Cette étude a été soutenue par des subventions du Conseil suédois de la recherche (90293501, A0290401, A0290402), septième programme-cadre de la Communauté européenne dans le cadre d&#39;accord de subvention n ° 602699 (DIRECT), la Fondation Novo Nordisk, la Fondation Gurli et Edward Brunnberg, La thérapie génique, Vleugel Fondation et la Fondation Åke Wiberg.

REMARQUE: Le sang est prélevé d&#39;individus sains par ponction veineuse ouverte du système dans l&#39;approbation de la Commission de révision éthique à Uppsala (permis no 2008/264). 1. Les cellules de semis <ol><li> Culture de cellules primaires humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC) à 37 ° C dans 5% de CO2 dans des flacons T75 revêtues de gélatine à 1% dans du PBS pH 7,4. </li><li> Retirer le milieu de culture à partir d&#39;un flacon T75 contenant HUVEC (ou un autre type de cellules endothéliales humaines primaires) et laver les cellules avec 2,1 mM d&#39;EDTA dans du PBS pH 7,4. Détacher les cellules par addition de 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA et incubation pendant 2 à 3 min à 37 ° C. </li><li> Recueillir les cellules par rinçage de la fiole avec 9 ml de 10% de FBS dans du PBS pH 7,4 et transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml. Isoler les cellules à 735 g pendant 5 min. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension avec précaution du culot de cellules endothéliales dans un milieu de croissance de cellules microvasculaires (CE GMMV) et compter les cellules dans une chambre Bürker. Seed 21.000 cElls / cm 2 dans les diapositives de culture cellulaire 1-puits et incuber à 37 ° C. Le HUVEC sera confluentes après 1 - 2 jours de culture. Surveiller la morphologie cellulaire et la confluence de tous les jours sous un microscope optique. </li></ol> 2. Préparation de sang total <ol><li> Préparer toutes les surfaces artificielles qui seront en contact avec le sang d&#39;une double couche de l&#39;héparine immobilisée (CHS) selon les instructions du fabricant. Enrobés SHC protégées de la poussière peuvent être conservés à température ambiante jusqu&#39;à 6 mois sans perte de fonction. </li><li> Utilisez ouvert ponction veineuse du système pour prélever du sang d&#39;un donneur sain peu (&lt;30 minutes) avant de commencer l&#39;expérience de la chambre de endothéliale artérielle. Couple une aiguille hypodermique (18 G x 50 mm) au SHC tubes de silicium revêtue (diamètre intérieur: 2 mm) avant de recueillir soigneusement sang dans un tube revêtu CHS de 50 ml. Supplément de sang avec de l&#39;héparine non fractionnée pour atteindre une concentration finale de 0,75 UI / ml. Mélanger doucement le sang par inverter le tube 2 - 3 fois. </li></ol> 3. sang endothéliale Chambre modèle <ol><li> Fabriquer chambres de sang (Figure 1A; vue de dessus) en polyméthacrylate de méthyle acrylique (PMMA) constitué de deux cylindres (hauteur 8 mm et de rayon 9 mm) qui sont collés sur une lame de PMMA (25 x 75 mm). Monter les bords des cylindres vers le haut avec joints toriques en caoutchouc pour sceller la chambre de sang contre les lames de verre avec des cellules endothéliales en culture (figure 1B). Faire tourner les chambres de sang reliées à la lame de culture avec les cellules endothéliales par la suite dans une position verticale (Figure 1C). </li><li> Utiliser un embout de pipette enduit CHS de transférer 1,5 ml de sang dans chaque CHS enrobés chambre en prenant soin de ne pas activer le sang. </li><li> Transfer 1 ml de sang dans des tubes à centrifuger contenant 30 pi d&#39;EDTA 0,34 MK 3 pour atteindre une concentration finale de 10 mM d&#39;EDTA K 3 pour la détermination des concentrations en protéines de plasma initial à l&#39;aideun dosage immunoenzymatique (ELISA). Mélanger soigneusement le sang et maintenir les tubes sur la glace. </li><li> Retirer les parois en plastique des lames de verre de culture de cellules selon les instructions du fabricant et soigneusement laver les cellules dans du PBS pH 7,4. Veillez à retirer par la suite autant de liquide que possible de les diapositives. Ne laissez pas les cellules se dessèchent. </li><li> Placer la lame au-dessus des chambres de sang, avec des cellules du sang faisant face. Fixer la lame en plaçant une pince autour de la chambre de cellules endothéliales dans le sang. Utiliser une lame en matière plastique pour un soutien supplémentaire pour éviter la rupture de la lame de verre de culture cellulaire lors de la passation de la pince. </li><li> Fixer la chambre de cellules endothéliales de sang sur une roue en rotation (40 cm de diamètre) lieu dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. Tournez chaque chambre sur le volant à 0,5 g pendant 30 min. </li><li> Après incubation, le démontage de la chambre de cellules endothéliales dans le sang. Laver les lames de culture de cellules dans du PBS pH 7,4 et fixer les cellules dans le froid de la glace 1% de paraformaldéhyde (PFA) fou 10 min. Transfer 1 ml de sang à partir de chaque chambre de microtubes à centrifuger contenant 30 pi d&#39;EDTA 0,34 MK 3 pour atteindre une concentration finale de 10 mM d&#39;EDTA K 3 et mélanger doucement les tubes. Gardez les tubes sur la glace. </li><li> Centrifuger les tubes à 4560 g pendant 10 min à 4 ° C. Transférer le plasma sanguin de nouveaux microtubes et magasin à -70 ° C jusqu&#39;à analyse plus approfondie. </li></ol> 4. Analyse de sang endothéliale Interactions <ol><li> Effectuer immunofluorescence avec la souris CD16 anti-humain suivie par chèvre secondaire anti-souris Alexa 488 et phalloidin-TexasRed. Effectuez chaque étape de coloration pendant 1 heure à température ambiante et laver les lames dans du PBS pH 7,4 entre chaque étape. Counterstain les noyaux au DAPI pendant 10 min à température ambiante. Analyser les composants sanguins liés aux cellules endotheliales par microscopie de fluorescence en combinaison avec l&#39;analyse d&#39;image en utilisant un logiciel approprié d&#39;analyse d&#39;images tel que CellProfiler. </li><li> Quantify les réactions dans le compartiment de sang avec de la thrombine-antithrombine (TAT) ELISA selon les instructions des échantillons de plasma du fabricant. </li><li> Utiliser des outils statistiques appropriés, par exemple., Un test t non apparié, à analyser les données. </li></ol>

<ol>
	<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice+and+Not+Men:+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology.">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li><li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin.">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li><li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In.">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li><li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro.">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li><li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials,+cells,+and+tissues:+basic+concepts,+test+models,+and+practical+guidelines.">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium.">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li><li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors.">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li><li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation.">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li><li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-Bed&#8211;Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States.">Vascular-Bed&#8211;Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Interactions multiples entre le sang et la paroi du récipient sont normalement maintenus dans un état ​​de repos en raison de la nature non-adhésive et anti-thrombotique de l&#39;endothélium. 7 Dans des conditions pathologiques impliquant une inflammation, l&#39;endothélium est activé avec une augmentation résultante de l&#39;expression des récepteurs d&#39;adhérence 8 et une diminution de la capacité à inhiber l&#39;hémostase. 9 Activation des systèmes en cascade dans le sang à son tour amplifie le thrombogène de l&#39;endothélium provoquant de nouveaux recrutements de thrombose et de leucocytes. 10 Pour avoir une meilleure compréhension de cette délicate interactions entre les cellules endothéliales et du sang total, nous avons mis au point une nouvelle méthode in vitro, où les cellules endothéliales en culture sont mises en contact avec du sang entier. À notre connaissance, notre installation est la première à montrer les cellules endothéliales incubées avec du sang humain total avec très peu ou pas d&#39;anticoagulant pour des périodes de temps plus longues. nt &quot;&gt; La sensibilité de ce système est activée par ouverture de ponction veineuse du système, en combinaison avec une couche de protection de l&#39;héparine immobilisée sur toutes les surfaces mises en contact avec du sang. L&#39;utilisation d&#39;un système ouvert lors du prélèvement sanguin réduit l&#39;activation des systèmes en cascade pendant la ponction veineuse tout en permettant l&#39;utilisation d&#39;une quantité d&#39;auto-déterminé de l&#39;anticoagulant. disponibles dans le commerce tubes de sang évacués peuvent, toutefois, être utilisés en fonction des points d&#39;extrémité visés par l&#39;étude. La concentration finale de l&#39;anticoagulant ajouté à tubes de système fermé plus disponibles dans le commerce peuvent inhiber sensible et par ailleurs difficile d&#39;étudier les interactions dans la configuration. 6 Une surface de l&#39;héparine de protection élimine en outre l&#39;activation du sang à travers la surface de contact par des surfaces autres que les cellules endotheliales. 5 En effet, l&#39;incubation du sang total additionné d&#39;une petite quantité d&#39;héparine non fractionnée en chambre sans la protection de la SCH a donné lieu à la formation de caillots. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; La bulle d&#39;air dans la chambre permet de mixer du sang pendant l&#39;incubation avec les cellules endothéliales. Afin d&#39;évaluer l&#39;effet de la taille des bulles d&#39;air, nous avons utilisé deux volumes sanguins différents. Dans ce modèle, nous avons mesuré les niveaux de TAT similaires quelle que soit la taille des bulles d&#39;air dans les chambres incubées avec HUVEC. TAT a toutefois augmenté avec une taille de bulle d&#39;air plus faible dans les chambres entièrement CHS traité. Ce, en fonction des propriétés des cellules endothéliales décrites précédemment 11, indique un effet régulateur sur l&#39;activation de la coagulation accrue fournie par les cellules endothéliales qui manquent dans la chambre CHS inerte. La bulle d&#39;air dans le système crée un écoulement lors de la rotation de la chambre. La taille de la bulle affecte les forces dans le système en rotation. Ceci est illustré par les résultats de la figure 2D était une petite bulle crée des valeurs de TAT plus élevés représentant une diminution de la vigueur à la ie de sang, le mouvement de sangà l&#39;intérieur de la chambre est plus faible et par conséquent l&#39;activation du système de cascade se produit à un degré plus élevé. Il convient de mentionner que, dans ce système, nous sommes en train de créer un écoulement tournant qui sera différent en vitesse dans la chambre avec la plus grande vitesse le long des murs et la plus faible dans le centre. Ceci est évidemment pas un environnement optimal en ce qui concerne l&#39;écoulement et la contrainte de cisaillement pour les cellules endothéliales, mais nous avons encore un système produisant des résultats stables et reproductibles. Des conditions plus optimales comprendraient circuler un écoulement laminaire, en l&#39;absence de turbulence. Ceci est, cependant, pas possible dans le modèle représenté ici et à notre connaissance, un tel système ne sont pas disponibles à ce jour. Bien que, il ya plusieurs systèmes microfluidiques disponible dans le commerce qui ne sont pas possible de combiner avec du sang total sans ou avec de faibles niveaux d&#39;anticoagulant ajouté au système ainsi ne pas permettre une évaluation correcte sensible des interactions entre tous les éléments présents dans le sang et les cellules endothéliales. En outre, il y avait une augmentation de 2 fois dans le recrutement de cellules sanguines vers les cellules HUVEC TNFa activée en combinaison avec une formation de TAT doublé indépendamment du volume sanguin. Cela permet de vérifier la stabilité du système de modèle et montre aussi la possibilité d&#39;utiliser un endothélium activé en association avec du sang total. Future sur, la chambre de cellules endothéliales dans le sang peut être utilisé pour étudier le recrutement de cellules sanguines vers les cellules endotheliales activées par une variété de marqueurs exprimés sur des cellules dans diverses conditions et les étapes d&#39;activation. En outre, le modèle peut être utilisé en combinaison avec des agents pharmacologiques dans le but d&#39;évaluer les effets sur les états inflammatoires. En résumé, nous montrons le grand avantage de combiner un modèle de chambre avec les cellules sanguines et vasculaires humaines pour créer un être humain complet dans le système in vitro pour mener des enquêtes pertinentes de maladie vasculaire.

Des procédés pour l&#39;analyse des interactions de sang vasculaire à une maladie cardio-vasculaire comportent généralement des expériences de recherche animale. Résultats créés dans des modèles animaux de recherche expérimentales peuvent, cependant, avoir peu ou pas d&#39;incidence sur les maladies humaines 1,2 En tant que tel., Il ya un besoin pour de bon et fiable dans des modèles in vitro pour étudier les interactions cellulaires entre le compartiment sanguin et les cellules endothéliales vasculaires un système de type humain. Nous avons donc mis en place un modèle de la chambre de cellules endothéliales dans le sang. Ceci est basé sur un modèle décrit précédemment utilisé pour étudier les interactions entre les biomatériaux et le sang total humain. 3 Contrairement à d&#39;autres configurations in vitro où habituellement au nombre de composants purifiés, limitées à-dire, les thrombocytes, des leucocytes ou des cellules endothéliales sont disponibles, le modèle actuel intègre tous les composants présents dans un vaisseau sanguin. La configuration de l&#39;endothélium de sang cmodèle de chambre ell est conçu pour permettre l&#39;utilisation du sang humain fraîchement prélevé avec peu ou pas d&#39;anticoagulant ajouté. Sang conservé pendant des périodes de temps plus longues acquérir ce qu&#39;on appelle des lésions de stockage où répartition des érythrocytes peut interférer avec les interactions délicates entre le sang et les cellules endothéliales. 4 Pour éviter la formation de caillots lors de la manipulation de sang entier ex vivo nécessite soit de fortes doses d&#39;anticoagulant ou que tout le matériel en contact avec du sang doivent être non-activation. Comme les surfaces non-activation sont rares dans l&#39;environnement du laboratoire, les matériaux peuvent également être équipées d&#39;une couche de protection de l&#39;héparine immobilisée. Une couche protectrice de l&#39;héparine immobilisée (ci-après dénommée surface Corline d&#39;héparine (CHS)) qui peut être appliquée à la plupart des matériaux qui créent une surface où un contact avec du sang peut se produire sans provoquer une activation de la cascade de la coagulation. 5 Par conséquent, en fournissant des chambres avec CHS, la CE endothéliale artériellell modèle de la chambre permet l&#39;utilisation de très faibles concentrations de l&#39;anticoagulant dans le sang. En évitant l&#39;ajout de concentrations élevées d&#39;anti-coagulant dans le modèle de la chambre de l&#39;endothélium dans le sang, il est possible d&#39;étudier les interactions sensibles au sein d&#39;un vaisseau sanguin qui pourraient autrement être masqués. 6 Le modèle de la chambre de cellules endothéliales dans le sang est constitué de deux chambres formées en attachant des cylindres en plastique (hauteur: 8 mm, un rayon de 9 mm) sur une lame de microscope en plastique. Les bords tournés vers le haut sur les cylindres sont équipés de rainures qui sont équipés de joints toriques en caoutchouc utilisés pour assurer l&#39;étanchéité des chambres à l&#39;encontre du support de culture cellulaire. Les chambres sont seulement partiellement remplies de sang comme l&#39;air dans la chambre maintient le sang en circulation, lorsque les chambres sont ensuite mis en rotation dans une position verticale (figure 1). Afin d&#39;évaluer la fonctionnalité du modèle, nous avons effectué des expériences avec soit un CHS recouvert complètementchambre ou ombilical veine cellules endothéliales (HUVEC). Deux volumes de sang ont été analysés séparément et la formation de la thrombine de l&#39;antithrombine (TAT) complexes (un marqueur indirect de la coagulation) a été mesurée avec la méthode immuno-enzymatique (ELISA). Nous avons ensuite évalué l&#39;effet de volumes de sang et le facteur de nécrose tumorale (TNFa) stimulé des cellules endotheliales sur le recrutement des leucocytes par analyse d&#39;image. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> Figure 1. Configuration du modèle de chambre de cellule endothéliale du sang. (A) Vue du dessus dessin schématique de la chambre de sang faite en PMMA. (B) des cellules endothéliales humaines primaires sont cultivées sur des lames de la chambre 1 puits. Le sang entier humain frais est ajouté à deux chambres sur une lame de microscope. Les chambres et tous les matériaux utilisés pour la manipulation du sang sont traités avec un revêtement de protection HS. Après avoir enlevé les parois de la CEll glissière culture, les cellules sont placées en regard du sang et le système de fermeture est serré. chambres d&#39;éléments (C) Le endothéliale de sang sont ensuite incubées sous rotation à 37 ° C. Par la suite, les réactions dans le compartiment de sang peuvent être analysés par ELISA et les cellules endotheliales peuvent être analysées par microscopie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:91px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:272px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-12200</td>
			<td style="width:272px;">Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-22120</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G-2500</td>
			<td style="width:272px;">Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">TAT ELISA</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Lab.</td>
			<td style="width:119px;">TAT-EIA-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse anti-human CD16</td>
			<td style="width:91px;">DAKO</td>
			<td style="width:119px;">F7011</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse Alexa 488</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Phalloidin-Texas Red</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A22287</td>
			<td>Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>Dilution 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E-6758</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Tecnologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10437</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1 well cell culture slides</td>
			<td style="width:91px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">354101</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Blood Chambers</td>
			<td style="width:91px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Clamps</td>
			<td style="width:91px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">2052204</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Corline Heparin Surface (CHS)</td>
			<td style="width:91px;">Corline Systems AB</td>
			<td style="width:119px;">945-00</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:91px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-1850R</td>
			<td style="width:272px;">Size: 18 G x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Unfractionated Heparin (UFH)</td>
			<td style="width:91px;">Leo Pharma</td>
			<td style="width:119px;">585679</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">K3EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">1709958</td>
			<td style="width:272px;">Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">PFA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-6148</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">TS100</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:91px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:272px;">Available for free at www.cellprofiler.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

La majorité des maladies connues sont accompagnés par des troubles du système cardio-vasculaire. Les études sur la complexité des voies en interaction activées lors de pathologies cardio-vasculaires sont, cependant, limitée par le manque de méthodes robustes et physiologiquement pertinents. Afin de reproduire des événements vasculaires pathologiques nous avons mis au point un test in vitro pour étudier l&#39;interaction entre l&#39;endothélium et le sang total. Le dosage est constitué de cellules endothéliales humaines primaires, qui sont placés en contact avec le sang total humain. Le procédé utilise le sang natif avec peu ou pas d&#39;anticoagulant, ce qui permet l&#39;étude des interactions entre les composants délicats moléculaires et cellulaires présents dans un vaisseau sanguin. Nous avons étudié la fonctionnalité de l&#39;essai par comparaison de l&#39;activation de la coagulation par des volumes de sang incubées avec ou sans les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC). Considérant qu&#39;une quantité de sang plus contribué àune augmentation de la formation de la thrombine de l&#39;antithrombine (TAT) complexes, la présence de cellules HUVEC entraîné réduit l&#39;activation de la coagulation. En outre, on a appliqué l&#39;analyse de l&#39;image de l&#39;attachement des leucocytes aux cellules HUVEC stimulées par le facteur de nécrose tumorale (TNFa) et a trouvé la présence de cellules CD16 + à être nettement plus élevé sur le TNFa a stimulé les cellules par rapport aux cellules non stimulées après contact avec le sang. En conclusion, le test peut être appliqué à l&#39;étude de pathologies vasculaires, où les interactions entre l&#39;endothélium et le compartiment de sang sont perturbées.

La nécessité de CHS revêtement Afin de mesurer les réactions dans le sang total spécifiques à ceux provoqués par les cellules endothéliales, tous les matériaux utilisés pour la chambre de cellules endothéliales de sang doivent être munis d&#39;un enduit CHS avant de l&#39;utiliser. Figure 2A (à gauche) montre une chambre non couché après 30 min de contact avec le sang d&#39;un caillot clairement visible présente. Le traitement de la chambre avec le SHC (Figure 2A, droite) d&#39;autre part protège le sang de l&#39;activation incontrôlée, veiller à ce que les résultats sont dus à des interactions cellule-endothéliales sang. L&#39;effet du volume de sang dans la chambre L&#39;activation de la coagulation est plus probable dans le sang stagnant comme la probabilité d&#39;interaction entre les facteurs de coagulation activés est augmenté. Dans le modèle de la chambre de cellules endothéliales dans le sang, le sang est maintenu en mouvement en raison de la circulation d&#39;une bulle d&#39;air à l&#39;intérieur de la chambre. En oRDONNANCE pour déterminer l&#39;effet de variations du volume de sang, et donc aussi la taille des bulles d&#39;air, une chambre revêtue CHS est reliée à un coulisseau CHS en verre revêtu qui a été testé avec 1,5 ml ou 1,75 ml de sang total pendant 30 min. Le volume de sang sans aucun mouvement de la bulle d&#39;air est 2,5 fois plus grande lorsque 1,75 ml de sang est ajouté à la chambre par rapport à quand 1,5 ml de sang est utilisé (figure 2B). Les TAT-valeurs mesurées ont suggéré augmenté TAT-formation avec augmentation du volume sanguin (figure 2D). Lorsque les cellules HUVEC (figure 2C) ont été incubées avec soit 1,5 ou 1,75 ml de sang total, aucune différence n&#39;a été observée entre les deux groupes, ce qui suggère que les cellules endotheliales peuvent moduler l&#39;activation de la coagulation (figure 2D). L&#39;effet du TNFa sur Globule recrutement et l&#39;activation de la coagulation Afin d&#39;étudier l&#39;effet du TNFa sur le recrutement des leucocytes, des cellules HUVEC était régaled avec 20 ng / ml de TNFa 4 heures avant le contact avec le sang. contact avec le sang - soit avec 1,5 ml ou 1,75 ml de sang - a été poursuivie pendant 30 minutes après que les diapositives de la culture ont été colorées pour CD16 (figure 2F), imagée et le nombre de cellules CD16 + a été quantifiée. Le recrutement de cellules CD16 + a augmenté de manière significative avec le traitement TNFa (figure 2E) 100-256 CD16 + cellules / mm 2 (p &lt;0,0001) avec 1,5 ml de sang et 172 à 378 (P &lt;0,0001) avec 1,75 ml de sang. La formation de complexes TAT a été mesurée dans les échantillons de plasma correspondantes du sang incubées avec des cellules non traitées ou non traitées TNFa (figure 2G). les cellules stimulées TNFa induit un doublement approximatif de complexes TAT, par rapport aux cellules non traitées. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> Figueure 2: Fonctionnalité du modèle de chambre de cellule endothéliale du sang. (A) Les chambres avec ou sans CHS ont été incubées avec du sang total. Sans CHS, un caillot a été formé après 30 min. Mesure de la thrombine-antithrombine (TAT) complexes, un marqueur indirect de la coagulation, dans le sang incubées sans CHS était&gt; 6000 pg / ml. (B) Le volume de sang pas maintenu en mouvement par la bulle d&#39;air en rotation varie en fonction de différents volumes de sang. Avec l&#39;ajout de 1,5 ml de sang, ce volume sera de 0,3 ml, alors il passera à 0,74 ml avec l&#39;ajout de 1,75 ml. (C) HUVEC imagé avec contraste de phase microscopie spectacle typique morphologie des cellules endothéliales d&#39;une monocouche confluente avant contact avec le sang. (D) des valeurs pour les chambres TAT complètement enrobées CHS montrent une légère différence en différents volumes de sang sont ajoutés. L&#39;addition de 1,5 ml de sang a donné lieu à 35 ± 11 pg / ml (n = 7) par rapport à 1,75 ml, qui a abouti à 8577; 70 ug / ml de TAT (n = 8). Cette différence est plus présent lorsque les cellules HUVEC sont mises en incubation avec les mêmes volumes de sang; 66 ± 55 pg / ml pour 1,5 ml (n = 5) et 66 ± 29 pg / ml de 1,75 ml (n = 7). (E) La quantification du nombre de cellules CD16 + non stimulés soit présent sur ​​le TNFa ou HUVEC stimulées après contact avec le sang. Le nombre de CD16 + est augmenté de façon significative avec le TNFa stimule les cellules incubées soit avec 1,5 ml (de base: 100 ± 40 cellules / mm; TNF: 256 ± 121 cellules / mm) ou 1,75 ml (de base: 172 ± 67 cellules / mm; TNF: 378 ± 185 cellules / mm) de sang total (F) des images représentatives de non stimulées et TNF HUVEC stimulées coloration des phalloidin (rouge), CD16 (vert) et DAPI (bleu).. Barre d&#39;échelle = 250 um (G) La formation de complexes TAT est pratiquement doublé par TNFa a stimulé les cellules par rapport aux cellules non traitées incubées avec du sang (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 fois plus TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 fois plus de TAT, n = 4). Toutes les valeurs sont présentées comme moyenne ± écart-type; Les valeurs de p ont été calculés par des tests t non appariés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour l&#39;étude des interactions entre les droits du sang total et de l&#39;endothélium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.3K vues.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Recherche

Immunologie et infection

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Kératite herpétique récurrente stromale chez la souris, un modèle pour l&#39;étude de l&#39;homme HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Etudier communautés microbiennes<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modèle d&#39;interaction hôte intermédiaire Entre<em&gt; Candida albicans</em&gt; Et<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans les Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Cytométrie en flux Analyse des cellules tueuses naturelles lytique Activité dans le sang humain

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

Développement et identification d&#39;une sous-population Novel of Human neutrophiles dérivé phagocytes géant<em&gt; In vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextrane augmente l’efficacité de la Transduction des gènes des cellules NK primaires murines et humaines

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse des Lymphocytes extravasation L&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un nouveau système exempt d’alimentation pour la Production de masse des cellules tueuses naturelles murins In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caractérisation des sous-ensembles de Monocyte humain de sang Flow Cytometry analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...