Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. Génération élastomères Timbres <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pour générer les maîtres de silicium du timbre de PDMS, concevoir les modèles de fonction du photomasques en utilisant un logiciel de conception assistée par ordinateur. <ol><li> Concevoir le premier motif comme une matrice 20 x 20 d&#39;anneaux de 300 um de diamètre interne (ID) et de 600 um à 1200 um OD espacement centre-à-centre. </li><li> Concevoir le second modèle en tant que matrice de 20 x 20 avec des anneaux 600 de ID 900 um um et 1200 um OD avec un espacement de centre à centre. </li><li> En outre, placer 1 x 1 mm 2 points de référence carrés aux quatre coins de la conception de chaque réseau espacé 1200 um centre-à-centre du motif de coin à un angle de 45 °. </li><li> Fabriquer les maîtres de silicium utilisés dans cette expérience avec 1: 1 ratio d&#39;aspect, en corrélation avec une fonction profondeur de 300 um en utilisant des techniques de lithographie standard présentés ailleurs 15 ou en collaboration avec une fonderie microfluidique. Remarque: La fonction profondeurs inférieure à 100 um peuvent entraîner une déformation anormale de timbres avant contact avec des surfaces de substrat. NOTE: Ce protocole commence par avoir des maîtres de silicium déjà obtenues avec les modèles décrits de résine photosensible, qui nécessite un équipement spécialisé et des chambres propres à créer. Il est préférable de consulter un centre de fabricant ou de base pour créer ces maîtres motifs. </li></ol></li><li> Maîtres de silicium silaniser O / N par incubation avec (tridécafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) la vapeur d&#39;trichlorosilane. REMARQUE: Silane vapeur est hautement toxique et ne doit être manipulé dans une hotte chimique. </li><li> Créez des répliques inverse des maîtres de silicium par durcissement d&#39;un ratio de 10: 1 de PDMS pré-polymère et PDMS agent sur le dessus des maîtres de silicium silanisés durcissement dans un plat de Pétri O / N à 60 ° C. </li><li> Retirez les timbres de PDMS par les maîtres de silicium, et coller les timbres à l&#39;acrylonitrile butadiène styrène (ABS) supports ou tout autre matériau rigides en utilisant de la colle. REMARQUE: Le matériau de choix ne doit pas être transparent ou biocompatible. Toutefois, il doit fournir une surface plane pour l&#39;interface avec l&#39;outillage robotique et une plus grande rigidité que le PDMS. </li></ol> 2. Préparation Couvre-objets <ol style="margin-left: 40px;"><li> Couvre-objets de microscope de rinçage (24 mm x 50 mm n ° 1) dans du toluène, du methanol et de traitement par ultrasons dans de l&#39;acétone pendant 1 min avant de le rincer avec de l&#39;éthanol et séchage sous un léger courant d&#39;azote. REMARQUE: Manipulez le toluène et l&#39;acétone que dans une hotte chimique. </li><li> Couvre-objets Coat avec ~ 3,5 nm de titane (Ti), suivie par 18,0 nm d&#39;or (Au) à l&#39;aide d&#39;un évaporateur à faisceau d&#39;électrons focalisé. Remarque: Cette procédure est compatible avec une grande variété de substrats d&#39;or revêtu, y compris le silicium et le polystyrène. Bien qu&#39;il soit possible de générer celles-ci sur le site, des substrats revêtus d&#39;or sont également disponibles par l&#39;intermédiaire de fournisseurs commerciaux. REMARQUE: couches Ti devrait être d&#39;au moins 3 nm d&#39;épaisseur, tandis que Au couches sur des substrats devraient être unt moins 5 nm d&#39;épaisseur, et peut aller jusqu&#39;au bout de 1 mm d&#39;épaisseur en fonction des propriétés optiques idéales du substrat final 16,17. Substrats sont pas tenus d&#39;être optiquement clair pour la fabrication; Cependant, il facilite l&#39;analyse microscopique de substrats fabriqués. </li><li> Rincer Couvre-objets revêtues d&#39;or avec de l&#39;éthanol et sèche sous azote doux immédiatement avant utilisation. </li></ol> 3. R-uCP de couronne extérieure <ol style="margin-left: 40px;"><li> Avant R-uCP avec le système conforme sélective bras de robot articulé (SCARA), calibrer les effecteurs d&#39;outils robotiques et des systèmes à double caméra d&#39;accompagnement en utilisant le logiciel du système. NOTE: Ces outils sont illustrés dans la Figure 1. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg" /> Figure 1. R- système uCP et le bras robotique Outillage. </strong&gt; (A) de vue à grande échelle de système R-uCP avec tout l&#39;outillage et des accessoires, (a) ventouse, (b) un bain de réactif, (c) face à la caméra vers le bas, (d) timbre de nidification appareil, (e) robotique outil. (B) outillage de bras robotique représentant (f) outil de gravure diamantée et (g) de l&#39;outil d&#39;aspiration pneumatique tenant un (h) PDMS timbre ABS adossés. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Placer manuellement un timbre de PDMS avec 600 ID um et 900 um OD saillie anneaux face vers le bas dans l&#39;appareil timbre de nidification. Placer manuellement un coverslide revêtu d&#39;or fraîchement nettoyée au-dessus du mandrin à vide, affiché dans la figure 1A, et l&#39;immobiliser à l&#39;aide du vide de laboratoire connecté. </li><li> Utilisation des commandes de robots, aligner la caméra vers le bas sur le point de le coverslide revêtu d&#39;or centre, comme dans la figure 2A. NOTE: Ce point peut d&#39;abord être défini par inspection visuelle et ne nécessite pas une grande précision, comme le timbre de PDMS est beaucoup plus larger que la lame d&#39;or revêtu. </li><li> Demandez le bras robotique de graver quatre référence &quot;X&quot; marque aux sommets d&#39;un carré avec des dimensions de 3,8 mm par 3,8 mm centré sur le coverslide revêtu d&#39;or en utilisant l&#39;outil de gravure diamantée fixée au bras robotique. (Représentée à la figure 2B; processus automatisé) REMARQUE: Ceci assure aux quatre marques de référence sont à l&#39;intérieur d&#39;une image visuelle de la caméra vers le bas. </li><li> En utilisant les robots outillage d&#39;aspiration pneumatique, pick-up et détiennent les PDMS timbre de 1 mm au-dessus du luminaire timbre de nidification comme dans la figure 2C. (Processus automatisé) </li><li> Utilisation de la caméra vers le haut et anneau d&#39;éclairage LED illustré à la figure 2D et E, de visualiser les repères de la place de la vignette et les identifier avec le logiciel de la caméra 10 fois afin de déterminer X moyenne du timbre, Y, et décalage angulaire du centre de la axe robot outillage. (Processus automatisé) </li><li> Comme dans <strong&gt; Figure 2A, utiliser l&#39;appareil photo vers le bas pour visualiser et détecter des repères gravés du coverslide 10 fois pour déterminer X de la coverslide moyenne, Y emplacements de centre et décalage angulaire du centre de l&#39;axe robot outillage. (Processus automatisé). REMARQUE: Un calcul interne est effectuée par le logiciel du système robotique d&#39;aligner précisément de l&#39;empreinte et la lamelle de X, Y emplacements de centre et des décalages angulaires dans les futures étapes R-uCP. </li><li> 3.8) Placer le tampon dans un bain de alcanethiol initiateur ATRP, ω-mercaptoundecyl bromoisobutyrate (2 mM dans l&#39;éthanol) tel que représenté sur la figure 2F. (Processus automatisé) </li><li> Enlevez le tampon de la solution de alkanethiol et placez-le sur courant d&#39;azote sous pression à 0,48 bar (5 psi) pour faire évaporer l&#39;éthanol comme dans la figure 2G. Après 1 min d&#39;augmenter la pression du courant d&#39;azote est de 1,03 bar (15 psi) pour assurer la sécheresse uniforme. (Processus automatisé) REMARQUE: séchage incomplet entraînera la perte totale ou partielle de modèle fidélité. </li><li> Après séchage, le timbre se déplacer au-dessus de la position centrale calculée de la lame d&#39;or revêtu et de l&#39;abaisser à 100 um incréments tout en contrôlant la force du moteur d&#39;axe Z comme illustré sur la figure 2H. NOTE: Ce communiqué est aussi connu par le couple moteur de l&#39;axe Z et affiché dans le logiciel de guidage de robot. (Processus automatisé) </li><li> Arrêter l&#39;abaissement du timbre une fois la pression prédéterminée de 79,2 kPa a été atteint, et maintenir le contact avec la lame d&#39;or revêtu pendant 15 sec. (Processus automatisé) REMARQUE: Les valeurs de pression ici sont optimisés pour la conception du timbre et fonction hauteur actuelle. Si la conception du timbre est modifié, en particulier pour le rapport d&#39;aspect élevé timbres, régler ces en conséquence par un processus d&#39;essais et d&#39;erreurs. </li><li> Retirer lentement le cachet de la lame d&#39;or revêtu et placer le timbre de retour dans la fixation timbre de nidification. (Processus automatisé) </li></ol&gt; 4. SI-ATRP de PEGMEMA sur microélectrodes Couvre-objets <ol style="margin-left: 40px;"><li> Relâchez la pression du vide en maintenant la coverslide microélectrodes, et de la transférer à un ballon de Schlenk de 50 ml. Seal et dégazer le ballon de Schlenk l&#39;aide d&#39;une pompe à vide. </li><li> Ajouter 5,5 ml de mélange réactionnel ATRP contenant le macromonomère PEGMEMA (208,75 mmol), de l&#39;eau (34,4 ml), du methanol (43,8 ml), de cuivre (II), le bromure de (1 mmol) et de 2 &#39;, 2-bipyridine (3 mmol) de le ballon de Schlenk. </li><li> Ajouter 0,5 ml d&#39;ascorbate L-sodium (454,3 mM) dans de l&#39;eau pour amorcer la réaction, et lui permettre de continuer pendant 16 heures à température ambiante sous gaz inerte. REMARQUE: Après l&#39;ajout d&#39;ascorbate L-sodium, couleur de réaction se déplacera du vert clair au brun foncé, comme illustré sur la figure 3A-B. NOTE: La réaction peut continuer au-delà de 16 heures, mais il ne sera pas augmenter de manière significative la longueur des brosses de PEG. </li></ol><imgalt = &quot;Figure 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52186 / 52186fig3highres.jpg&quot; /&gt; Figure 3. Ouverture de SI-ATRP. (A) Initiation de réaction et (B) changement de couleur suite après l&#39;addition de L-ascorbate de sodium. L&#39;image (C) Microscope de surface de coverslide microélectrodes en suivant la procédure SI-ATRP. Barre d&#39;échelle 1 mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> Retirez le coverslide microélectrodes du ballon Schenk et rincer avec de l&#39;éthanol, de l&#39;eau et de l&#39;éthanol et sécher sous un léger courant d&#39;azote. NOTE: Après SI-ATRP, les modifications de surface doit être visible à l&#39;œil et peut être imagé et analysé au microscope comme dans la figure 3C. NOTE: Ceci est la méthode la plus simple pour tester la précision de l&#39;essai car il évite d&#39;avoir à immunocoloration les substrats. </li></ol> 5. La fonctionnalisation des chaînes azoture de microélectrodes PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Placez le coverslide microélectrodes dans 20 ml de réaction flacon en verre. </li><li> Ajouter 6 ml de N, N-diméthylformamide (DMF) contenant de l&#39;azoture de sodium à 100 mM dans le flacon de réaction. Maintenir cette réaction à 37 ° C pendant 24 heures. REMARQUE: Manipulez DMF que dans une hotte chimique. Faites preuve de prudence lors de la pesée à l&#39;azoture de sodium. </li><li> À la fin, retirez le coverslide microélectrodes du flacon de réaction et rincer avec de l&#39;éthanol puis à l&#39;eau et à sec sous un courant d&#39;azote. </li></ol> 6. passivation des chaînes de brome fonctionnalisés PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Placez coverslide microélectrodes en flacons de 20 ml de réaction de verre. </li><li> Ajouter 6 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) contenant 100 mM d&#39;éthanolamine et de la triéthylamine 300 mM dans le flacon de réaction. Maintenez cette réaction à 40 ° C pendant 24 heures. REMARQUE: Manipulez DMSO, l&#39;éthanolamine, la triéthylamine et seulement dans une hotte chimique. </li><li> À la fin enlever le coversl microélectrodeside du flacon de réaction, rincer avec de l&#39;éthanol puis à l&#39;eau et à sec sous un courant d&#39;azote. </li></ol> 7. R-uCP de anneau intérieur et SI-ATRP de PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Effectuer les étapes uCP-R tel que précédemment décrit dans les étapes 3.2 et 03.06 à 03.12, en substituant un timbre de PDMS à 300 um et 600 um ID OD anneaux en saillie, de telle sorte que les anneaux de petits éléments sont placés à l&#39;intérieur des anneaux précédemment microélectrodes. REMARQUE: Le seuil de pression pour ce timbre est de 132,0 kPa. Comme mentionné précédemment, ces réglages de pression sont optimisés pour les caractéristiques de timbre utilisés dans cette expérience. </li><li> Effectuer les étapes SI-ATRP comme précédemment décrit dans les étapes 04.01 à 04.04. </li></ol> 8. acétylène fonctionnalisation des chaînes microélectrodes PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Placez coverslide microélectrodes dans 20 ml de réaction flacon en verre. </li><li> Ajouter 6 ml de DMSO contenant 100 mMpropargylamine dans le flacon de réaction. Maintenir cette réaction à température ambiante pendant 24 h. REMARQUE: Manipulez DMSO et propargylamine seulement dans une hotte chimique. </li><li> À la fin enlever le coverslide microélectrodes du flacon de réaction et rincer avec de l&#39;éthanol puis à l&#39;eau et à sec sous un courant d&#39;azote. </li></ol> 9. Cuivre catalysée &quot;Cliquez sur&quot; Biotinylation d&#39;acétylène Terminé Chaînes PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Placez coverslide microélectrodes dans 20 ml de réaction flacon en verre. </li><li> Ajouter 6 ml de sulfate de cuivre (15 mM) / Tris [(1-benzyl-1 H -1,2,3-triazole-4-yl) méthyl] amine (TBTA, 30 mM) (1: / v 1 v eau / DMF) contenant 562 uM de l&#39;azoture de PEG-4 -Biotin conjugué dans le flacon de réaction. Ajouter 1,2 ml d&#39;acide L-ascorbique (0,15 mM) dans de l&#39;eau au mélange pour initialiser la réaction. </li><li> Bubble azote à travers la solution de réaction pendant 10 sec, sceller la fiole avec du parafilm, et réagir pendant 24 heures à température ambiante. </li><li> Lors des achèvementsn enlever coverslide microélectrodes du flacon de réaction, rincer avec de l&#39;eau et placez-le dans une boîte en polystyrène de 12 puits. </li></ol> 10. immunofluorescence détection biotinylé Groupes d&#39;acétylène <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bloquer coverslide microélectrodes dans DPBS (3% âne sérum) pendant 1 heure à température ambiante. Teinture pour les groupes acétylène biotinylés avec de la streptavidine-546 conjugué (2 pg / ml) dans SPD (3% de sérum d&#39;âne dans PBS) pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Rincer coverslide microélectrodes 5 fois avec DPBS pendant 10 min avec agitation douce. REMARQUE: la figure 4B représente une image de la diapositive après cette étape est terminée. </li></ol> 11. cuivre-libre &quot;Cliquez sur&quot; Biotinylation d&#39;azoture Terminé Chaînes PEGMEMA Remarque: Si on le souhaite, cette étape de modification du substrat peut être réalisé in situ au cours de la culture cellulaire. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Laissez coverslide microélectrodes dans 12 puits pplat olystyrene SPD après rinçage. </li><li> Ajouter 2 ml de SPD (ou milieux de culture cellulaire contenant 20 uM) DBCO PEG-4 -Biotin, et laisser cette réaction se poursuivre pendant 24 heures à température ambiante (ou à 37 ° C dans un incubateur). </li><li> À la fin, rincer coverslide microélectrodes 5 fois avec DPBS (ou simplement effectuer un changement de support). </li></ol> 12. immunofluorescence détection biotinylé groupes azoture <ol style="margin-left: 40px;"><li> Teinture pour les groupes azide biotinylés avec un conjugué streptavidine-488 (2 pg / ml) dans 2 ml de DPBS (3% de sérum d&#39;âne) pendant 2 h à température ambiante. </li><li> Rincer coverslide microélectrodes 5 fois dans DPBS pendant 10 min avec agitation douce. </li><li> Image microélectrodes coverslide utilisant la fluorescence confocale microscope. Figure 4A-C représente les images de la diapositive après cette étape est terminée. REMARQUE: Lors de l&#39;utilisation de substrats pour des essais de culture de tissus, sauter des sections 10 et 12 du présent protocole. Après le degre souhaitéee de fonctionnalisation, stériliser le coverslide conçu par rinçage les deux faces avec 100% d&#39;éthanol et le séchage sous un courant d&#39;azote. Placer les lames dans une enceinte de sécurité biologique stérile et rincer la lame avec PBS cinq fois avant de procéder à l&#39;ensemencement et à la culture cellulaire. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments.">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li><li>Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+printing+for+high-throughput+cell+patterning.">Inkjet printing for high-throughput cell patterning.</a> Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).</li><li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials.">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp.">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Substrats Idéal pour l&#39;ingénierie tissulaire seraient bioinspirée et ainsi récapitulent la répartition spatiale des ligands bioactifs essentiels trouvés dans les tissus natifs. Ils seraient également posséder des propriétés dynamiques qui permettent des ajustements temporels des ligands et les structures spatiales dans lequel elles sont présentées pour permettre la morphogenèse du tissu réalisé et l&#39;espace restreint induction du destin cellulaire. Fabrication de ces substrats nécessite l&#39;immo...

La capacité des surfaces PEG greffées à afficher ligands biochimiques liés de manière covalente tout en maintenant les propriétés inhérentes non-fouling font un choix idéal pour les environnements à micro-ingénierie personnalisés sur des substrats de culture 1,2,3. Les interactions biospécifiques à médiation par un ligand conjugué PEG permet de brosses analyse réductrice des effets des signaux biochimiques qui se trouvent dans des micro-environnements complexes dans des tissus in vivo sur des phénotypes cellulaires individuelles. En outre, la chimie bio-orthogonal «clic» peut être utilisé pour faciliter l&#39;immobilisation de ligands directionnel de sorte qu&#39;ils sont présentés dans les conformations natives 6.4. Ainsi, la structuration spatiale microscopique de PEG brosses est un outil polyvalent pour créer concepteur dans des niches in vitro pour étudier la signalisation cellulaire induite par 6,7 signaux biochimiques immobilisés. Une méthode courante pour générer des motifs spatiaux de cu biochimiquees entraîne l&#39;impression par microcontact (uCP) substrats d&#39;or revêtu avec des motifs de PEG alcanethiols conjugués. Ensuite, les monocouches microélectrodes auto-assemblées (SAM) d&#39;alcane-thiols de PEG-ylated restreint adsorption physique des molécules biochimiques, par exemple, des protéines, uniquement à des régions non-motif du substrat 8,9. Cependant, les SAM générés par cette technique sont sensibles à l&#39;oxydation à long terme des milieux de culture cellulaire. Ainsi, μCP&#39;d alkanethiol SAM sont souvent plus greffé avec brosses de polymères de PEG par transfert d&#39;atomes de surface initié polymérisation radicalaire (SI-ATRP) pour augmenter la stabilité non-fouling 10 de la région. Plus précisément, uCP de l&#39;initiateur de polymérisation alcanethiol, ω-meraptoundecyl bromoisobutyrate, sur des surfaces revêtues d&#39;or, suivie par SI-ATRP de poly (éthylène glycol) méthyl méthacrylate de l&#39;éther (PEGMEMA) monomères génère des surfaces ayant une longue durée microélectrodes, stable et non encrassement PEG brosses. En outre, ceux-ci<html> sont susceptibles d&#39;être davantage modifiée pour présenter des fractions chimiques divers 11. Profitant de cette propriété, et Sha. al. développé une méthode pour concevoir des substrats de culture avec des brosses de PEGMEMA plusieurs composants chimiques présentant orthogonales &quot;clic&quot;. Dans ce procédé, on utilise une série d&#39;étapes uCP / SI-ATRP intercalées avec de l&#39;azoture de sodium séquentiel, l&#39;éthanolamine, la propargylamine et substitutions nucléophiles pour créer des substrats de culture présentant des motifs micrométriques de plusieurs ligands immobilisés 6. Bien que la possibilité d&#39;utiliser de telles compositions chimiques, en liaison avec uCP manuel pour concevoir de nouveaux substrats de culture est immense, elle est limitée par la précision et l&#39;exactitude avec laquelle de multiples étapes de uCP peuvent être alignés sur un même substrat. Un niveau élevé de précision et d&#39;exactitude serait nécessaire à la fabrication reproductible complexe dans des niches in vitro utilisant ces techniques polyvalents. e_content &quot;&gt; Pour remédier à cette limitation, plusieurs systèmes de uCP automatiques et semi-automatiques ont été générés. Chakra et. al. développé un système uCP dans laquelle timbres personnalisés sont placés sur un système de rail et mis en contact conforme avec lames d&#39;or revêtue par un vérin pneumatique commandé par ordinateur. Cependant, cette méthode nécessite la fabrication précise des motifs de timbres personnalisés et signale une précision de 10 um sans rapport de la précision obtenue lors de l&#39;exécution multiple uCP étapes 12. Plus récemment, une méthode utilisant un système intégré de couplage cinématique précision indiquée au-dessous de 1 um en utilisant un modèle unique, mais ont été incapables d&#39;aligner avec précision plusieurs motifs en raison d&#39;un manque de contrôle précis des caractéristiques de timbre de moule pour mouler 13. En outre, les deux procédés antérieurs exigent le substrat reste fixe entre les étapes de mise en forme , ce qui limite considérablement la diversité des compositions chimiques de modification de surface qui peuvent êtreutilisé. Ici, nous décrivons un système R-uCP automatisé capable d&#39;alignement exacte et précise de plusieurs étapes de uCP tout en permettant une flexibilité maximale dans la conception et la fabrication timbre. En outre, les substrats peuvent être retirés à motifs à plusieurs reprises à partir de pièces estampées entre le système, ce qui permet l&#39;utilisation de diverses compositions chimiques de modification du substrat, y compris les substitutions nucléophiles séquentielles. L&#39;utilisation de tels substrats modifiés chimiques ont été utilisées pour la culture de cellules préalablement à la fois par nous et d&#39;autres 6,14 7. Par conséquent, nous avons fusionné R-uCP et des réactions de substitution nucléophiles séquentielles de développer un procédé de fabrication évolutive de substrats de culture avec des indices biochimiques complexes et microélectrodes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:185px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:185px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">SCARA&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Epson</td>
			<td style="width:185px;">LS3-401ST</td>
			<td style="width:185px;">Higher end models with increased precision are available if desired.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:185px;">(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE</td>
			<td style="width:185px;">Gelest</td>
			<td style="width:185px;">SIT8174.0</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:185px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:185px;">Ellsworth Adhesive Co</td>
			<td style="width:185px;">NC9020938</td>
			<td style="width:185px;">Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:185px;">24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">48393106</td>
			<td style="width:185px;">These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator</td>
			<td style="width:185px;">Telemark</td>
			<td style="width:185px;">SEC-600-RAP</td>
			<td style="width:185px;">Requries specialized training.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">EPSON LS3 SCARA</td>
			<td style="width:185px;">EPSON</td>
			<td style="width:185px;">LS3-401ST</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:185px;">&#969;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td>
			<td style="width:185px;">Prochimia</td>
			<td style="width:185px;">FT 015-m11-0.2</td>
			<td style="width:185px;">Store at -20&#176;C. Other ATRP initiators may be used as this R-&#956;CP platform is applicable to all micropatterning modalities.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Schlenk Tube Flask 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">Synthware</td>
			<td style="width:185px;">60003-078</td>
			<td style="width:185px;">Requires rubber stoppers with diaphram.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">447943</td>
			<td style="width:185px;">Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Methanol (Certified ACS)</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">A412-4</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Copper(II) Bromide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">437867</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">2&#39;,2-Bipyridine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">D216305</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Sodium L-Ascorbate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A4034</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">03-340-4E</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S2002</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">N,N-dimethyformamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">227056</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">398136</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Triethylamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">T0886</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">276855</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Propargylamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P50900</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">University of Wisconsin Material Distribution Services</td>
			<td style="width:185px;">2292</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Azide-PEG3-Biotin</td>
			<td style="width:185px;">ClickChemistryTools</td>
			<td style="width:185px;">AZ104-100</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in DMF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Copper(II) Sulfate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C1297</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">678937</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A7506</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:185px;">14190144</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:185px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">D9663</td>
			<td style="width:185px;">Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">12-Well Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientifit - NUNC</td>
			<td style="width:185px;">07-200-81</td>
			<td style="width:185px;">Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">DBCO-PEG4-Biotin</td>
			<td style="width:185px;">Clickchemistytools</td>
			<td style="width:185px;">A105P4-10</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in DMF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:185px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:185px;">S-11223</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate</td>
			<td style="width:185px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:185px;">S-11225</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:185px;">Nikon A1-R Confocal Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:185px;">Nikon Eclipse Ti, A1R</td>
			<td style="width:185px;">An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-&#181;cp) and sequential nucleophilic substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

L&#39;utilisation de techniques manuelles alignement de uCP à l&#39;ingénieur des substrats de culture avec des tableaux de brosses PEG-greffons fonctionnalisés avec orthogonal &quot;clic&quot; chimiques a été démontrée dans des travaux antérieurs 6. Cependant, cette offre un contrôle minimal de l&#39;orientation du motif et se traduit souvent par un chevauchement des zones fonctionnalisés. Ici, un système R-uCP roman est utilisé pour surmonter cette limitation, et sa capacité à motif avec préc...

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Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &amp;#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Fabrication de substrats de culture complexe robotisée microcontact impression (R-uCP) et substitution nucléophile séquentielle

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

fabricating-complex-culture-substrates-using-robotic-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

10.4K vues.  University of Wisconsin, Madison. Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands. 

Vidéo: Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Recherche

Bio-ingénierie

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge, arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle cells. Despite optimum drug therapy, heart failure represents a leading cause of mortality and morbidity in the developed world. A major challenge in drug development is the identification of cellular assays that accurately recapitulate normal and diseased human myocardial physiology in vitro. Likewise, the major challenges in regenerative cardiac biology revolve around the identification and isolation of patient-specific cardiac progenitors in clinically relevant quantities. These cells have to then be assembled into functional tissue that resembles the native heart tissue architecture. Microcontact printing allows for the creation of precise micropatterned protein shapes that resemble structural organization of the heart, thus providing geometric cues to control cell adhesion spatially. Herein we describe our approach for the isolation of highly purified myocardial cells from pluripotent stem cells differentiating in vitro, the generation of cell growth surfaces micropatterned with extracellular matrix proteins, and the assembly of the stem cell-derived cardiac muscle cells into anisotropic myocardial tissue.

The generation of aligned myocardial tissue is a key requirement for adapting the recent advances in stem cell biology to clinically useful purposes. Herein we describe a microcontact printing approach for the precise control of cell shape and function. Using highly purified populations of embryonic stem cell derived cardiac progenitors, we then generate anisotropic functional myocardial tissue.

Génération de tissu myocardique alignés fonctionnelle grâce à l&#39;impression par microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Fabrication de tissus de cartilage humain en utilisant trois dimensions jet d&#39;encre Technologie d&#39;impression

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

Superhydrophobes fabrication de matériaux polymères pour des applications biomédicales

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

Fabrication de dispositifs d&#39;analyse de coton

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Extension nanostructurées Substrats utilisant la technique de point pour Nanotopographical Modulation of Cell Comportement

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabrication d’un Hydrogel de dérivés de matrice extracellulaire rein Cortex

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data remains difficult because segmentation in all volumetric frames is time-consuming. We aimed to analyze joint kinematics using a sequential 3D-3D registration technique to provide the kinematics of the moving bone with respect to the fixed bone semiautomatically using 4DCT DICOM data and existing software. Surface data of the source bones are reconstructed from 3DCT. The trimmed surface data are respectively matched with surface data from the first frame in 4DCT. These trimmed surfaces are sequentially matched until the last frame. These processes provide positional information for target bones in all frames of the 4DCT. Once the coordinate systems of the target bones are decided, translation and rotation angles between any two bones can be calculated. This 4DCT analysis offers advantages in kinematic analyses of complex structures such as carpal or tarsal bones. However, fast or large-scale motions cannot be traced because of motion artifacts.

We analyzed joint kinematics from four-dimensional computed tomography data. The sequential 3D-3D registration method semiautomatically provides the kinematics of the moving bone with respect to the subject bone from four-dimensional computed tomography data.

Analyse de la ToT quadridimensionnelle à l'aide de l'enregistrement 3D-3D séquentiel

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous lipid tubules found in eukaryotic cells. However, in vivo LNTs are highly non-equilibrium structures that require chemical energy and molecular motors to be assembled, maintained, and reorganized. Furthermore, the composition of in vivo LNTs is complex, comprising of multiple different lipid species. Typical methods to extrude LNTs are both time- and labor-intensive, and they require optical tweezers, microbeads, and micropipettes to forcibly pull nanotubes from giant lipid vesicles. Presented here is a protocol for the gliding motility assay (GMA), in which large scale LNT networks are rapidly generated from giant unilamellar vesicles (GUVs) using kinesin-powered microtubule motility. Using this method, LNT networks are formed from a wide array of lipid formulations that mimic the complexity of biological LNTs, making them increasingly useful for in vitro studies of lipid biophysics and membrane-associated transport. Additionally, this method is capable of reliably producing LNT networks in a short time (&#60;30 min) using commonly used laboratory equipment. LNT network characteristics such as length, width, and lipid partitioning are also tunable by altering the lipid composition of the GUVs used for fabricating the networks.

This protocol describes a process for fabricating lipid nanotube networks using gliding kinesin motility in conjunction with giant unilamellar lipid vesicles.

Fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques multi-composants à l’aide du test de motilité de la kinésine glissante

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

Manipulation de cellules souches neurales et de neurones dans les tranches de cerveau à l’aide de microinjection robotique

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...