This work was supported by the Ogelbay fund.

1. la culture des plantes <ol><li> 6 semaines avant le trempage, remplissez pots de 5 pouces avec le sol et semer les graines de lin ¼ de pouce de profondeur dans le sol (4 graines par pot). Soyez sûr de tasser le sol sur les graines. Arrosez les plantes régulièrement et de les maintenir dans la longue lumière (la lumière de 14 h et 10 h foncé). </li><li> Vérifiez plantes régulièrement pour inflorescences primaires (clusters des organes de fleurs). Les plantes sont prêtes pour la transformation lorsque les bourgeons sont visibles et ont seulement formé dans l&#39;inflorescence (figure 1 et 2). Pour voir les bourgeons, couper les feuilles autour de lui si nécessaire. NOTE: En utilisant le meilleur stade de la floraison est critique et est détaillée dans la discussion. <ol><li> Utilisez la branche principale de l&#39;usine pour le traitement expérimental car elle produit plus de fleurs que les Branches secondaires. Utilisez les branches latérales soit comme témoins (à ne pas croisement) ou pour d&#39;autres traitements expérimentaux. </li><li> Vous pouvez également utiliser les principales et secondaires branches de lamême usine pour le traitement expérimental et utiliser une autre usine comme un contrôle ou pour d&#39;autres traitements expérimentaux. Utilisez des étiquettes pour marquer différentes branches et de fleurs individuelles avec la date et le type de traitement. </li></ol></li></ol> 2. Clonage et à la transformation dans Escherichia coli (E. coli) Cellules <ol><li> Cloner le fragment / gène d&#39;intérêt dans le site de clonage multiple d&#39;un vecteur binaire de plante hébergeant l&#39;ADN-T. <ol><li> Effectuer le clonage en une étape ou deux étapes. <ol><li> Cloner directement petits inserts dans ce protocole (~ 500 pb) dans le vecteur binaire de plante. Dans ce protocole, utiliser le vecteur binaire de plante (PRI909). Sinon, utiliser d&#39;autres vecteurs binaires de plantes dans une stratégie similaire. </li><li> Alternativement, cloner de grands inserts (≥6.5 ko) en deux étapes: d&#39;abord en utilisant un kit de clonage commerciale générale (pas planter spécifique), puis sous-cloner dans le vecteur binaire de plante. </li></ol></li></ol></li><li> Mettre en place un réac PCRtion pour amplifier le gène d&#39;intérêt. Conception des amorces avec des sites de restriction à l&#39;extrémité 5 &#39;(en fonction du site de clonage multiple du vecteur binaire de plante en cours d&#39;utilisation). <ol><li> Effectuer une PCR standard utilisant de l&#39;ADN de lin génomique avec les conditions de cyclage suivantes: une prise initiale de 24 ° C, puis 2 min à 94 ° C, suivie de 30 cycles de 98 ° C pendant 5 s, 60 ° C pendant 15 sec, et 72 ° C pendant 2 min. Effectuer une étape d&#39;extension finale à 72 ° C pendant 5 minutes suivie d&#39;une attente indéfinie à 4 ° C. </li><li> Produits de PCR séparées sur 1% Tris / borate / EDTA (TBE) gel d&#39;agarose, courent le gel à 100 V pendant 1 h. Purifier les produits du gel et de quantifier via Nanodrop. </li></ol></li><li> Mettre en place le mélange de ligature pour cloner le produit de PCR dans le vecteur de clonage commercial. Suivez le protocole du fabricant. </li><li> Transformer le mélange de ligature dans E. chimiquement compétente cellules de E. coli comme suit. <ol><li> Ajouter 2 ul du mélange de ligature dans une fiole de chE. émiquement compétente cellules de E. coli. Incuber sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Choc thermique des cellules pendant 30 secondes à 42 ° C (chaleur heure de choc et de la température dépend du type de cellules utilisé). </li><li> Incuber sur de la glace et ajouter 250 microlitres de RT super bouillon optimale avec la répression catabolique (SOC) moyen. </li><li> Boucher le tube et incuber dans un agitateur orbital à 200 tpm à 37 ° C pendant une heure. </li><li> Étaler 10-50 ul de chaque transformation sur une plaque préchauffée LB (préchauffé à 37 ° C) + antibiotique sélectif approprié (déterminer l&#39;antibiotique sélectif basé sur le type de vecteur de clonage commercial utilisé). Incuber les plaques à 37 ° CO / N. </li></ol></li><li> Choisissez ~ 10 colonies pour mini-prep purification de plasmide, utilisant un kit commercial. Mini purification prep de plasmide est généralement effectuée de la manière suivante. REMARQUE: Les noms tampons sont spécifiques à la trousse commerciale utilisée mais leurs fonctions générales sont semblables. <ol><li> Inoculer les colonies isolées dans deux- 5 ml du milieu LB contenant l&#39;antibiotique de sélection approprié (déterminé sur la base du type de vecteur utilisé commercial). </li><li> Incuber pendant environ 8 heures à 37 ° C avec une agitation vigoureuse (~ 300 rpm). </li><li> Récolter les cellules par centrifugation à 6000 xg pendant 10 min. </li><li> Reprendre le culot dans le tampon de remise en suspension 250 ul. Mélanger et vortex pour disperser complètement la pastille. </li><li> Les Lyse des cellules bactériennes en ajoutant 250 pi du tampon de lyse, mélanger soigneusement en inversant les tubes 4-6 fois. </li><li> Neutraliser le lysat dans le tampon de neutralisation et inverser 4-6 fois pour mélanger. Centrifugeuse pendant 10 min à ~ 17 900 xg sur une microcentrifugeuse de table. </li><li> Transférer les surnageants provenant de l&#39;étape précédente à une colonne de centrifugation. Nouveau Centrifugeuse à ~ 17 900 g pendant 30 à 60 sec. </li><li> Laver la colonne de centrifugation en ajoutant 0,75 ml de tampon de lavage et centrifuger pendant 30 - 60 secondes. Jeter le accréditives. </li><li> Centrifugeuse pour un supplément de 1 min à Remove tampon de lavage résiduelle. Placer la colonne spin dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse propre. Pour éluer l&#39;ADN, ajouter de l&#39;eau de 50 ul au centre de chaque colonne. Laisser reposer pendant 1 min et centrifuger pendant 1 min. </li></ol></li></ol> 3. Analyser le purifiée plasmides pour la présence de l&#39;insert <ol><li> Restriction Digest: <ol><li> Mettre en place une digestion de restriction pour déterminer la présence de l&#39;insert par digestion du plasmide avec les enzymes de restriction utilisés pour cloner l&#39;insert. Un double digest restriction typique réaction comme suit: 1 ug de plasmide purifié, 1 ul de chaque enzymes de restriction, 2 pi de tampon 10x digestion de restriction + 2 ul de BSA (le cas échéant), X pi d&#39;eau (pour un total de 20 ul) </li><li> Mélanger doucement et incuber à température recommandée (varie d&#39;une enzyme à l&#39;autre). </li><li> Analyser le digestion de restriction réaction de 1% gel d&#39;agarose TBE, fonctionner à 100 V pendant 1 heure et cherchez abandon de taille appropriée. </li></ol></li><li> L&#39;analyse par PCR: <ol><li> Mettre en place une PCR avec le plasmide purifié, en utilisant des amorces à partir de la région du vecteur commercial pour amplifier l&#39;intérieur de l&#39;insert ou de la jonction entre le vecteur et l&#39;insert. Amorces communes sont M13 avant et arrière et des amorces T3 / T7. </li><li> Dans ce protocole, en utilisant les conditions de cycle de PCR suivantes: un maintien initial de 24 ° C, puis 2 min à 94 ° C, suivie de 18 cycles à 98 ° C pendant 5 s, 60 ° C pendant 15 sec, et 72 ° C pendant 2 min. Effectuer une étape d&#39;extension finale à 72 ° C pendant 5 minutes suivie d&#39;une attente indéfinie à 4 ° C. </li><li> produits de PCR de charge sur un gel agarose à 1% TBE et exécutés pour 100 à 120 V pendant 1 h. </li></ol></li><li> Séquençage: <ol><li> Envoyer le plasmide purifié dans une installation de séquençage commercial à analyser et à confirmer la présence de l&#39;insert. </li><li> Une fois la construction correcte est obtenue, l&#39;utiliser pour la deuxième étape du clonage (dans l&#39;usine de vecteur binaire). REMARQUE: Les étapes 02.03 à 03.03peut être éliminé si le clonage est réalisé en une seule étape. </li></ol></li></ol> 4. Clonage dans l&#39;usine vecteur binaire (PRI909) et E. coli Transformation <ol><li> Mettre en place une double digestion de restriction réactions de linéariser le vecteur binaire de plante et d&#39;isoler l&#39;insert préalablement clonée en utilisant les mêmes sites de restriction qui ont été ajoutés aux amorces (étape 2.2). </li><li> Analyser les digestions de restriction par électrophorèse sur gel, de fonctionner à 100 V pour une à deux heures. Couper l&#39;insert et l&#39;usine vecteur binaire linéarisé du gel. </li><li> Utilisez un kit commercial pour purifier les produits de gel. Consultez le manuel du fabricant. </li><li> Mettre en place une réaction de ligature pour ligaturer l&#39;insert dans le vecteur binaire de plante. L&#39;insert de rapport de vecteur dépend de la taille de l&#39;insert et le vecteur binaire de plante. Dans ce protocole, l&#39;insert de 6,5 kb était LIS1 et la plante vecteur binaire était 9 kb. Par conséquent, utiliser un 1: 2 insert ratio de vecteur. </li><li&gt; Répétez les étapes de 2,4 à 3 pour la transformation bactérienne, la purification et l&#39;analyse plasmidique. Une fois la construction correcte (+ insert usine vecteur binaire) est obtenu, passez à l&#39;électroporation à l&#39;étape 5. </li></ol> 5. L&#39;électroporation dans des cellules d&#39;Agrobacterium tumefaciens électrique compétentes <ol><li> Décongelez un flacon de Agrobacterium tumefaciens cellules compétentes électriquement sur ​​la glace. </li><li> Ajouter 1 ng d&#39;ADN vecteur plasmidique binaire 20 ul de cellules compétentes, sur la glace, et mélanger doucement. </li><li> Réfrigérer un 0,1 cm cuvette d&#39;électroporation sur la glace. </li><li> Transférer le mélange cellules / ADN compétent pour les cuvettes d&#39;électroporation et touchez pour recueillir le mélange au fond. Placer la cuvette dans la machine d&#39;impulsion d&#39;électroporation et (conditions de tension et de temps dépendent de la taille de la cuve et électroporateur utilisé). </li><li> Ajouter 1 ml de milieu SOC et les cellules de transfert à un tube de 15 ml. </li><li> Incuber pendant 1 heure à 28-30° C, en agitant à 100 rpm. Planche 50 - 100 pi de cellules sur de la gélose LB + antibiotique sélectif approprié (dépendent du plasmide binaire végétal et la souche d&#39;Agrobacterium utilisés dans ce protocole une utilisation 50 ug / ml de kanamycine et 100 ug / ml de streptomycine.). </li><li> Incuber les plaques jusqu&#39;à 48 heures à 28-30 ° C. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.5 pour la sélection de la colonie et la purification du plasmide. </li><li> Répétez l&#39;étape 3 pour analyser le plasmide et de vérifier l&#39;intégrité de l&#39;insert et l&#39;ADN-T avant d&#39;utiliser la construction pour Fleuri-trempage. Répétez l&#39;étape 3.2, en utilisant des amorces de PCR multiples à travers la région d&#39;insertion et l&#39;ensemble de toutes les régions d&#39;ADN-T et par séquençage comme à l&#39;étape 3.3. NOTE: Dans ce protocole quatre amorces différentes ont été conçues dans l&#39;ADN-T et 10 amorces à travers l&#39;insert. </li><li> Une fois la présence de la plante plasmide binaire dans la colonie Agrobacterium sélectionnée est confirmée, place des cellules in 50% de glycérol et conserver à -80 ° C. Magasin restant colonies sur la plaque à 4 ° C si elles doivent être utilisées dans la semaine 7. </li></ol> 6. Floral-trempage REMARQUE: deux jours avant Floral-trempage: <ol><li> Cultiver des cellules d&#39;Agrobacterium pour la phase stationnaire (DO600 comprise entre 0,5 - 1 est acceptable) dans du LB + antibiotiques appropriés dans des milieux liquides. NOTE: Ce sont le même antibiotique comme dans l&#39;étape 5.6, basé sur le vecteur binaire de plante et le type de souche d&#39;Agrobacterium utilisée. </li><li> Lancer la culture à 1: 100 dilutions d&#39;un saturée (5 ml) O / N et la culture croître pendant 24-48 heures à 28-30 ° C tout en agitant à 150 tours par minute. La culture devrait avoir atteint la phase midlogarithmic et plus susceptibles sera approchant ou à une phase stationnaire. OD d&#39;environ 0,8 (nouveau OD entre 0,5 à 1 sont tous acceptables) 8. Recueillir les cellules par centrifugation à 5000 xg à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans un milieu d&#39;infiltration (5,0% de saccharose + de 0,05 à 0,003% Silwet L-77). Pour le premier tour de trempage, utiliser 0,05% Silwet-77. Pour les deuxième et troisième rondes, réduire la concentration à 0,03% (détaillées au Discussion). </li><li> Passez à l&#39;étape floral creux. Placez la plante sur le côté et tremper seulement les bourgeons visibles dans le milieu de l&#39;infiltration pendant 1-2 min. Laissez la plante sur le côté et le couvrir d&#39;une pellicule plastique pour maintenir une forte humidité dans le dôme (Figure 3). </li><li> Le lendemain, placer la plante dans une position verticale et maintenir normalement. </li><li> Lorsque le bourgeon grandit (généralement après environ 10-14 jours), répétez les étapes 6.1 à 6.4. Réduire le temps d&#39;immersion de 30 à 60 sec et la concentration Silwet-77 à 0,003%. </li><li> Maintenir les plantes normalement jusqu&#39;à ce que leurs graines sont mûrs et prêts à être collectés (Figure 4). </li></ol> 7. Sélection de positif TraPCR directe avec nsformants <ol><li> Semez les graines de T1 sur le sol comme dans l&#39;étape 1.1. <ol><li> Sinon, assurez-Murashige et Skoog de sel basale (milieu MS) en ajoutant 2,2 g de milieu MS + 4 g d&#39;agar-agar dans 500 ml d&#39;eau. Autoclave et verser dans des petits pots de plantes. Conserver à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Semez les graines en les plaçant sur le milieu MS solidifié. Conserver sous la lumière du jour à long (de lumière 14 h et 10 h d&#39;obscurité). Les graines germent en environ 4-6 jours (figure 5). </li><li> Utilisez une graine de chaque fleur comme un point de départ. Si aucun transformant positif est obtenu, répétez cette étape en choisissant une autre graine de la fleur. Note: le test graines différentes des mêmes fleurs, car dans certains cas pas toutes les graines d&#39;une fleur seront transformées. Sélection semences supplémentaires à partir de fleurs expérimentales est parfois nécessaire. </li></ol></li><li> Arrivée sur les plants régulièrement. Dans environ 10 à 14 jours après la germination, lorsqu&#39;il est vrailaisse développer, tester les plantes avec la PCR directe. </li><li> Préparer l&#39;extrait d&#39;ADN de feuilles en coupant 2-3 feuilles (5-10 mg en poids) de chaque plant et les placer dans un tube à centrifuger. </li><li> Ajouter 180 ul de NaOH 50 mM à chaque tube, et incuber pendant 10 min à 95 ° C. </li><li> Neutraliser l&#39;extrait par addition de 20 pl de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0). </li><li> Utiliser une pi de l&#39;extrait dans la réaction directe de PCR, utilisant des amorces conçues pour l&#39;ADN-T ou l&#39;insert (figure 7), pour sélectionner les transformants positifs. <ol><li> Dans ce protocole, utiliser PCR directe avec une prise initiale de 24 ° C, puis 2 min à 98 ° C, suivie de 40 cycles de (98 ° C pendant 10 sec, l&#39;étape de recuit pendant 15 secondes, et une étape d&#39;extension à 68 ° C). Effectuer une étape d&#39;extension finale à 68 ° C pendant 5 minutes suivie d&#39;une attente indéfinie à 4 ° C. (Voir le tableau 1 pour plus de détails sur les amorces, des températures de recuit et les temps de vulgarisation pour les cycles). </li></ol></li><li> Identifier les transformants positifs et les cultiver à l&#39;échéance. Si les graines ont été mises à germer dans un milieu MS, greffe sur le sol dans un pot plus grand (Figure 5). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dans certaines espèces végétales, telles que le lin (Linum usitatissimum), la transformation de plantes avec succès a été limité. Auparavant, la transformation du lin a exigé une infection par Agrobacterium en blessant et co-culture, appliquer des particules biolistiques ou en utilisant des ultrasons sonication, suivie par la régénération; un processus qui est à la fois long et sujettes à être accompagné par de nombreux événements de mutation. En outre, le procédé de sélection de ces techniques nécessite l&#39;utilisation de marqueurs de sélection d&#39;antibiotiques tels que la kanamycine. Cependant, il a été noté dans la littérature que cette méthode de sélection produit un grand nombre de faux positifs, comme le lin a tendance à se échapper de fortes concentrations d&#39;antibiotiques 6,9,14. Un autre inconvénient des techniques précédentes dans la transformation de lin a été le taux de transformation de faibles 2,6. Dans le protocole décrit ici, Agrobacterium transformation végétale médiée par trempage floral a été montrépour aboutir à un taux de transformation élevé pour le lin (50 - 60%). Les transformants ont été obtenus à partir de fleurs de croisement et recueillies auprès des principales et secondaires branches. Sélection de transformants positifs a été fait simplement en cultivant des plantes T1 sur le sol et le dépistage leurs feuilles dès qu&#39;elles ont germé, sans passer par l&#39;utilisation de la sélection antibiotique, une étape précédemment utilisé comme norme dans floral creux pour d&#39;autres espèces de plantes. En effectuant des essais de PCR directe de feuilles, et en utilisant les amorces d&#39;ADN-T appropriées, des transformants positifs peuvent être rapidement sélectionnées. Cette technique est simple, peu coûteux et facile à réaliser, mais donne un taux de transformation beaucoup plus élevés que ceux précédemment rapportés pour Arabidopsis et d&#39;autres espèces de plantes en utilisant cette méthode 1,10,12. Ce est aussi le taux de transformation la plus élevée signalée pour le lin. Cependant, il ya des étapes critiques dans les procédures, y compris la sélection de la meilleure stade de la floraison et la meilleure concentration en tensioactif, de sorte queAgrobacterium peut pénétrer dans les cellules de plante sans tuer les organes floraux. Si un stade précoce des boutons est utilisé (figure 2A) avec une concentration élevée Silwet-77 de plus de 0,05%, la fleur ne se développera pas, ni mettre en graines. Si stade tardif des bourgeons est utilisé (figure 2C), bien que la transformation pourrait fonctionner, il va se produire à un rythme beaucoup plus faible. Des résultats similaires ont été obtenus avec Arabidopsis dip floral transformation 1,4. Pour ce protocole, toutes les étapes floraux ont été testés avec différents Silwet-77 concentrations et le meilleur stade était déterminé à être le stade du bouton du milieu (figure 2C) avec Silwet-77 à 0,05% pour la première immersion, suivie d&#39;une seconde immersion au la fin du stade du bourgeon (figure 2C) avec une concentration Silwet-77 légèrement réduit de 0,03%. La transformation a également bien fonctionné en utilisant le stade du bouton (Figure 2A) avec une faible concentration Silwet-77 de 0,003%, suivie parun deuxième trempage avec stade du bouton du milieu (figure 2B) à une concentration plus élevée Silwet-77 de 0,05%. Dans ce protocole, d&#39;autres paramètres ont été tentées pour optimiser le taux de transformation, mais je ai trouvé ne avoir aucun effet sur le résultat final. Les exemples incluent proroge le délai après trempage que les plantes mettent sur leur côté et couverts en plastique d&#39;une journée à deux jours; en utilisant une DO de plus de 1 pour la culture d&#39;Agrobacterium, au lieu de 0,5 à 1; l&#39;augmentation du temps d&#39;immersion de 5 à 15 min au lieu de 1 à 2 min. Encore une fois nous ne avons pas remarqué aucun effet sur le taux de transformation à l&#39;aide de ces stratégies. Les facteurs les plus efficaces, cependant, ont été trouvés à l&#39;aide de plantes saines aux stades de fleurs correctes, et en utilisant la meilleure concentration Silwet-77. Nous avons remarqué que deux intervalles de trempage, fonctionne en quelque sorte mieux que une seule fois, même si une immersion de temps fonctionne aussi. Modification de ce protocole peut être atteint par Reducing la concentration Silwet-77 à aussi peu que 0,003% dans le deuxième ou le troisième trempage. Depuis Silwet-77 est toxique, une trop forte concentration entraîne les fleurs développent mal, résultant en un rien de rendement en graines. La fréquence d&#39;immersion peut être réduit à un, avec les deuxième ou troisième événements éliminés si les plantes ne sont pas à la recherche en santé et les bourgeons ne se développent pas bien. Une limitation majeure de cette technique est le faible nombre de fleurs produites par le lin, le nombre limité de graines obtenues à partir de chaque fleur, et le cycle de lin longue durée de vie. Il prend 6-8 semaines à partir de semis d&#39;avoir les bourgeons primaires prêts pour la première immersion et un 8 supplémentaires - 10 semaines post-trempage pour se rendre à la génération T1. Au total, une gamme de 5 - 6 mois est nécessaire pour obtenir la génération T1. Contrairement à d&#39;autres espèces de plantes, qui fleurissent à tout moment de l&#39;année, certaines variétés de lin fleur mieux à des moments précis de l&#39;année. Donc, la planification réfléchie pour cette technique est important. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En résumé, nos résultats d&#39;immersion florale avec deux variétés de lin différents: le lin textile, Stormont Cirrus (de plastique souple et), et le lin oléagineux, Bethune (stable et non réactive), montrent que Agrobacterium - transformation de plante médiée par immersion florale est une méthode applicable et efficace pour la transformation de lin et peut être utilisé pour remplacer les techniques précédemment utilisées pour la transformation du lin. Les modifications de la méthode floral creux dans ce protocole seront en vigueur pour une utilisation avec d&#39;autres espèces végétales et non limité à lin.

Lin (Linum usitatissimum) est une culture importante largement cultivé pour ses fibres et les huiles. La transformation du génome de lin est possible avec des techniques telles que la blessure, infection par Agrobacterium, et la co-culture dans une culture de tissu, à appliquer des particules biolistiques ou des ultrasons sonication suivie d&#39;une régénération. Cependant, ces techniques présentent de nombreux inconvénients, notamment la propension à de nombreux événements de mutation et une période prolongée afin d&#39;obtenir les lignées transgéniques. Certaines de ces méthodes peuvent également être coûteux et nécessitent une manipulation efficace du métier et des instruments, ce qui entraîne des plants de récupération faible. Plus important encore, ces techniques entraînent souvent des taux de transformation de faibles 2,6. Agrobacterium transformation de plante médiée par l&#39;intermédiaire floral creux est une approche simple et efficace pour générer des plantes transgéniques. Il a été utilisé avec succès et de façon routinière pour de nombreuses espèces de plantes telles que Arabidopsis Thalianun 1,4, Medicago truncatula 11, 12 tomate, le blé et le maïs 13 10. Cependant, il n&#39;a pas été considéré comme une technique viable pour la transformation du lin en raison de plusieurs facteurs, tels que le faible nombre de fleurs produites par le lin, le nombre limité de graines obtenues à partir de chaque fleur, la grande taille des semences, et la couche épaisse, qui peut aussi être problématique pour un tel procédé de transformation génétique. En outre, le segment de sélection de la technique floral creux nécessite la germination des graines transformées sur un support végétal contenant un antibiotique, avec descendances transformées distingués en fonction de leur capacité à germer et rester vert, alors que les descendants non transformée, soit ne pas germer ou germer, mais l&#39;eau de Javel rapidement et mourir. Dans la littérature actuelle, il a été noté que de type sauvage lin a tendance à échapper à forte concentration de sélections antibiotiques, produire de faux résultats positifs, et de faire la sélection des descendances T1 basesur la résistance aux antibiotiques plus difficile 6,14. En outre, quand une forte concentration d&#39;antibiotique a été ajouté au milieu de sélection, le taux de transformation a chuté considérablement observée neuf. Dans ce protocole, nous avons utilisé la méthode Agrobacterium et floral creux de transformer une ligne de lin textile, Stormont Cirrus (réactif et plastique), qui a été montré pour répondre aux contraintes de l&#39;environnement en modifiant son génome 3,5. Pour surmonter le problème d&#39;échappement antibiotique, nous avons choisi de faire des tests PCR directe de l&#39;ADN à partir de feuilles de T1, au lieu de la sélection en ajoutant l&#39;antibiotique aux médias de l&#39;usine. Nous avons profité de simple anatomie de lin pour suivre fleurs spécifiques au moment du traitement. Ce système de suivi a permis la sélection des graines de fleurs et la germination spécifiques sur le sol sans ajouter antibiotique. Transformants positifs ont été tout simplement identifiés par des tests ADN obtenu à partir de feuilles en utilisant le rapide et efficace méthode of PCR directe. Nos résultats démontrent que la méthode floral creux fonctionnait très bien dans cette ligne de lin et étonnamment abouti à un taux de transformation très élevé (50-60%), le plus élevé que ceux précédemment observés pour Arabidopsis thaliana, qui a été signalé à être de 0,1 à 1 1%, et aussi élevés que d&#39;autres espèces végétales 10,12. Nous avons également testé une autre variété de lin (lin oléagineux), Bethune (stable et non réactive), et nos données préliminaires indiquent que floral creux travaille également pour cette variété de lin. L&#39;objectif de ce protocole est de montrer que Agrobacterium et floral creux peuvent être utilisés pour générer le lin transgénique. On montre que cette technique est simple, peu coûteuse et plus rapide que d&#39;autres méthodes de transformation de lin. Plus important encore, il en résulte un taux de transformation beaucoup plus élevé que les autres méthodes de lin 2,6 transformation. L&#39;anatomie d&#39;Arabidopsis thaliana, qui a beaucoup de branches et de fleurs, makes difficile de distinguer trempé et non trempé fleurs sur la même plante. Par conséquent, un grand nombre de graines, environ 20 000 graines par plante, doivent subir un dépistage pour identifier les transformants positifs 8. Lin, d&#39;autre part, a moins de branches (une branche principale et quelques branches latérales) et moins de fleurs, produisant environ 100 graines par les plantes, ce qui permet de suivre les fleurs individuelles et pour sélectionner semences spécifiques pendant le processus de dépistage. Nous proposons que floral creux est une méthode applicable à transformer des espèces apparentées de lin, un genre d&#39;environ 200 espèces. Cette méthode donne des taux de transformation beaucoup plus élevés que d&#39;autres méthodes de transformation de lin. Nous proposons également que le dépistage PCR directe de l&#39;ADN T1 feuille est un moyen efficace de résoudre le problème de l&#39;évasion de la résistance aux antibiotiques qui produit souvent de nombreux faux positifs. Criblage PCR directe peut être appliquée à toutes les autres espèces de plantes et ne est pas limitée to lin. La technique simple de suivi de semences employée dans ce protocole peut être appliqué à d&#39;autres espèces de plantes avec ramification anatomie similaire à lin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#34; pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potting soil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">greenhouse with appropriate light setting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose gel electropheresis equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital imaging setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silwet-77&#160;</td>
			<td>LEHLE SEEDS</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>Toxic, wear gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Green Master Mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>Part# 9PIM712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terra PCR Direct Polymerase Mix</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">639270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binary vector PRI 909</td>
			<td>Takara</td>
			<td align="right">3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E</td>
			<td>Takara&#160;</td>
			<td align="right">9115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TOPO TA cloning kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K4595-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose&#160;</td>
			<td>fischer scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">electroporator and cuvettes</td>
			<td>bio-Rad</td>
			<td>165-2092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spinner&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">platic wrap and aluminum foil wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">speedSTAR DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR070A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QlAquick gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN plasmid mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">12123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3138S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SacI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murashige Skoog</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>fisher scintific</td>
			<td>A360-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate

Agrobacterium transformation de plante médiée par immersion florale est une technique largement utilisée dans le domaine de la transformation des plantes et a été rapporté comme étant efficace pour de nombreuses espèces végétales. Toutefois, le lin (Linum usitatissimum) par transformation floral creux n&#39;a pas été signalée. L&#39;objectif de ce protocole est d&#39;établir que la méthode Agrobacterium et floral creux peut être utilisé pour générer le lin transgénique. Nous montrons que cette technique est simple, peu coûteux, efficace, et plus important encore, donne un taux de transformation plus élevé que les méthodes actuellement disponibles de la transformation de lin. En résumé, les inflorescences de lin ont été plongées dans une solution d&#39;Agrobacterium portant un plasmide vecteur binaire (fragment d&#39;ADN-T en plus de la séquence d&#39;insertion Linum, LIS-1) pour 1 à 2 min. Les plantes ont été posées à plat sur le côté pendant 24 heures. Ensuite, les plantes ont été maintenues dans des conditions de croissance normales jusqu&#39;à ce que le traitement suivant. Les procèss d&#39;immersion a été répétée 2-3 fois, avec environ 10 à 14 jours d&#39;intervalle entre trempage. Les graines T1 ont été recueillies et mises à germer sur le sol. Après environ deux semaines, descendances traités ont été testés par PCR directe; 2-3 feuilles ont été utilisés par plante ainsi que les amorces d&#39;ADN-T appropriées. Les transformants positifs ont été sélectionnés et cultivés jusqu&#39;à maturité. Le taux de transformation est étonnamment élevé, avec 50 à 60% des semences de plantes traitées étant transformants positifs. Ce est un taux de transformation plus élevés que ceux rapportés pour Arabidopsis thaliana et d&#39;autres espèces de plantes, en utilisant la transformation floral creux. Ce est aussi le plus élevé, qui a été rapporté à ce jour, pour la transformation de lin à l&#39;aide d&#39;autres méthodes de transformation.

Figure 1-4 illustrent quelques-unes des étapes dans le protocole. Dans les figures 1 et 2, les feuilles autour des bourgeons de l&#39;inflorescence sont coupés de les exposer à des cellules d&#39;Agrobacterium et les différentes étapes de bourgeons qui ont servi à élaborer le protocole. La figure 3 montre le processus de lin floral creux. Figure 4, montre un exemple de la façon dont les principales et secondaires branches peuvent être étiquetés et comment fleurs individuelles peuvent être suivis et identifiés. Figure 5 montre comment les descendances T1 peuvent être mises à germer sur les médias MS végétales puis transplantées dans le sol de la maturité. La figure 6 illustre comment sauvage Type de lin ne peut échapper à de fortes concentrations de kanamycine, confirmant les résultats antérieurs dans la littérature 6,9,14. La figure 7 montre un exemple d&#39;amplification par PCR directe de transformants positifs T1. Les fleurs T1 ont été recueillies à partir de la main et latéraux pousses d&#39;une plante T0 unique. Comme on peut le voir à partir de la PCR directe, 8/12 plantes T1 ont été testés positifs par PCR et ont amplifié les différentes régions du T-ADN. Nos amorces ont également été conçus entre les LIS-1 insert et les sites de clonage multiples (figure 7b et C). Nous avons utilisé des amorces supplémentaires à partir du vecteur binaire de plante pour amplifier les différents segments de l&#39;ADN-T, telles que la frontière gauche et le terminateur NOS (données non présentées) ou la bordure droite et le site de clonage multiple (figure 7D). Amorces spécifiques à la LIS-1 insert ont également été utilisés dans ce protocole (données non présentées). Une liste d&#39;amorces est fourni dans le tableau 1. Cependant, les séquences de ces amorces dépend de la séquence du vecteur binaire usine d&#39;ADN-T et l&#39;insert utilisé pour le floral creux. Nous avons également constaté qu&#39;il n&#39;y avait pas de différence significative dans le taux de transformation entre les fleurs recueillies auprès des principales et secondaires branches. Figure 1. Couper les feuilles autour des bourgeons de l&#39;inflorescence primaires de les exposer aux cellules Agrobacterim. (A) Les bourgeons sont couverts par des feuilles. (B) Les feuilles ont été coupés autour des bourgeons de les exposer. (C) Image grossie de l&#39;usine (A) après la coupe pour exposer bourgeons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig2highres.jpg" /> Figure 2. Les différents stades de bourgeons qui ont été utilisés dans ce protocole afin de déterminer la meilleure scène à utiliser pour la trempette floral. (A) Le bourgeon de stade précoce est approximation<html> tement 2 mm (B) Le bourgeon de scène. moyenne est d&#39;environ 5 mm. (C) Le bourgeon de stade avancé est d&#39;environ 1 cm environ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig3highres.jpg" /> Figure 3. Le processus du lin floral-trempage. (A) Les inflorescences primaires sont plongés dans les médias d&#39;infiltration contenant les cellules d&#39;Agrobacterium. (B) agrandie de (A). (C) Les plantes croisement sont posés à plat jusqu&#39;à ce que le lendemain, et les branches de croisement sont recouvertes de plastique pour maintenir une humidité élevée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" /> . Figure 4. Le processus de suivi de fleurs et de graines collections, des plantes T0 traité (A) Un exemple de la plante entière avec la branche principale (la branche la plus haute au centre) et le côté branches (B - D). Un . exemple des fleurs de différentes branches (E) Un exemple des graines récoltées à partir de fleurs individuelles (étiqueté - k). à partir de la branche principale <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig5highres.jpg" /> Figure 5. Les plants sont cultivés T1 sans sélection antibiotique. (A) les graines T1 sontgermé sur le support MS des plantes. (B) Les transformants positifs, tel que déterminé par PCR directe, sont transplantées dans le sol et se est développée jusqu&#39;à l&#39;échéance. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig5large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig6highres.jpg" /> Figure 6. d&#39;échappement aux antibiotiques, un problème pour la sélection T1, est surmontée par criblage direct PCR. (A) les graines de lin de type sauvage germées sur les médias MS végétal sans antibiotique. (B) graines de lin de type sauvage ont germé sur des supports de plantes MS + de concentrations croissantes de kanamycine (200 ug / ml, 600 pg / ml, 1 mg / ml). (C) de graines de lin de type sauvage germées sur des supports de plantes MS avec 2 mg / ml de kanamycine. (D) PCR à partir de type sauvage lin et T1 semis en utilisant des amorces à la kanamycine, tout amplified le gène de la kanamycine (légendes: EZ1: marqueurs d&#39;ADN, FlaxS, flaxS de type sauvage, C: contrôler non trempé branche, Ma: T1 descendance de fleur &quot;a&quot; recueillies auprès de la branche principale, Sc, Sd, Se, Sf: descendances T1 de différentes fleurs &quot;c, d, e, f&quot; recueillies auprès de la branche latérale, W:. sans ADN) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig6large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig7highres.jpg" /> Figure 7. Un exemple d&#39;amplifications PCR succès de descendances T1 en utilisant la méthode PCR directe. (A) Schéma du vecteur binaire usine + cloné LIS-1 insert. Les flèches bleues indiquent la position des amorces de PCR utilisés dans le criblage par PCR directe (modifié de Takara). (B) PCR avec des amorces M13F + 3 &#39;(C) PCR avec des amorces M13R + 18a <strong&gt; (D) PCR avec des amorces bordure droite (RB) et site de clonage multiple (MCS) ** Chaque voie représente T1 à partir de fleurs individuelles collectées à partir de C: branche de commande (non trempé), M: branche principale fleur ag, S: la branche latérale fleur bc &#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig7large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Source de séquence de l&#39;amorce Forward </td><td> séquence 5&#39;-3 &#39; </td><td> Source de séquence amorce inverse </td><td> Séquence 5&#39;-3 &#39; </td><td> Recuit Temperature (° C) </td><td> Prorogation du délai (Sec) </td><td> La taille attendue (pb) </td></tr><tr><td> M13F (ADN-T) </td><td> CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG </td><td> 3 &#39;(LIS-1 insert) </td><td> GAGGATGGAA GATGAAGAAGG </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 450 </td></tr><tr><td> 18a (LIS-1 insert) </td><td> TATTTTAACCC <td> M13R (ADN-T) </td><td> ATTAGGCACC CCAGGCTTTA </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 520 </td></tr><tr><td> MCS (ADN-T) </td><td> TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG </td><td> RB (ADN-T) </td><td> TTTAAACTGA AGGCGGGAAA </td><td> 60 </td><td> 20 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> LB (ADN-T) </td><td> TTTGATGGTG GTTCCGAAAT </td><td> NOS (ADN-T) </td><td> GAATCCTGTT GCCGGTCTT </td><td> 60 </td><td> 30 </td><td> 380 </td></tr><tr><td> NPTII (ADN-T) </td><td> GCGATACCGT AAAGCACGAG </td><td> NTPII (ADN-T) </td><td> GCTCGACGTT GTCACTGAAG </td><td> 65 </td><td> 45 </td><td> 502 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Certaines des amorces utilisées pour la PCR tests directs.

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Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Ici, nous présentons un protocole de transformer le lin en utilisant Agrobacterium transformation de plante médiée par l&#39;intermédiaire floral creux. Ce protocole est simple à réaliser et peu coûteux, mais donne un taux de transformation plus élevé que les procédés actuellement disponibles pour la transformation de lin.

Floral-Dip Transformation de lin (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Pour générer transgéniques descendances avec un taux de transformation élevé

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

floral-dip-transformation-flax-linum-usitatissimum-to-generate

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

28.8K vues.  Case Western Reserve University.  Ici, nous présentons un protocole de transformer le lin en utilisant Agrobacterium transformation de plante médiée par l'intermédiaire floral creux. Ce protocole est simple à réaliser et peu coûteux, mais donne un taux de transformation plus élevé que les procédés actuellement disponibles pour la transformation de lin. 

Vidéo: Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&amp;#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-pendage de la transformation Arabidopsis thaliana Pour examiner PTSO2:: β-glucuronidase Expression du gène rapporteur

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Recherche

Biologie

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

This article describes genetic transformation of the unicellular marine alga Ostreococcus tauri by electroporation. This eukaryotic organism is an effective model platform for higher plants, possesing greatly reduced genomic and cellular complexity and being readily amenable to both cell culture and chemical biology.

Transformation génomique de la Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Préparation et injection d’embryons de moustiques Culex pour générer des mutations nulles à l’aide de CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive organs/gametes. Recent advances in CRISPR-Cas9 genome editing technology allow for high editing efficacy and timesaving knockout mutations of endogenous candidate genes at specific sites. Additionally, Agrobacterium-mediated genetic transformation of rice is also a key method for gene modification, which has been widely adopted by many public and private laboratories. In this study, we applied CRISPR-Cas9 genome editing tools and successfully generated three male sterile mutant lines by targeted genome editing of OsABCG15 in a japonica cultivar. We used a modified Agrobacterium-mediated rice transformation method that could provide excellent means of genetic emasculation for hybrid seed production in rice. Transgenic plants can be obtained within 2&#8211;3 months and homozygous transformants were screened by genotyping using PCR amplification and Sanger sequencing. Basic phenotypic characterization of the male sterile homozygous line was performed by microscopic observation of the rice male reproductive organs, pollen viability analysis by iodine potassium iodide (I2-KI) staining semi-thin cross-sectioning of developing anthers.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

This work describes the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology to knockout endogenous gene OsABCG15 followed by a modified Agrobacterium-mediated transformation protocol to produce a stable male-sterile line in rice.

Agrobacterium-Transformation génétique médiée, production transgénique et application pour l’étude du développement de la reproduction masculine dans le riz

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Application du mouvement passif de la tête pour générer des accélérations définies à la tête des rongeurs

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is a newly isolated filamentous cyanobacterium. This paper describes how new filamentous cyanobacteria can be isolated from marine rockpools. It also describes how DNA can be extracted from filaments and how the genomes can be sequenced. Although transformation is established for many single-celled species, it is less frequently reported for filamentous cyanobacteria. A simplified method for the natural transformation of P. lacuna is described here. P. lacuna is the only member of the order Oscillatoriales for which natural transformation is established. This paper also shows how natural transformation is used to express superfolder green fluorescent protein (sfGFP). An endogenous cpcB promoter induced approximately 5 times stronger expression than cpc560, A2813, or psbA2 promoters from Synechocystis sp. PCC6803. Further, a method for the cryopreservation of P. lacuna and Synechocystis sp. CPP 6803 was established, and methods for assessing motility in a liquid medium and on agar and plastic surfaces are described.

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna is a filamentous cyanobacterium that was isolated from marine rockpools. This article describes the isolation of filaments from natural sources, DNA extraction, genome sequencing, natural transformation, expression of sfGFP, cryoconservation, and motility methods.

Transformation naturelle, expression des protéines et cryoconservation de la cyanobactérie filamenteuse Phormidium lacune

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite the growing burden of tick-borne diseases, research on ticks has lagged behind insect disease vectors due to challenges in applying genetic transformation tools for functional studies to the unique biology of ticks. Genetic interventions have been gaining attention to reduce mosquito-borne diseases. However, the development of such interventions requires stable germline transformation by injecting embryos. Such an embryo injection technique is lacking for chelicerates, including ticks. Several factors, such as an external thick wax layer on tick embryos, hard chorion, and high intra-oval pressure, are some&#160;obstacles that previously prevented embryo injection protocol development in ticks. The present work has overcome these obstacles, and an embryo injection technique for the black-legged tick, Ixodes scapularis, is described here.&#160;This technique can be used to deliver components, such as CRISPR/Cas9, for stable germline transformations.

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

The present protocol describes a method for injecting tick embryos. Embryo injection is the preferred technique for genetic manipulation to generate transgenic lines.

Technique d’injection d’embryons pour l’édition de gènes chez la tique à pattes noires, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Species in the genus Plantago have several unique traits that have led to them being adapted as model plants in various fields of study. However, the lack of a genetic manipulation system prevents in-depth investigation of gene function, limiting the versatility of this genus as a model. Here, a transformation protocol is presented for Plantago lanceolata, the most commonly studied Plantago species. Using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, 3 week-old roots of aseptically grown P. lanceolata plants were infected with bacteria, incubated for 2-3 days, and then transferred to a shoot induction medium with appropriate antibiotic selection. Shoots typically emerged from the medium after 1 month, and roots developed 1-4 weeks after the shoots were transferred to the root induction medium. The plants were then acclimated to a soil environment and tested for the presence of a transgene using the &#946;-glucuronidase (GUS) reporter assay. The transformation efficiency of the current method is ~20%, with two transgenic plants emerging per 10 root tissues transformed. Establishing a transformation protocol for narrowleaf plantain will facilitate the adoption of this plant as a new model species in various areas.

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Because of its versatile application as a model species in various fields of study, there is a need for a genetic transformation toolkit in narrowleaf plantain (Plantago lanceolata). Here, using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, a protocol is presented that results in stable transgenic lines with a transformation efficiency of 20%.

Transformation génétique médiée par Agrobacterium tumefaciens du plantain à feuilles étroites

Species in the genus Plantago have several unique traits that have led to them being adapted as model plants in various fields of study. However, the lack ...

Méthode de transformation de racines poilues en une étape pour faire progresser la biologie liée aux racines

An Efficient and Reproducible Method for Producing Composite Plants by Agrobacterium rhizogenes-Based Hairy Root Transformation

Producing composite plants with transgenic roots and nontransgenic stems and buds using Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation is a powerful tool to study root-related biology. Hairy root transformation is established in a wide range of dicotyledons and in several monocotyledon species and is almost independent of the genotype. The traditional method of hypocotyl injection with A. rhizogenes to obtain composite plants is inefficient, time-consuming, laborious, and frequently causes the death of tender and tiny hypocotyl plants. A highly efficient, one-step hairy root transformation mediated by A. rhizogenes was established previously, which eliminates the need for transplanting after producing hairy roots. In this study, a partial hypocotyl and primary root were removed, the hypocotyl incision site was coated with A. rhizogenes, and&#160;then hypocotyls were planted in sterile vermiculite. After 12 days of cultivation, the hypocotyl incision expanded and new hairy roots were induced. This article provides the detailed protocol of a one-step transformation method mediated by A. rhizogenes, with its effectiveness demonstrated by producing composite plants of wild soybean, Solanum americanum, and pumpkin.

Pleins feux sur l’auteur : Rationalisation de la production de plantes composites grâce à la transformation des racines poilues médiée par Agrobacterium rhizogenes 

Here, we provide the detailed protocol of a one-step transformation method mediated by Agrobacterium tumefaciens to produce composite plants.

Procédé efficace et reproductible de production de plantes composites par transformation racinaire velue basée sur Agrobacterium rhizogenes

Producing composite plants with transgenic roots and nontransgenic stems and buds using Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation is a ...