We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.

NOTE: Toutes les expériences ont été approuvés par l&#39;Université du comité d&#39;éthique le soin des animaux d&#39;Ottawa, en respectant les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux. Préparation 1. Pré-chirurgical et Matériaux <ol><li> Plasmide Préparation: <ol><li> Préparation des plasmides en utilisant le Qiagen Megaprep selon le protocole du fabricant. Inoculer au moins 400 ml de bouillon LB avec des bactéries transformées pour assurer un rendement élevé d&#39;ADN et incuber pendant une nuit. </li><li> Remettre en suspension dans le plasmide de 100 à 200 ul de TE jusqu&#39;à une concentration finale d&#39;au moins 5 ug / ul. ADN Aliquoter et conserver à -20 ° C. Si la concentration est trop faible, ne pas précipiter et remettre en suspension comme cela peut ajouter impuretés. Recommencer avec une nouvelle préparation. </li><li> Avant la chirurgie, diluer un seul plasmide (Cre-GFP par exemple) à 2 ug / ul dans de l&#39;eau stérile avec 1 ul de 0,1% (p / v) colorant vert Fast-10 ou par 20 pi de solution de plasmide dilué. Si GFPet le gène d&#39;intérêt sont à co-électroporation sur des plasmides séparés, injecter le plasmide GFP et le plasmide portant le gène d&#39;intérêt à un ratio de 1: 4 à maximiser la probabilité que toutes les cellules marquées à la GFP sont co-électroporation à la fois plasmides. </li></ol></li><li> Tirez tubes microcapillaires de verre (diamètre extérieur de 1 mm - ci-après dénommé aiguilles) sur un extracteur de aiguille standard, en utilisant une seule étape de traction à 62 ° C. </li><li> Autoclave un pack contenant les chirurgicale suivante: porte-aiguilles, écarteur de plaie, pinces, ciseaux pour la chirurgie, ciseaux pour aiguilles, agrafeuse, agrafes, de la gaze, des couvertures de plaies, champs opératoires (figure 1A, B; Tableau Matériaux). </li><li> Recueillir d&#39;autres outils nécessaires: électroporateur, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 ou 7 mm), une solution saline, suture, 5 ml seringue (Tableau Matériaux). </li></ol> 2. Préparer la souris pour la chirurgie <ol><li> Pour la gestion de la douleur, injecter un p-chronométrérégnante souris avec la buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) une heure avant la chirurgie. Appliquer ce protocole à des souris chronométrés ne importe où de jour embryonnaire 12,5 (E12.5) E17.5 à. </li><li> Utilisez microloader embouts de pipette pour sauvegarder charge tiré aiguilles avec la solution de plasmide. Ne remplissez pas tout le chemin dans la pointe de l&#39;aiguille encore car cela provoquerait l&#39;aiguille à se obstruer. </li><li> Anesthésier la souris en utilisant 2-5% de gaz isoflurane avec 1 L / min O 2. Une fois immobile, placer dans masque et appliquer une pommade pour les yeux pour éviter le dessèchement. Injecter avec 1 ml de solution saline (NaCl 0,9%) sous-cutanée dans le dos. REMARQUE: Lorsque vous travaillez avec le gaz isoflurane, utiliser un piégeur de gaz pour reprendre le gaz en excès et l&#39;empêcher de se échapper dans la pièce. </li><li> Rasez abdomen. Laver abdomen avec Chlorohexadine gommage, rincer à l&#39;eau, et appliquer une solution de préparation finale de chlorohexadine et 70% d&#39;éthanol. Couverture souris avec drap stérile ou de gaze pour couvrir la fourrure, tout en laissant exposée abdomen (figure 1C, D). </li></ol>In utero électroporation <ol><li> Faire une incision dans la peau sur l&#39;abdomen entre les tétines inférieurs. Tirez la peau loin de la couche de muscle sous-jacent en déchirant le tissu conjonctif, puis couper à travers le péritoine dans la cavité abdominale le long de la ligne blanche. Insérez l&#39;écarteur de plaie de tirer les bords de la plaie de l&#39;autre. </li><li> Enlever l&#39;utérus de la cavité abdominale et l&#39;étendre comme illustré (Figure 1E). <ol><li> Si différents chiots doivent être injectés avec différents plasmides (telles que GFP vs GFP avec le gène d&#39;intérêt), compter les petits de chaque côté et décider lesquels et combien d&#39;injecter avec chaque plasmide. Remplacer un côté de l&#39;utérus dans l&#39;abdomen de conserver les embryons tiède et lubrifié. Immédiatement humidifier l&#39;utérus exposé avec une solution saline (de préférence chauffé à la température du corps). </li><li> Si l&#39;injection de tous les petits avec le même plasmide (comme lors de l&#39;injection Cre-GFP dans des embryons transgéniques) ONLy retirer une corne de l&#39;utérus à la fois. </li></ol></li><li> Mettez une aiguille chargée dans la tête de préhension de la baguette d&#39;injection et soigneusement couper la pointe avec une paire de petits ciseaux chirurgicaux ou pinces fines. Couper l&#39;extrémité sorte que l&#39;aiguille reste le plus longtemps possible tout en permettant au fluide de passer à travers (Figure 1Ji-iv). <ol><li> Ajuster la longueur de l&#39;injection (en secondes) et la pression d&#39;injection sur le micro-injecteur de sorte qu&#39;une petite goutte encore bien visible de de 0,1 à 0,2 pi apparaît sur la pointe de l&#39;aiguille lorsque la palette de pied est pressé. Gardez le volume de cette goutte aussi cohérentes que possible entre les différentes aiguilles. REMARQUE: cette étape est cruciale pour la survie de l&#39;embryon (voir la discussion). </li><li> Utilisez les paramètres d&#39;injection suivantes pour la FemtoJet: injecter la pression (pi) = 250-300 hPa; temps d&#39;injection (ti) = 0,8-1,2 sec; pression de compensation = 10-50 hPa. Si nécessaire, ajuster ces paramètres pour accueillir la variation entre les aiguilles. </li></ol></li><li> Sélire un embryon et positionner doucement sur ​​le dos, la tête inclinée vers le haut (figure 1F). NOTE: Cela peut nécessiter de tourner ou de déplacer l&#39;embryon; attention à ne pas appliquer trop de pression et d&#39;éviter la rupture du sac amniotique lors de la manipulation de l&#39;embryon. </li><li> Une fois que l&#39;embryon est en place, recherchez le ventricule, qui présente comme une ombre en forme de croissant parallèlement à la sinus longitudinal. Touchez la pointe de l&#39;aiguille dans l&#39;utérus au-dessus du ventricule à un léger angle et de guider l&#39;aiguille à travers la paroi utérine. La quantité de pression requise dépend de la finesse de l&#39;aiguille. Poussez l&#39;aiguille à travers le cortex dans le ventricule. REMARQUE: Bien qu&#39;il y ait rarement une résistance détectable supplémentaire, la tête de l&#39;embryon est souvent repoussé légèrement puis recule que l&#39;aiguille traverse le cortex dans le ventricule. </li><li> Pomper le paddle pieds pour injecter la solution de plasmide. Continuez à pomper jusqu&#39;à ce qu&#39;un espace vert est visible et est conforme à laforme d&#39;arc du ventricule (figure 1G). Chez les jeunes embryons (E12.5 à E14.5) le colorant sera souvent diffuser dans le ventricule controlatéral. NOTE: Le nombre de pompes est fonction du diamètre de la pointe d&#39;aiguille, l&#39;âge de l&#39;embryon (taille et résultant du ventricule) et le volume d&#39;injection souhaitée. Gardez le volume injecté aussi cohérentes que possible entre les embryons. </li><li> Injecter trois ou quatre embryons. Conservez tous les embryons exposés humides avec une solution saline long de la procédure. </li><li> Retour aux premiers embryons injectés et placer les palettes de telle sorte que l&#39;électrode positive tirera le plasmide dans la région désirée du cerveau (figure 1H). Angle de l&#39;électrode négative de sorte que le chemin le plus court entre les électrodes passe directement à travers la structure ciblée pour l&#39;électroporation (figure 2). </li><li> Une fois que les palettes sont en place, appliquer le choc. Selon l&#39;âge et la taille des embryons, utiliser cinq impulsions de 35 à 50 V (voir Tmesure 1). Utilisez les paramètres d&#39;électroporation suivants: durée de l&#39;impulsion de 5 ms avec un intervalle de 950 ms d&#39;impulsion. Répéter l&#39;opération avec tous les embryons injectés. </li><li> Couper l&#39;extrémité de la nouvelle aiguille de pré-chargée comme dans l&#39;étape 3.3 comme la dernière aiguille susceptibles séché et obstrué lors de l&#39;étape 3.9. Injecter la prochaine série de trois ou quatre embryons avec soit le même plasmide ou un plasmide différent et puis appliquer le choc comme dans l&#39;étape 3.9. Lorsque tous les chiots dans un côté de l&#39;utérus sont injectés, retirez le deuxième côté de l&#39;utérus de l&#39;abdomen de la femelle et puis remplacez le côté rempli à garder au chaud. </li><li> Retour des deux côtés de l&#39;utérus à la femelle en faisant attention de garder la surface humide avec une solution saline et de ne pas appliquer trop de pression pour éviter le traumatisme des sacs amniotiques. Suturer la couche musculaire fermé en utilisant un point simple et continu. Staple la peau fermé. Si les agrafes ne sont pas disponibles, suturer la peau avec un point interrompu simple. (Figure 1I) </li><li> Alors que suturing, tourner progressivement jusqu&#39;à l&#39;isoflurane pour permettre l&#39;anesthésie de la femme enceinte pour éclaircir. NOTE: Ce sera d&#39;accélérer l&#39;excitation du barrage après la chirurgie est terminée; garder la femelle anesthésié pour une durée aussi courte que possible permettra d&#39;améliorer la survie de l&#39;embryon. Temps de la chirurgie totale, à partir de quand la femelle est d&#39;abord anesthésié, doit être d&#39;environ 30 min. </li></ol> 4. Entretien <ol><li> Placez la femelle suturé dans un incubateur ou sur un coussin chauffant pour remettre de l&#39;anesthésie. Son lit sur la literie propre et placer un gel de récupération standard dans la cage à maintenir l&#39;hydratation. Pour la gestion de la douleur après la chirurgie, donner les trois femmes doses de buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) à des intervalles de 8 h après la chirurgie, puis quatre doses supplémentaires à intervalles de 12 h. </li></ol> 5. Brains de récolte NOTE: Brains peuvent être récoltées à tout âge jusqu&#39;à l&#39;âge adulte. Ce qui suit se appliquepour la collecte cerveaux avant la naissance. Notez qu&#39;une fois chiots sont nés, l&#39;ordre dans l&#39;utérus est perdu, donc soit chaque chiot dans la litière doit être injecté avec le même plasmide, ou une autre méthode de différencier entre le contrôle et les animaux de laboratoire doit être conçu. <ol><li> Préparer froid (4 ° C), on filtre 4% de paraformaldehyde (PFA) avant l&#39;euthanasie femelle. </li><li> Euthanasier la femelle en utilisant une injection intraperitoneale d&#39;une dose létale de pentobarbital de sodium (100 mg / kg de poids corporel) et couper abdomen ouvert. Tirez sur les deux côtés de l&#39;utérus et de jeter départ comme à chiots ont d&#39;abord été injectés. <ol><li> Dans le cas où tous les chiots ont reçu le même plasmide, comme lors de l&#39;injection Cre dans une litière transgénique, afin d&#39;embryons ne est pas important, donc coupé l&#39;utérus de la femme et sa place dans PBS. </li><li> Si les chiots ont été injectés avec des plasmides différents, veillez à placer chaque chiot, en notant les petits morts, et de déterminer quels sont ceux qui ont été injectés avec le contrôle et expériplasmides Tal avant de retirer l&#39;utérus de la femelle. Soyez prudent de garder une trace des chiot appartient à quel groupe après l&#39;utérus est en PBS. </li></ol></li><li> Retirez chaque chiot individuellement, décapiter avec des ciseaux pointus ou une lame de rasoir et placez la tête dans du PBS. Dans le cas des souris transgéniques, prélever des échantillons de tissus pour le génotypage et de garder chaque tête séparée, comme dans une plaque de 12 puits. </li><li> Sous un microscope à dissection, retirez le cerveau du crâne, en faisant attention de ne pas entailler le cortex ou déchirer la ligne médiane. En utilisant un microscope à fluorescence, vérifier pour voir si cerveaux ont une GFP + patch, ce qui indique qu&#39;ils ont été électroporées avec succès. </li><li> Fixer cerveau par immersion dans PFA à 4 ° C jusqu&#39;au lendemain. REMARQUE: Vérifiez cerveaux pour l&#39;expression de la GFP avant la fixation depuis PFA désaltère souvent le signal. </li><li> Cryoprotect cerveau par immersion dans 20% de saccharose pendant au moins trois jours avant la congélation. Utiliser un gradient de saccharose de 10%, 15% et 20% (24 h dans chaque solution) to éviter d&#39;endommager les tissus en raison de la pression osmotique. Rangez cerveaux congelés à -80 ° C et couper sur un cryostat à 10-14 um sections épaisses. </li></ol> 6. Co-coloration anti-GFP REMARQUE: si la récupération de l&#39;antigène est nécessaire de co-tache avec des anticorps anti-GFP, il est important d&#39;utiliser un protocole de récupération antigène doux qui ne compromet pas le signal de la GFP. Certains protocoles de recherche d&#39;antigène sont trop dures à utiliser en conjonction avec la GFP coloration (même avec un anticorps contre GFP). Un acide citrique de base pré-traitement avant l&#39;application de l&#39;anticorps primaire est couronnée de succès pour la plupart des epitopes 24. <ol><li> Préparer une solution 0,01 M d&#39;acide citrique dans ddH 2 O. pH 6 à l&#39;aide d&#39;un pH-mètre étalonné. </li><li> La chaleur de l&#39;acide citrique dans la chambre à micro-ondes ou coloration bain d&#39;eau jusqu&#39;à ce que l&#39;acide citrique atteint 75 à 80 ° C. Mettez les diapositives dans la chambre coloration pendant 10-15 min. Maintenir la température la plus stable possible. </li><li> Laver les lames dans du PBS3x pendant 3 min à température ambiante. Appliquer l&#39;anticorps primaire et procéder à immunocoloration selon un protocole standard. </li><li> Validate excision médiée par Cre par co-marquage pour la GFP et le gène d&#39;intérêt afin de confirmer abattre (figure 3A). </li></ol>

<ol>
	<li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+controlling+the+sequential+steps+of+cortical+projection+neuron+migration.">Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).</li><li>Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mechanisms+of+oriented+neuronal+migration+in+the+developing+brain.">Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+neuronal+migration.">The dynamics of neuronal migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 25-36 (2014).</li><li>McClellan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+requirement+for+Rb/E2F3+in+neuronal+migration:+evidence+for+cell+cycle-independent+functions.">Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).</li><li>Nguyen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P27kip1+Independently+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Migration+in+the+Cerebral+Cortex.">P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex.</a> Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).</li><li>Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pocket+proteins+pRb+and+p107+are+required+for+cortical+lamination+independent+of+apoptosis.">Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis.</a> Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).</li><li>Hashimoto-Torii, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Reelin+and+Notch+signaling+regulates+neuronal+migration+in+the+cerebral+cortex.">Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex.</a> Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+defects+in+the+Loa+dynein+mutant+mouse.">Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li><li>Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli3+is+required+for+maintenance+and+fate+specification+of+cortical+progenitors.">Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors.</a> J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).</li><li>Heng, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin+2+controls+cortical+neuron+migration+through+regulation+of+Rnd2.">Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2.</a> Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).</li><li>Alfano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COUP-TFI+promotes+radial+migration+and+proper+morphology+of+callosal+projection+neurons+by+repressing+Rnd2+expression.">COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression.</a> Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).</li><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system:+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery.">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+into+multiple+CNS+territories+using+in+utero+electroporation.">Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development.">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).</li><li>Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+exogenous+LIN28+contributes+to+proliferation+and+survival+of+mouse+primary+cortical+neurons+in+vitro.">Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro.</a> Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons.">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system.">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li><li>Miyagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sox-2+regulatory+regions+display+their+activities+in+two+distinct+types+of+multipotent+stem+cells.">The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 .</li><li>Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+promoter+analysis+in+developing+mouse+brain+and+genetic+labeling+of+young+neurons+by+doublecortin-DsRed-express.">Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express.</a> J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=targeting+in+mice:+a+review.">targeting in mice: a review.</a> Methods Mol. Biol. 1064, 315-336 (2013).</li><li>Ferguson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-autonomous+requirement+for+the+cell+cycle+regulatory+protein,+Rb,+in+neuronal+migration.">A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration.</a> EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).</li><li>Lagace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+contribution+of+nestin-expressing+stem+cells+to+adult+neurogenesis.">Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis.</a> J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).</li><li>Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+is+essential+for+survival+of+postmitotic+neurons.">The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons.</a> J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).</li><li>Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+E2F-1+mediates+the+autoregulation+of+RB+gene+expression.">The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 .</li><li>Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Deux des principaux défis dans l&#39;exécution de électroporations in utero sont 1) la prévention embryocides et 2) en diminuant la variabilité entre électroporations. Un des facteurs les plus importants dans la prévention de létalité est la qualité de l&#39;aiguille, comme aiguilles émoussées infligent plus de dommages à l&#39;embryon. Lors de la coupe de l&#39;aiguille, gardez la pointe le plus longtemps possible tout en permettant une gouttelette visible de 0,1 à 0,2 pi de fluide à ap...

La migration radiale est un processus au cœur du développement cortical précoce. Il dépend de divers facteurs autonomes portables, tels que sortie correct mitotique et la différenciation neuronale, la polarité cellulaire, régulation de la dynamique du cytosquelette et l&#39;expression de récepteurs transmembranaires, ainsi que des facteurs autonomes non cellulaires, tels que la formation de l&#39;échafaudage gliale radial et la sécrétion d&#39;orientation migratoire molécules 1-3. Depuis la perturbation de l&#39;un de ces mécanismes peut nuire à la migration neuronale dans un modèle de souris transgénique 4-8, déterminer la cause sous-jacente d&#39;un défaut dans la migration peut être un processus complexe et difficile. In utero électroporation (IUE) peut être utilisé pour compléter et simplifier interprétation du phénotype d&#39;un modèle knock-out génétique et donc à élucider les mécanismes importants nécessaires pour la migration radiale 7,9-11. In utero électroporation (IUE) est le processus par lequel un plasmide carryi<html> ng à la fois un gène d&#39;intérêt et un rapporteur est injectée dans le ventricule du cerveau d&#39;un embryon de souris ou de rat, puis aspiré dans les cellules qui tapissent le ventricule par l&#39;utilisation d&#39;un courant électrique 14.12. Cela permet à l&#39;enquêteur d&#39;analyser l&#39;effet de haut ou le bas régulation d&#39;un gène d&#39;intérêt dans le développement ou la fonction des neurones électroporation. Après IUE, cerveaux peuvent être traitées pour l&#39;immunohistochimie 7,9-11, électrophysiologie 15 ou culture cellulaire 16,17. L&#39;avantage majeur de l&#39;IUE est qui est permet une manipulation très spécifique de l&#39;expression génique. En outre, IUE peut être utilisé pour cibler une région spécifique du cerveau en développement à travers un courant dirigé (Figure 2). IUE peut également être utilisé pour cibler un type cellulaire particulier par l&#39;injection des plasmides portant des gènes sous le contrôle de différents promoteurs ou des systèmes d&#39;activation de plasmide (tetracycline induit l&#39;expression du gène est un exemple) 10,18-21. jove_content &quot;&gt; IUE peut être utilisé en conjonction avec le système d&#39;excision à médiation par le gène Cre-Lox 7-9,11,22. Un plasmide contenant un gène codant pour la transmission pour la protéine Cre peut être une électroporation dans des embryons homozygotes pour l&#39;allèle floxé ( dans lequel les régions de gènes ou d&#39;ADN spécifique sont flanquées par deux sites loxP pour la Cre médiation par recombinaison de l&#39;ADN). Cre alors induire une recombinaison du gène d&#39;intérêt spécifiquement dans des précurseurs neuraux électroporation, la génération d&#39;un knock-out de la floxée allele.The effet de protéines knockdown sur la migration neuronale et le développement dans les neurones individuels peut alors être étudié. électroporation de Cre induit recombinaison que dans une petite population de cellules touchées, laissant l&#39;environnement soutien intact. En revanche, expression tissulaire spécifique de Cre sous le contrôle d&#39;un type spécifique de cellules promoteur, se produit tout au long de l&#39;ensemble du tissu de sorte que les deux neuroblastes en migration et le milieu environnant pourraient être affectées. Ainsi, juxtaposition de ces deux approches peut déterminer si un défaut de migration donné est due à la cellule mécanismes non autonomes ou autonomes cellulaires. Migration défectueux dans les deux systèmes expérimentaux suggèrent que les résultats de phénotype observé à partir d&#39;un mécanisme autonome de cellules; migration normale après électroporation avec Cre de migration défectueux dans un modèle Cre spécifique des tissus indique que le gène d&#39;intérêt agit par l&#39;intermédiaire d&#39;un mécanisme autonome non-cellulaire. IUE peut également être utilisé pour effectuer des expériences de sauvetage par électroporation gènes interagissent potentiels en assommer les animaux 7,9,10. Par exemple, un enquêteur pourrait tenter de sauver un phénotype de migration dans un modèle transgénique par électroporation d&#39;une cible en aval et de déterminer si le défaut de migration est corrigé dans les neurones électroporation. Ceci présente l&#39;avantage supplémentaire que un sauvetage réussi indique que la migration normale peut être restaurée en manipulant l&#39;expression des protéines dans une SPEneurone cifique, bien que le milieu environnant est encore déficiente pour le gène ciblé. Encore une fois, cette approche est plus de temps et plus rentable que de traverser ou de générer des lignées transgéniques, avec l&#39;avantage supplémentaire de déterminer si le mécanisme défectueux est une cellule autonome. IUE peut être utilisé pour suivre la migration des neurones par électroporation d&#39;un plasmide rapporteur dans assommer embryons (Figure 4C). Comme seuls les neurones qui tapissent le ventricule au moment de la chirurgie sont électroporées 17, IUE peut être utilisé pour suivre les neurones nées à un moment précis avec l&#39;avantage de la visualisation de la morphologie in vivo. Enfin, il est possible d&#39;utiliser IUE pour cibler des régions cérébrales telles que le télencéphale dorsal medial ou, de l&#39;hippocampe ou de l&#39;éminence ganglionnaire (figure 2). Cela donne chercheurs le pouvoir d&#39;enquêter fonction du gène dans une zone spécifique indépendant de complications Résultattion de protéine knockdown dans des structures voisines. protéine du rétinoblastome (PRB), p107 et p130 comprennent la famille des protéines de poche et sont des régulateurs de la sortie du cycle cellulaire bien établie. Cependant, il ya plus de preuves que ces protéines régulent également cycle cellulaire aspects indépendants du développement neuronal. Comme nous l&#39;avons montré précédemment, PRB et p107 jouent un rôle crucial à la fois tangentielle 4,23 et la migration radiale 6. Ici, nous démontrons le rôle des protéines de poche membres de la famille pRb et p107 sur la migration neuronale 6 pour illustrer l&#39;utilisation de électroporation in utero de Cre dans un modèle transgénique. En résumé, IUE fournit un moyen puissant d&#39;analyse des effets de cellules autonomes de délétion du gène (ou la surexpression). Lorsqu&#39;il est combiné avec tissu spécifique assommer modèles, IUE peut fournir des informations supplémentaires concernant les mécanismes de contrôle de la migration neuronale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:233px;">Table 1: Equipment and Materials</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:119px;">Product Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:177px;">Description</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:119px;">ECM 830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0052</td>
			<td style="width:177px;">Electroporator only &#8211; buy cables separately (45-0204)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">1250FS Footswitch for ECM 830</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0211</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle is necessary for hands-free electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Tweezertrodes</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0489 (5mm)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 45-0488 (7mm)</td>
			<td style="width:177px;">Platinum forcep style electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920010504</td>
			<td style="width:177px;">Microinjector</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Griphead 0</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007414</td>
			<td style="width:177px;">Holds the pulled needle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Universal Capillary Holder</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007392</td>
			<td style="width:177px;">Connects griphead to tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Injection Tube</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007431</td>
			<td style="width:177px;">Connects capillary holder to Femtojet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Foot Control</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920005098</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle for hands-free injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">930001007</td>
			<td style="width:177px;">Tips for loading the pulled capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Plasmid Mega Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12181</td>
			<td style="width:177px;">5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:177px;">Non-toxic dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-08</td>
			<td style="width:177px;">For trimming the needles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Bonn Strabismus Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-09</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Graefe Forceps</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">11050-10</td>
			<td style="width:177px;">Straight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Colibri Retractors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">17000-03</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Stapler</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12031-07</td>
			<td style="width:177px;">For 7mm clips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Castroviejo Needle Holder</td>
			<td style="width:115px;">Medical Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">SNH-6737</td>
			<td style="width:177px;">Straight, with lock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:115px;">Narishige</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">PC-10</td>
			<td style="width:177px;">For pulling microcappillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microcapillaries</td>
			<td style="width:115px;">Drummond</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">1-000-800</td>
			<td style="width:177px;">0.4 mm inner diameter glass capillary tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of protein deletion through in utero electroporation to define deficits in neuronal migration in transgenic models

Deletion génétique en utilisant le système Cre-Lox dans des lignées de souris transgéniques est un outil puissant utilisé pour étudier la fonction des protéines. Cependant, à l&#39;exception des modèles Cre très spécifiques, la deletion d&#39;une protéine dans l&#39;ensemble d&#39;une population de tissus ou de cellules conduit souvent à des phénotypes complexes résultant de l&#39;interaction de plusieurs mécanismes. Déterminer si un phénotype résultats de perturbation d&#39;un mécanisme autonome de la cellule, qui est intrinsèque à la cellule en question, ou d&#39;un mécanisme autonome non-cellulaire, qui résulterait de la dépréciation de l&#39;environnement de cette cellule, peuvent être difficiles à discerner. Pour mieux comprendre la fonction des protéines dans un contexte in vivo, in utero électroporation (IUE) permet la suppression de gène dans un petit sous-ensemble de cellules dans le cortex développement ou une autre région du cerveau sélectionné. IUE peut être utilisé pour cibler des zones spécifiques du cerveau, y compris le télencéphale dorsal, télencéphale médial, hippocampe, ou éminence ganglionnaire. Ceci facilite l&#39;observation of les conséquences de cellule autonome deletion des gènes dans le contexte d&#39;un environnement sain. L&#39;objectif de ce protocole est de montrer comment IUE peut être utilisé pour analyser un défaut dans la migration radiale dans une lignée de souris transgéniques floxé, en mettant l&#39;accent sur la distinction entre les effets cellulaires autonomes autonomes et non-cellulaire de la protéine suppression. En comparant le phénotype résultant de la délétion des gènes dans l&#39;ensemble du cortex par rapport à deletion de gène à médiation par IUE dans une population de cellules limité, mieux comprendre la fonction des protéines dans le développement du cerveau peuvent être obtenus qu&#39;en utilisant soit la technique de façon isolée.

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo&#8217;s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models at JoVE.com

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

L&#39;induction de la protéine de suppression Grâce<em&gt; In Utero</em&gt; Électroporation à Définir déficits migration neuronale dans des modèles transgéniques

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

induction-protein-deletion-through-utero-electroporation-to-define

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

10.1K vues.  University of Ottawa. Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment. 

Vidéo: Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Une approche pour l&#39;évaluation optogénétiques formation des connexions neuronales dans un système de co-culture

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Recherche

Biologie du développement

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero L&#39;électroporation et organotypiques Slice culture de souris hippocampe Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Technique à la cible microinjection du Developing<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d&#39;ovocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagerie en direct de la souris Fusion de palais secondaire

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Application de RNAi et Expression du facteur de Transcription induite par la chaleur-choc pour reprogrammer les cellules germinales de neurones chez c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Cellule des épreuves d’agrégation pour évaluer la liaison de l’encoche de la drosophile avec Trans-Ligands et son Inhibition par Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...