software. </li></ol></li><li> Imaging Platform <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Bühne Einsatz sauber ist. Ansonsten sauber mit Wasser und Seife und dann trocknen. </li><li> Nehmen Sie zwei Deckgläser und benutzen Labor Band, um sie auf den Einsatz zu sichern. Platzieren Sie den Einsatz auf der Bühne und reinigen Sie es mit Alkoholtupfer. </li><li> Mit Labor Band, bringen Sie die Heizdecke auf der rechten Seite der Bühne. </li><li> Überprüfen Sie die Integrität der Gummimembran auf der Nase Kegel und ändern Sie es Sie ggf.y. Position und fixieren Sie die Nasenkegel für Isofluran-Narkose Lieferung an das Tier mit Hilfe Gaze und Labor-Band. </li></ol></li><li> Isofluran-Narkose-System <ol><li> Füllen Sie den Tank Isofluran. </li><li> Schalten Sie die Vakuum und passen zu 1,2 L / min. </li><li> Mit destilliertem Wasser auf den Zerstäuber und verbinden Sie den Zerstäuber auf die Isofluran-System. </li><li> Schalten Sie den Sauerstoff-Analysator und verbinden Sie es mit der Isofluran-System. Schalten Sie die Sauerstoffflasche und sicherzustellen, dass die Sauerstoff-Analysator zeigt 100%. Stellen Sie die O 2 Fluss auf 0,2 l / min. </li><li> Schalten Sie den Stickstofftank und den Fluss von 0,8 l / min einzustellen. Stellen Sie sicher, dass die Sauerstoff-Analysator zeigt 21%. </li></ol></li><li> Vorbereitung für Chirurgie Werkzeuge und Plattform <ol><li> Saubere 2 Paar Dissektion Zange und Schere mit Wasser und Seife. </li><li> Schalten Sie die heiße Perle Sterilisator und lassen Sie es erreichen 250 ° C. Sterilisieren Sie die Chirurgie-Tools für 30 sek. Lassen Sie sie abkühlen. </li><li> Legen Sie ein Labor Soaker auf dem OP-Tisch. </li><li> Verwenden Sie eine Styropor-Deckel als Operationsplattform. Decken mit einem Stück Labor Soaker. Bereiten Sie ein zweites Stück Labor Soaker, um nach der Rasur mit der Maus ändern. </li><li> Legen Sie den Nasenkegel mit der Linie der Anästhesie auf der überdachten Styropordeckel, und befestigen Sie es an der Styropor-Deckel (nicht auf dem Labor Soaker) mit Klebeband und mit zwei Nadeln auf beiden Seiten der Nasenkegel, um es an Ort und Stelle zu halten. </li><li> Montieren Sie betadine, Alkoholtupfer, sterile Gaze, Superkleber, Objektträger, Elektrorasierer, und 4 Stück Labor-Band. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Injektionen <ol><li> Unter der Haube, bereiten eine Insulinspritze (28 G x ½) mit 7 ul Lager AF647-Ly-6G konjugierten (Gr1) Antikörper (1 mg / ml) in 100 ul von 2.000 kDa Rhodamin-Dextran (4 mg / ml ) für retroorbitale Injektions. Retro-orbitale Injektion wird in Apc Min / + Mäusen zu empfehlen, da Anämie, die bei diesen Tieren entwickelt macht die Schwanzvenen difficult, um durch die Haut zu erkennen. </li><li> Vorbereiten einer zweiten Insulinspritze mit 1 mg / kg Atropin subkutan (sc) in 150 ul PBS verdünnt Injektion vor der Bilderzeugung, um die Peristaltik des Darms zu dämpfen. </li></ol> 4. Vorbereitung des Darms für Imaging <ol><li> Überprüfen, ob der Anästhesie Linie der Induktionskammer offen ist, und die Leitungen zu den Operationstisch und Mikroskop geschlossen. </li><li> Übertragen Sie das Tier auf die Anästhesie Kammer. Schließen Sie die Anästhesie Kammer und schalten Sie die Isofluran bis 4% (bei ​​21% O 2). </li><li> Wenn die Maus atmet tief und langsam (nach 5-6 min), dann in der chirurgischen Bühne, auf der Flanke und injizieren Sie die Gr1 Antikörper-Lösung und / oder Dextran-Lösung retro-orbital. </li><li> Öffnen Sie die Anästhesie Linie auf die chirurgische Plattform verknüpft. Schließen Sie die Zeile auf die Anästhesie Kammer und bewegen Sie die Maus auf dem Rücken mit der Nase in der Anästhesie Kegel. </li><li> Reduzieren Sie die IsofluranKonzentration von 4% auf 2,5%. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Maus gut durch Kneifen seine Pfotenballen und Testen der Hornhautreflex betäubt. </li><li> Fügen Augenschmier Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Sichern Sie sich die Gliedmaßen der Maus auf die chirurgische Phase durch Zugabe von Lab-Band. </li><li> Entfernen der Haare von der ventralen Oberfläche unter Verwendung eines elektrischen Rasierers. Auch entfernen die Haare von der linken Hintergliedmaße, um das Oximeter vor Akquisition positionieren. Entfernen Sie die Labor Soaker von der Operations Bühne und ersetzen durch einen sauberen, Haar Kontamination zu vermeiden. </li><li> Desinfizieren Sie die Bauchfläche mit Alkoholtupfer und betadine. </li><li> Injizieren Sie die Lösung Atropin (3,2) sc in eine Flanke der Maus. </li><li> Machen Sie eine 1 cm ventralen Mittellinie Schnitt durch die Haut und das Bauchfell mit einer Schere und einer Pinzette. Ziehen Sie vorsichtig 3-4 cm des Darmes und zur Identifizierung eines oder mehrere Tumoren zu Bild. </li><li> Nehmen Sie ein Glas MICRoscope Schieberposition und eine Schleife des Darms auf sie mit einem Tumor an der Spitze. </li><li> Fügen Sie etwas Sekundenkleber auf wenige Stellen entlang der Darm, um es auf den Objektträger zu befestigen. Warten Sie eine Minute, bis der Kleber trocknen. Verwenden Sie eine Markierung, um eine Linie auf der Folie, die auf den Tumor, um seine Lokalisierung mit dem konfokalen erleichtern ziehen. </li></ol> 5. Positionierung der Maus auf die Bühne, und Vorbereitung auf Image Acquisition <ol><li> Entfernen Labor Band von den Gliedern. </li><li> Öffnen Sie die Anästhesie Leitung an den Mikroskoptisch und schließen Sie die man auf die chirurgische Plattform. </li><li> Übertragen Sie die Maus vorsichtig auf den Mikroskoptisch mit seiner Bauchseite nach unten und die Nase in der Nase Kegel. Sichern Sie die Anästhesie Linie mit einigen Labor-Band. </li><li> Re-Positionierung der Maus und / oder die Folie, um den Darm in der Mitte von einem der Cover-schlüpfte Fenster haben. Sanft kleben die Folie mit Labor-Band. </li><li> Befestigen Sie die Oximetermeßfühler links Schenkel der Mausfolgen ihr Herz und Atemfrequenz und arterielle Sauerstoffsättigung. </li><li> Decken Sie die Maus mit der Heizdecke zu Unterkühlung zu vermeiden. </li><li> Verringern der Isoflurankonzentration von 2,5% auf 1-1,5% für die Bildgebung. </li></ol> 6. Übernahme von Images unter Verwendung von Software μManager <ol><li> Erhöhen CSUX Geschwindigkeit zu 2.500 Umdrehungen pro Minute um die Bildqualität in den Konfigurationseinstellungen zu verbessern. </li><li> Verwenden Sie das Ziel im Dropdown-Menü zu 10X 0,5 NA oder 20X 0,75 NA Fluar Linsenobjektiv zu wählen. </li><li> Wählen Sie den Laser von 405 nm Farbe Dropdown-Menü. </li><li> Klicken Sie auf Live-und stellen Sie den Fokus mit dem Mikroskop. </li><li> Klicken Auto zu maximalen und minimalen Pixelintensitäten des Anzeigebilds auf der Basis der extremen Pixelwerte in dem Bild automatisch einzustellen. Ein Histogramm des Anzeigebildes der Pixel-Intensitäten in dem Diagramm im unteren Teil des Hauptfensters dargestellt. </li><li> Stellen Sie die Kamera die Belichtung im Fenster der Systemsteuerung von PiperÄndern der Anzahl von Takten (ein Takt 33,333 ms). </li><li> Wenn das Signal ist zu hell mit der niedrigsten Exposition zu verringern Laserintensität mit dem Mikroskop Steuereinheit. </li><li> Überprüfen Sie die Signalstärke für 488 nm, 561 nm und 640 nm Laserlinien. Passen Laserintensität mit dem Laser die eigene Steuereinheit (488 nm und 561 nm) oder dem Mikroskop Steuereinheit. </li><li> Im Multi-D Aufnahmefenster, überprüfen Sie die Zeitpunkte Feld und geben in der Anzahl der Zeitpunkte und der gewünschten Zeitintervall. </li><li> Überprüfen Sie die Z-Stapel Fenster wählen &quot;relative Z&quot; definieren und Z-Start Z-End relativ zur aktuellen Position. HINWEIS: 10X oder 20X Ziel, mit Z-Ebenen 3, 8 um oder 4 um jeweils beginnen auseinander. </li><li> Überprüfen Sie die Multiple-Positionen (XY) Feld zur Abbildung mehrere Standorte, klicken Sie dann auf Positionsliste bearbeiten, markieren Sie 4 bis 6 verschiedenen Positionen. </li><li> Überprüfen Sie die Kanäle Box und fügen Kanäle aus und wählen Sie Neue Laser Zeilen aus dem Dropdown-Menü und type Exposition für jeden Kanal (in Vielfachen von 33,333 ms). </li><li> Überprüfen Sie Bilder speichern im Fenster &quot;Multi D Erwerb&quot;. </li><li> Wählen Sie einen Ordner und alle aufgenommenen Bilder werden automatisch in diesem Ordner mit dem Namen Präfix gegeben gespeichert werden. HINWEIS: Jede kontinuierliche Erfassung wird in einem separaten Unterordner als einzelne TIFF-Dateien für jede Z-Schnitt in jeder Farbe zu jedem Zeitpunkt gespeichert werden. </li><li> Speichern Sie alle Einstellungen durch Klicken auf Einstellungen speichern in der Multi D Aufnahmefenster. </li><li> Klicken Sie erwerben in der Multi-dimensionale Aufnahmefenster zum Start der Erfassung. </li><li> Wenn das Oximeter-Sonde nicht verwendet wird oder nicht mehr funktioniert gut (wenn der Impuls nicht stabil ist oder schwer zu erkennen), überprüfen die Effizienz der Anästhesie alle 15 Minuten während des Sicherungsvorgangs durch Kneifen der Fußballen und die Kontrolle der Hornhautreflex. Passen Sie die Narkose, wenn die Maus reagiert auf diese Reize. </li><li> Nach der Übernahme, einschläfern die Maus durch die Erhöhung der Isofluran concentRation bis 5%. Wenn keine Atembewegungen erkennbar sind, entfernen Sie die Maus von der Bühne und führen Sie einen Genickbruch. </li></ol> 7. Analyse der Bilder mithilfe von Software Imaris <ol><li> Konvertierung von Dateien (Ergänzende 1A) .ims <ol><li> Öffnen Sie die Kamera-Software, klicken Sie auf Datei und anschließend Batch Converter. </li><li> Klicken Sie auf Dateien hinzufügen, und wählen Sie die erste Datei von der ersten Position. Wiederholen Sie für jede Position. </li><li> Für jede Datei hochgeladen, klicken Sie auf Einstellungen, und überprüfen Sie, dass die Einstellungen &quot;t&quot; für Time, &quot;c&quot; für die Kanäle und &quot;z&quot; für Z-Stapel werden in dieser Reihenfolge. </li><li> Außer in den gewünschten Ordner. Durchsuchen und erstellen Sie eine neue Datei als umgewandelt. </li><li> Klicken Sie auf Set für alle und starten. </li></ol></li><li> Anpassungen (Ergänzende Abbildung 1B) <ol><li> Gehen Sie in die spezifischen Konvertierte Ordner und öffnen Sie die erste Datei. </li><li> Im Display-Einstellung Fensters die HintergrundSignalabschaltung durch Änderung der Mindestzahl für jeden Kanal, wenn nötig. </li><li> Falls erforderlich, die Signalintensität anpassen, indem Sie die maximale Anzahl (je niedriger die Max Zahl, desto höher die Intensität des Signals). HINWEIS: Anpassungen der Signalintensität / Kontrast ermöglichen den Höhepunkt einer Zellverhalten oder einem Fach, um ein schöneres Visualisierung haben. Es ist nicht das Ergebnis selbst zu ändern. </li><li> Klicken Sie auf Bearbeiten und Image-Eigenschaften. </li><li> Ändern der x, y und z-Werte (für einen 10X-Objektiv, x und y = 0,712, z = 8 um, für eine 20x-Objektiv: x und y = 0,36, z = 4 um). </li><li> Klicken Sie auf Alle Equidistant zu Zeitpunkten anzupassen. Fügen Sie das Startdatum und die Startzeit der Akquisition. Fügen Sie das Enddatum und die Endzeit der Akquisition (Ergänzende 1C). </li><li> Klicken Sie auf Play-Taste, um den Film zu sehen. </li><li> Klicken Sie auf Bearbeiten und Löschen Zeitpunkten, um unscharfe Bilder zu löschen. </li><li> Zwei separate Akquisitionen toge beitretenther zu einem Film, gehen Sie zum letzten Zeitpunkt des ersten Films und klicken Sie auf Bearbeiten&gt; In Zeitpunkten, um die zweite Datei hinzufügen. </li></ol></li><li> Speichern als Film (Ergänzende 1D) <ol><li> Klicken Sie auf Aufnahme, wählen Sie die MOV-Erweiterung und ein Kompressionsfaktor von 0. </li><li> Klicken Sie auf Speichern. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In diesem Beitrag wird ein detailliertes Protokoll für die drehende Scheibe konfokale Bildgebung von myeloiden Zelldynamik im Darmtumoren für mehrere Stunden in einem lebenden Tier, von der Serosa-Seite des Darm abgebildet beschrieben. Um Entzündungen zu verhindern und eine optimale physiologische Bedingungen, Bildgebung des Darms hat auf die intakte Organ erfolgen. Allerdings ist aus der Abbildungs ​​Serosaseite Darm herausfordernd, da das Licht durch verschiedene Gewebeschichten, wi...

Überwältigenden Beweis zeigt nun, daß der Tumor-Mikroumgebung, die aus heterogenen Zellpopulationen, einschließlich Fibroblasten, Endothelzellen, Immun-und Entzündungszellen, extrazelluläre Matrix und lösliche Faktoren spielt eine entscheidende Rolle bei der Initiierung und Progression von soliden Tumoren, indem sie zu fast Kennzeichen von Krebs 1. Tatsächlich, während der Tumorprogression gibt es konstante dynamische Wechselwirkungen zwischen transformierten Krebszellen und Stromazellen, die eine Mikro günstig Malignität 2 erzeugen entwickeln. Zu den Immunzellen, die das Tumor-Mikroumgebung zu infiltrieren sind myeloischen Zellen die am häufigsten vorkommende 3. Bestehend aus Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM), myeloische abgeleitete Suppressorzellen (MDSC), dendritische Zellen (DC) und Neutrophilen (PMN), werden Knochenmarkzellen aus Knochenmark gewonnen und fortschreitend zu infiltrieren Tumoren, Freisetzung von Zytokinen, Wachstumsfaktoren und Proteasen, fördern könnenTumorwachstum und zu verbreiten 4. Das Übersprechen zwischen den Krebszellen und myeloischen Zellen ist komplex, sondern dynamisch. Somit ist das Verständnis der Natur der Wechselwirkungen entscheidend für die Bestimmung, warum diese Zellen fördern Krebsentwicklung statt, die an einer Anti-Tumor-Immunantwort, und kann dazu beitragen, neue Ziele zu kontrollieren finden. Direkte Beobachtung durch Intravitalmikroskopie liefert Informationen über Zelldynamik in den Geweben von lebenden Mäusen 5. Ein Vierfarben-, Mehrbereich, Mikrolinsen-Spinnplatte konfokales System wurde entwickelt, um Stromazellen in Brusttumoren 6 zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht die langfristige, kontinuierliche Bildgebung und umfasst mehrere Vorteile, wie (a) schnelle Bilderfassung, um Bewegungsartefakte zu minimieren, (b) langfristige Anästhesie, (c) vier Farberfassung auf verschiedenen Zelltypen zu folgen, (d) Fluoreszenzmarkierung verschiedener Tumorkomponenten, und (e) Beobachtung verschiedener Tumormikroumgebung witHin die gleiche Maus Maus Maus Variabilität 7-9 zu vermeiden. Mit dieser Technik wurden verschiedene Zellverhalten in dem Brusttumor-Virus (MMTV)-Promotor angetrieben Polyoma mittleren T-Onkogen (PyMT) Modell, das schrittweise von Tumorgenese zeigt gemeldet. Regulatorische T-Lymphozyten (Treg, von der Foxp3 EGFP-Transgens sichtbar) wandern bevorzugt in der Nähe der Blutgefäße in der Erwägung, DC (CD11c-DTR-EGFP), Karzinom-assoziierte Fibroblasten (Fsp1 + / + -EGFP) und myeloischen Zellen (c-fms -EGFP) weisen höhere Beweglichkeit in der Tumorperipherie als innerhalb der Tumormasse. Im Zustand der akuten systemischen Hypoxie, wanderten Zellen anders: Tregs stoppen Migration im Gegensatz zu myeloischen Zellen, die sich zu bewegen 6 fort. Zusätzlich wird in der gleichen Mausmodell wurde gezeigt, dass Doxorubicin Empfindlichkeitsänderungen mit Tumorstadium wird Arzneimittelverteilung Arzneimittelantwort und Doxorubicin bezogenenBehandlung führt zu CCR2-abhängigen Rekrutierung von myeloischen Zellen zu Tumoren. So können Live-Bildgebung auch verwendet, um Einblicke in die Arzneimittelreaktionen in situ und die Biologie der Chemoresistenz 10,11 zu gewinnen. Adenomatöse Polyposis coli (APC)-Gen-Mutationen treten häufig in menschlichen kolorektalen Adenomen und Karzinomen 12 und Mutation eines einzelnen Kopie des Gens Ergebnisse von APC im familiären adenomatösen Polyposis (FAP), die ein extrem hohes Risiko für Darmkrebs 13 verleiht. Der Maus-Stamm Apc Min / + trägt eine Trunkierungsmutation an Codon 850 des APC-Gens und entwickelt spontan mehreren intestinalen Adenomen ganzen Dünndarm 14-16. Langfristige intravitalen Bildgebung des Darms ist schwierig, weil der Invasivität des Verfahrens, da das Öffnen der Bauchhöhle, die für den Zugriff auf den Darm. Kurzfristige Live-Bildgebung studies wurden zuvor an gesunden Darm 17,18 veröffentlicht, aber die langfristige direkte Beobachtung von Darmtumoren wurde nicht berichtet. Ein chirurgisches Verfahren wurde entwickelt und verfeinert, um Tumore über die serösen Oberfläche des Darms sichtbar zu machen, mit der sich drehenden Scheibe Intravitalmikroskopie System vorher auf Bild Brusttumoren 6,10 verwendet. In diesem Beitrag wird ein Protokoll beschrieben, das eine um das Verhalten von myeloischen Zellen in den Tumoren im Dünndarm unter Verwendung von Apc Min / +-Mäusen folgen können.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Apc&lt;sup&gt;Min/+&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt; mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>ACTB-ECFP mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>3773</td><td></td></tr><tr><td>cfms-EGFP mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated</td><td>Invitrogen</td><td>D7139</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>29450</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>UCSF cell culture facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline Buffer</td><td>UCSF cell culture facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647</td><td>UCSF Monoclonal antibody core</td><td></td><td>Stock 1 mg/ml. Use at 7 &amp;mu;g/mouse</td></tr><tr><td>Atropine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td>Use at 1 mg/kg mouse</td></tr><tr><td>Alcohol wipes</td><td>Becton Dickinson</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>28 G x 1/2 in. insulin syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>329465</td><td></td></tr><tr><td>Remium cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td>24x50-1</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat blanket</td><td>Gaymar Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hot bead sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td>Turn ON 30 min before use</td></tr><tr><td>Cotton tipped apllicators 6-inch</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72310-10</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia system</td><td>Summit Anesthesia Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Zeiss Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Stage insert</td><td>Applied Sientific Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ox oximeter, software and sensors</td><td>Starr Life Sciences</td><td>MouseOx</td><td></td></tr><tr><td>Nebulizer</td><td>Summit Anesthesia Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;Manager</td><td>Vale lab, UCSF</td><td></td><td>Open-source software</td></tr><tr><td>ICCD camera</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR-Mega-10EX S-30</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk confocal sacan-head</td><td>Yokogawa Corporation</td><td>CSU-10b</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy

Myeloide Zellen sind die am häufigsten vorkommenden Immunzellen in Tumoren und haben gezeigt, dass Tumorprogression zu fördern. Moderne bildgebende Verfahren ermöglichen Intravital die Beobachtung von lebenden Zellverhalten im Inneren der Orgel, sondern kann eine Herausforderung in einigen Arten von Krebs durch Orgel und Tumor Zugänglichkeit sein wie Darm. Die direkte Beobachtung von Darmtumoren wurde bisher nicht berichtet worden. Eine hier beschriebene chirurgische Verfahren ermöglicht die direkte Beobachtung der myeloischen Zelldynamik in den Darmtumoren in lebenden Mäusen mit Hilfe transgener Mäuse fluoreszierenden Reporter und injizierbare Tracer oder Antikörper. Zu diesem Zweck wird ein Vier-Farben-, Multi-Region, Mikrolinsen-Spinning-Disk konfokalen Mikroskop, die langfristige, kontinuierliche Bildgebung mit schneller Bildaufnahme ermöglicht wurde verwendet. Apc Min / + Mäusen, die mehrere Adenome im Dünndarm zu entwickeln sind gekreuzt mit c-fms-EGFP Mäuse myeloischen Zellen visualisieren und mit ACTB-ECFP Mäuseauf intestinalen Epithelzellen der Krypten zu visualisieren. Verfahren zur Markierung von verschiedenen Tumorkomponenten, wie Blutgefäße und Neutrophilen, und das Verfahren zum Positionieren des Tumors für die Bildgebung durch die Serosa-Oberfläche werden ebenfalls beschrieben. Zeitraffer-Filme von mehreren Stunden von bildgebenden zusammengestellt ermöglichen die Analyse von myeloischen Zellverhalten in situ in der Darmmikroumgebung.

Durch die Verwendung von Spinnplatten konfokale Mikroskopie, nicht tumorale und Tumorgewebe im Dünndarm von Apc Min / +; ACTB-ECFP, c-fms-ECFP Mäuse aus der Serosa-Oberfläche dargestellt werden. Nach der Abbildung ist der Kamera-Software zur Analyse und Anpassung der Akquisition (Ergänzende Abbildung 1). Nach intravenöser (iv) Injektion von fluoreszierenden 2.000 kDa Dextran-Rhodamin und Ly-6G 647 konjugierte Antikörper, Blutgefäße und PMN kann detektiert werden <str...

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Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

9.6K Aufrufe.  INSERM U661, Functional Genomic Institute. By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model. 

Serie: Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the tumor microenvironment and respond adequately to tumor antigens. The recent development of improved imaging approaches, such as 2-photon microscopy, and the use of powerful mouse tumor models have shed light on some of the mechanisms that regulate anti-tumor T cell activities. Whereas such systems have provided valuable insights, they do not always predict human responses. In human, our knowledge in the field mainly comes from a description of fixed tumor samples from human patients, as well as in vitro studies. However, in vitro models lack the complex three-dimensional tumor milieu and, therefore, are incomplete approximations of in vivo T cell activities. Fresh slices made from explanted tissue represent a complex multi-cellular tumor environment that can act as an important link between co-cultured studies and animal models. Originally set up in murine lymph nodes1 and previously described in a JoVE article2, this approach has now been transposed to human tumors to examine the dynamics of both plated3&#160;as well as resident&#160;T cells4.
Here, a protocol for the preparation of human lung tumor slices, immunostaining of resident CD8 T and tumor cells, and tracking of CD8 T lymphocytes within the tumor microenvironment using confocal microscopy is described. This system is uniquely placed to screen for novel immunotherapy agents favoring T cell migration in tumors.

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

This protocol describes a method to image resident tumor-infiltrating CD8 T cells labeled with fluorescently coupled antibodies within human lung tumor slices. This technique permits real-time analyses of CD8 T cell migration using confocal microscopy.

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Forschung

Krebsforschung

Bildgebung der Bauchspeicheldrüse der Maus mit implantiertem stabilisiertem Fenster

Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have high morbidity and mortality. Intravital imaging (IVI) is a powerful technique enabling the high-resolution imaging of tissues in both healthy and diseased states, allowing for real-time observation of cell dynamics. IVI of the murine pancreas presents significant challenges due to the deep visceral and compliant nature of the organ, which make it highly prone to damage and motion artifacts. 
Described here is the process of implantation of the Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP). The SWIP allows IVI of the murine pancreas in normal healthy states, during the transformation from the healthy pancreas to acute pancreatitis induced by cerulein, and in malignant states such as pancreatic tumors. In conjunction with genetically labeled cells or the administration of fluorescent dyes, the SWIP enables the measurement of single-cell and subcellular dynamics (including single-cell and collective migration) as well as serial imaging of the same region of interest over multiple days. 
The ability to capture tumor cell migration is of particular importance as the primary cause of cancer-related mortality in PDAC is the overwhelming metastatic burden. Understanding the physiological dynamics of metastasis in PDAC is a critical unmet need and crucial for improving patient prognosis. Overall, the SWIP provides improved imaging stability and expands the application of IVI in the healthy pancreas and malignant pancreas diseases.

Autor im Rampenlicht: Revolutionierung des Verständnisses von Pankreaserkrankungen durch fortschrittliche intravitale Bildgebung 

We present a protocol for the surgical implantation of a stabilized indwelling optical window for subcellular-resolution imaging of the murine pancreas, allowing serial and longitudinal studies of the healthy and diseased pancreas.

Stabilisiertes Fenster für die intravitale Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Immunologie und Infektion

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Medizin

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Intravitalen Mikroskopie von Tumor-assoziierten Gefäßsystem mit erweiterten dorsalen Hautfalte Fenster Kammern an transgenen Mäusen fluoreszierende

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

Stabilisiertes Fenster für die intravitale Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse

Stabilisiertes Fenster für die intravitale Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse

Stabilisiertes Fenster für die intravitale Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Intravitalen Mikroskopie von Tumor-assoziierten Gefäßsystem mit erweiterten dorsalen Hautfalte Fenster Kammern an transgenen Mäusen fluoreszierende

Intravitale Bildgebung von intraepitheliale Lymphozyten im murinen Dünndarm