Ce protocole montre la production de légionnaire d’automne transgénique à l’aide d’un système de transformation basé sur piggyBac. Nous espérons que ces méthodes bénéficieront à l’amélioration de la transformation, non seulement chez la chenille légionnaire d’automne, mais aussi chez les insectes lépidoptères. La méthode décrite ici rend efficace la transformation germinale des insectes nuisibles lépidoptères.
La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Xien Chen, boursier postdoctoral dans mon laboratoire. Commencez par placer 12 nymphes mâles et 12 nymphes femelles dans une boîte. Placez une solution de saccharose à 10% dans la boîte pour nourrir les adultes.
Couvrez la boîte avec une serviette en papier. Le deuxième jour après l’éclosion, exposez les adultes à une lumière intense pendant la nuit. Le troisième jour après l’éclosion, transférez les adultes dans un endroit sombre.
Prélever les embryons dans les deux heures suivant la surposition. Ajoutez des gouttes d’eau au morceau de l’essuie-tout avec des œufs frais conservés dans une boîte de Pétri sur de la glace. Transférez doucement les œufs sur une lame de verre avec une brosse fine et alignez-les un par un sur une lame en verre.
Gardez les lames de verre avec les œufs alignés sur la glace avant la microinjection. Injecter un mélange de 200 nanogrammes par microlitre de plasmide exprimant l’EGFP à base de piggyBac, de 200 nanogrammes par microlitre d’ARNm hyperactif de la transposase piggyBac et d’eau distillée stérile dans les œufs en utilisant la pression de compensation du micro-injecteur automatisé. Conservez les œufs injectés à 27 plus ou moins un degré Celsius, 60 plus ou moins 10% d’humidité relative jusqu’à l’éclosion.
Nourrissez les larves écloses avec un régime artificiel et transférez chaque larve dans une petite tasse au stade précoce du caillé et de l’étoile. Recueillez les nymphes et placez environ 150 nymphes femelles et 150 nymphes mâles dans une cage. Accrochez plusieurs morceaux d’essuie-tout de 30 centimètres sur 15 centimètres dans la cage pour ramasser les œufs.
Ramassez les serviettes en papier avec les œufs tous les jours et conservez les œufs dans des conditions appropriées jusqu’à l’éclosion. Gardez les larves de nouveau-nés à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour les immobiliser, puis transférez-les sur une plaque glacée. Dépister les larves de nouveau-nés immobilisés au stéréomicroscope à fluorescence.
Sélectionnez les nouveau-nés EGFP positifs, élevez-les au stade nymphal, en environ deux semaines à 27 plus ou moins un degré Celsius. L’ARNm hyperactif de la transposase piggyBac synthétisé in vitro a été détecté à l’aide d’un gel d’agarose à 1 %. Les embryons injectés par PDS ne montraient pas de signal EGFP, tandis que les embryons injectés de plasmide exprimant l’EGFP et d’ARNm hyperactif de transposase piggyBac présentaient une fluorescence EGP, indiquant que la construction de piggyBac était réussie.
Les larves de G1 obtenues à partir d’œufs résultant d’un auto-croisement d’adultes G0 ont montré un fort signal EGFP. Un fragment contenant le promoteur et le fragment EGFP a été amplifié avec succès en utilisant l’ADN génomique isolé des larves EGFP positives comme modèle. Cependant, le même fragment n’a pas été détecté lorsque l’ADN génomique a été isolé des larves de type sauvage comme modèle.
Les œufs pour la microinjection doivent être aussi frais que possible et doivent toujours être conservés sur de la glace avant la microinjection pour ralentir leur développement. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour répondre à des questions en génomique fonctionnelle des insectes nuisibles et développer des méthodes de contrôle génétique pour ce ravageur mondial.
