Merci sont dus à Génia Brodsky pour la figure graphiques; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, et Leonid Roitman pour des conseils et une assistance technique avec le uncaging deux photons; Maayan Tahor et Suliman Elsadin d&#39;assistance technique; Uwe Strähle d&#39;avoir bien voulu fournir la ligne de journaliste et de neurogenin1 Amos Gutnick pour les commentaires sur ce manuscrit. La recherche dans le laboratoire Levkowitz est soutenu par la Fondation allemande-israélien (le numéro de subvention 183/2007); Israel Science Foundation (numéro de subvention 928/08) et le Harriet &amp; Marcel Dekker Fondation. GL est un titulaire de la Chaire Développement Tauro carrière en recherche biomédicale.

Nous décrivons un protocole de marquage cellulaire à l&#39;aide de fluorescéine en cage, cependant, d&#39;autres photo-activable colorants et les protéines peuvent être également utilisés. 1. L&#39;injection de fluorescéine Caged <ol><li> Préparer une solution stock de 5% (5mg cage-fluorescéine / KCl 100 uL 0,2 M) de dextrane conjuguées 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyle (DMNB) en cage fluorescéine (10.000 MW dextrane, des polymères anioniques, Invitrogen, sondes moléculaires, Carlsbad, CA , cat. aucune. D-3310). Aliquoter et stocker dans -20 ° C. Notez que DMNB-cage fluorescéine est sensible à la lumière et doit être conservé dans l&#39;obscurité. </li><li> Préparer une cuvette d&#39;injection faite de 1% d&#39;agarose (Sigma, St. Louis, MO, cat. Aucune. A9539) comme décrit dans «Le livre de poisson zèbre» 1. </li><li> Préparer deux litres de milieu de l&#39;E3 en diluant une solution stock de 100 x E3. </li><li> Le soir avant l&#39;injection, préparer des cages d&#39;accouplement qui sépare le mâle (s) de la femelle (s) de la ligne souhaitée transgéniques exprimant un point de repère visible fluorescente (GFP, RFP etc) utilisé pour localiser les cellules cibles pour la photoactivation. </li><li> Préparer aiguilles d&#39;injection capillaire (mince paroi de verre capillaires avec filament, Instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride, cat. Aucune. TW100F-6) en utilisant un extracteur micropipette (Instrument Sutter, Novato, CA, P-97). </li><li> Dégeler une aliquote de 5% en cage fluorescéine sur la glace. </li><li> Diluer le solution à 5% en cage stock de fluorescéine dans KCl 0,2 M à une concentration finale de 1%, et de garder sur la glace. Éviter l&#39;exposition lumineuse. </li><li> L&#39;accouplement de configuration traverse préparé à l&#39;étape 4. </li><li> Ramassez les œufs fécondés dès qu&#39;ils sont pondus. Embryons d&#39;Orient stade unicellulaire dans le moule d&#39;injection d&#39;agarose recouvertes de E3 1. </li><li> En utilisant une pointe microloader (Eppendorf, Hambourg, Allemagne, cat. Aucune. 956,003 5242) remblayer une aiguille d&#39;injection avec ~ 1 pl de 1% en cage solution de fluorescéine. </li><li> Placez chargés aiguille dans un micromanipulateur attaché à une essence microinjecteur (pneumatique picopump, World Precision Instruments, Sarasota, Floride, PV820). </li><li> Réglez le volume d&#39;injection 2-3NL et injecter le cage-fluorescéine directement dans le cytoplasme de la cellule. Injecter un minimum de 50 embryons par expérience. </li><li> Incuber embryons dans l&#39;obscurité à 28,5 ° C à l&#39;E3 à l&#39;étape désirée du développement. Si les embryons âgés de plus de 24 heures après fécondation sont analysés, ajouter phénylthiourée 0,1% (PTU, Sigma, St. Louis, MO, cat. Aucune. 22290-9) pour inhiber la pigmentation. </li></ol> 2. Embryon de montage <ol><li> Préparer une nouvelle solution E2 (voir partie des solutions; peuvent être conservés à 4 ° C pendant une semaine). </li><li> Manteau de 60 mm boîte de Pétri avec une couche mince de 1% d&#39;agarose dissous dans le milieu de l&#39;E2. </li><li> Préparer 2% point de basse température de fusion d&#39;agarose (ultra pur agarose LMP, Invitrogen, Carlsbad, CA, n ° 16520100..) Pour l&#39;intégration: dissoudre l&#39;agarose dans l&#39;eau distillée stérile doubler d&#39;ici à chauffage micro-ondes jusqu&#39;à ébullition. Laisser le bouchon du tube ouvert pendant le chauffage. Aliquote de 1 mL dans des microtubes et conserver dans un bloc chauffant à 72 ° C. </li><li> Retirez le chorions des embryons en tirant doucement sur le chorion dehors avec une pince forte (n ° 5). Gardez embryons dans une solution de E2 sur un plat d&#39;agar-couché (voir étape 2). Embryons Dechorionated doivent être manipulés avec polie au feu pipette Pasteur en verre, car ils peuvent coller à Pipettes en polypropylène. Évitez d&#39;exposer l&#39;embryon dechorionized à l&#39;air que ces embryons pourraient être endommagés par la tension de surface liquide. </li><li> Recueillir l&#39;embryon sélectionné dans un petit volume de E2 en utilisant une polie au feu pipette Pasteur en verre, et placer l&#39;embryon sur 60 mm boîte de Petri. Monter une goutte (~ 150 pi) de 2% d&#39;agarose (étape 3) à côté de l&#39;embryon. Mélanger rapidement les deux gouttes d&#39;obtenir un mélange homogène finale ~ 1% d&#39;agarose et en utilisant un microscope à dissection d&#39;orienter l&#39;embryon avec sa face dorsale face à l&#39;objectif. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est solidifié et ajouter moyenne E2 jusqu&#39;à l&#39;embryon incorporé est immergée dans un liquide. Il est préférable d&#39;obtenir un seul embryon par plat comme il peut être libéré de l&#39;agarose après le processus de photoactivation. </li></ol> 3. Photoactivation <ol><li> Nous utilisons un Zeiss LSM 510 META RNL deux photons microscope équipé d&#39;une large bande accordable (700-1020nm) Mai Tai-HP-laser femtoseconde à partir Spectraphysics. </li><li> Placez l&#39;embryon monté sur un support de plaque sous le microscope. Le point de repère fluorescente dans l&#39;embryon est visualisée à l&#39;aide d&#39;eau immergée 40x/0.8W Achroplan objectif. Pour les étapes suivantes, nous utilisons non descanned détecteur (DDN) avec filtre passe-bande (BP) de 500-550nm. </li><li> Comme condition préalable au processus de photoactivation, obtenir des informations spatiales fluorescent de la région d&#39;intérêt par l&#39;acquisition de séries d&#39;images de la plus ventrale à la partie dorsale du signal détecté fluorescent avec deux photons de longueur d&#39;onde laser de 860nm (pour la détection de la GFP). À cette fin, une résolution suffisante peut être obtenue en utilisant une période de 6 microns entre chaque plan focal acquises. </li><li> Sélectionnez la ciblez-avion pour photoactivation et amener cette région dans le foyer. Selon le but de l&#39;expérimentation, la région d&#39;intérêt peut être soit au sein ou en dehors de la GFP repère visible. Prenez une image unique dans ce plan z. Enregistrer l&#39;image et la garder ouverte dans une fenêtre séparée. </li><li> Régler la longueur d&#39;onde laser à deux photons à 720nm et lorsque le laser est en mode bloqué ouvrir le menu &quot;Modifier l&#39;eau de Javel». Définissez la région d&#39;intérêt (ROI) pour photoactivation en fonction de l&#39;image prise à 860nm (étape 4) en utilisant le menu &quot;Définir la région». Il est crucial de choisir le retour sur investissement de cette image après décalage de la longueur d&#39;onde laser à 720nm comme la dernière action change la positions X, Y du champ observé. </li><li> Ajustez les paramètres suivants pour la photoactivation dans le menu «Modifier l&#39;eau de Javel» (voir étape 9): un pouvoir) laser par rapport; b) le nombre d&#39;itérations; c) la vitesse de balayage. </li><li> &quot;Bleach&quot; de presse dans la fenêtre &quot;Modifier l&#39;eau de Javel» et attendre l&#39;arrêt du laser. </li><li> Revenez à 860nm, acquérir une image plane unique pour évaluer l&#39;intensité de la matière résultant photoactivé et une deuxième série d&#39;acquisition d&#39;image pour évaluer le Z-span (épaisseur) du domaine activé. </li><li> Considérez les paramètres suivants pour la photoactivation: <ol class="lalpha"><li> On doit déterminer empiriquement les conditions optimales pour la photoactivation en faisant varier deux paramètres: l&#39;intensité du laser et la durée de photoactivation. La puissance du laser relative peut être contrôlée par le modulateur acousto-optique (AOM) de transmission. La durée de la photoactivation est une fonction du nombre d&#39;itérations et de la vitesse de balayage. </li><li> Déterminer la gamme linéaire de l&#39;intensité de fluorescence afin d&#39;éviter la saturation de la fluorescence Uncaged. </li><li> Il existe une corrélation linéaire entre l&#39;intensité obtenue par fluorescence des molécules Uncaged et la durée de l&#39;axe z du clone photoactivé 2. </li></ol></li></ol> 4. Détection de la fluorescéine Uncaged <ol><li> Après photoactivation, élever les embryons dans l&#39;obscurité à 28,5 ° C dans un milieu contenant 0,1% E2 PTU pour prévenir l&#39;apparition de la pigmentation de la peau. </li><li> Au stade de développement désiré, retirer l&#39;embryon de l&#39;agarose sous un microscope à dissection. Utiliser un objet pointu scalpel, de créer un &quot;V&quot; incision en forme de l&#39;agarose à proximité de l&#39;embryon afin que le &quot;V&quot; est dirigé vers la tête de l&#39;embryon. Placez une pince fermée au point de le &quot;V&quot; près de la tête de l&#39;embryon et poussez doucement la pince ouverte séparant l&#39;agarose sur toute la longueur de l&#39;embryon et de libérer l&#39;embryon dans le milieu. </li><li> Recueillir les embryons avec une pipette Pasteur polie au feu et de fixer avec du paraformaldéhyde (PFA; 4% en 1 x PBS, pH 7,2) soit pour 3 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Retirer la solution de fixation et rincer 2-3 fois en PBST pendant au moins 5 minutes à température ambiante. </li><li> Lavez embryons avec du méthanol à 100% pendant 10 min, de reconstituer avec du méthanol frais et incuber à -20 ° C pendant au moins 2 heures. </li><li> Réhydrater embryons par des incubations successives (5 mn chacune) dans une série de méthanol dilué dans PBSTr: 80%, 60%, 40% et 20%. Lavez 2 x 10 minutes dans PBSTr. </li><li> Incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans 500 uL de solution de blocage. </li><li> Ajouter une phosphatase anti-fluorescéine-alcaline (AP) des fragments Fab (Roche, Palo Alto, Californie, cat. Aucune. 11426338910), dilué à 1:500 dans une solution de blocage et incuber une nuit à 4 ° C (microtubes place sur les côtés) . </li><li> Laver 5 x 15 minutes dans du PBST. </li><li> Laver pendant 5 minutes dans 0,2 M de NaCl dans la TNT. </li><li> Laver pendant 5 minutes dans 0,4 M de NaCl dans la TNT. </li><li> Equilibrer 3 x 5 minutes dans une solution Prestain fraîchement préparés. </li><li> Dissoudre un comprimé de Fast Red (Roche, Palo Alto, Californie, cat. Aucune. 11496549001) dans 2 ml Prestain solution. Il est recommandé de filtrer la solution en utilisant du papier Whatman n ° 2 à omettre non dissous particules. Alternativement, ralentit solution et utiliser le liquide clair surnageant. </li><li> Ajouter 500 ul solution Fast Red à chaque tube, incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante, et le développement moniteur couleur désirée jusqu&#39;à ce que le signal sur bruit est atteint (20 minutes à plusieurs heures). Si de fond se développe, le transfert à 4 ° C. Après une heure d&#39;incubation, de reconstituer avec une solution nouvelle coloration Fast Red. </li><li> Arrêter la réaction de coloration par 3 x 5 minutes lavages en PBST. </li><li> Fix pendant 20 minutes dans 4% PFA à température ambiante. </li><li> Lavez 2 x 5 minutes dans du PBST. </li><li> Embryons clair à travers une série de 25%, 50% et 75% de glycérol dans du PBS jusqu&#39;au embryons sont déposés au fond du tube. Les embryons peuvent être conservés à 4 ° C pendant quelques jours. </li></ol> 5. Visualisation fluorescent de l&#39;Espace Uncaged <ol><li> Préparer une lame de microscope pour le montage: en utilisant une seringue de 1 mL appliquer quatre taches de graisse silicone transparent sur la diapositive, placé à une distance de ~ 15mm de l&#39;autre. Mont de l&#39;embryon au Center dans ~ 200 ul de glycérol 75% et placer une lamelle (n ° 0; 18x18mm) sur le dessus et doucement pousser contre le silicone jusqu&#39;à ce que la solution de glycérol occupe la surface entre les diapositives. </li><li> Placez l&#39;embryon monté sur la scène et de le mettre en mise au point avec un objectif 40x. Acquérir une confocale Z-série d&#39;images en utilisant 488nm Argon et 543nm lasers HeNe comme source d&#39;excitation. </li><li> La durée de l&#39;axe z du domaine photoactivatated peuvent être analysés en utilisant la reconstruction 3D de l&#39;embryon Uncaged aide d&#39;un logiciel d&#39;analyse d&#39;image. </li></ol> 6. Solutions <table border="1"><tbody><tr><td> 100 x E3 </td><td> 174mm de NaCl, KCl 21mm, 12mm MgSO 4, 18mm Ca (NO3), 15mm HEPES, pH = 7,4. Stériliser par filtration et stocker à 4 ° C </td></tr><tr><td> 20 x E2 </td><td> 0,3 M de NaCl, 10 mM KCl, 20 mM CaCl 2 * 2HOH, 20mm MgSO 4 * 7HOH, 3mm KH 2 PO 4, 0,8 Na 2 HPO 4 * 2HOH, filtrat et stocker à la température ambiante </td></tr><tr><td> 1 x E2 </td><td> Diluer 20 x E2 dans l&#39;eau bidistillée et ajouter fraîchement NaHCO 3 (à la concentration finale de 0,7 mm), pénicilline et streptomycine (solution diluée streptocoque stylo pour une concentration finale de 1 x qui contient 100U de pénicilline et la streptomycine 100mg par ml (Invitrogen , Carlsbad, CA, cat. aucune. 15140-122)) </td></tr><tr><td> PBST </td><td> 0,1% de Tween-20 dans du PBS </td></tr><tr><td> PBSTr </td><td> Triton de 0,3% en PBS </td></tr><tr><td> Solution de blocage </td><td> 10% de BSA, Triton 0,3%, 1% de DMSO dans du PBS </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 100 mM Tris-HCl pH-7.5, 150 mM NaCl, 0,5% Tween-20 dans de l&#39;eau bidistillée </td></tr><tr><td> Solution Prestain </td><td> 100 mM Tris-HCl pH-8.2, 0,4 M de NaCl, 0,1% Tween-20 dans de l&#39;eau bidistillée </td></tr></tbody></table> 7. Les résultats représentatifs Un exemple de l&#39;utilisation de la microscopie à deux photons pour photoactiver agents dans un embryon de poisson zèbre vivant est présenté. En utilisant une approche similaire que nous avons déjà tracé la lignée de la photoactivé étiquetés progéniteurs neuronaux dans le cerveau de poisson zèbre 2,3. La figure 1 montre photoactivation d&#39;un colorant fluorescéine cage conjugués dans la plaque neurale antérieure de l&#39;embryon de poisson zèbre portant un neurog1:: gfp journaliste transgène, qui a servi de point de repère direct intrinsèque. Les embryons ont été injectés avec de la fluorescéine en cage au stade une cellule et embarqué dans l&#39;agarose au stade du bouton. A 3 - 5-somite scène les coordonnées spatiales ont été mesurés dans le neurog1:: gfp transgéniques embryon afin de déterminer la région d&#39;intérêt (ROI) pour uncaging (figure 1A, A &#39;). Nous Uncaged le traceur lignée fluorescéine dans un domaine spécifique de la plaque neurale (figure 1B, B &#39;). Par la suite, le sort de ce sous-domaine donné progénitrices neurales étiqueté a été déterminée à prim5 (24 heures après fécondation) étape par immunomarquage de l&#39;Uncaged fluorescéine (figure 1C, C &#39;). L&#39;étendue de deux photons laser uncaging, c&#39;est à dire l&#39;intensité de la fluorescence Uncaged et l&#39;épaisseur du domaine photoactivé (z-span), peut être contrôlée en ajustant deux paramètres: l&#39;intensité du laser et la durée. Ce dernier peut être contrôlé par un ajustement du nombre d&#39;itération et la vitesse de balayage (voir partie 3, étape 9; Russek-Blum, 2009). Dans l&#39;exemple montré dans la figure 1, nous avons utilisé la puissance du laser relative de transmission OMA 12%, 20 itérations et vitesse de balayage de 25,6 msec / pixel. En utilisant ces paramètres, nous étiquetés contenant un ROI de 90 à 10 cellules et un photoactivé z de vie de 30 um (~ 1-2 rangées de cellules). <img src="/files/ftp_upload/1902/1902fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Un résultat Représentant de photoactivation de fluorescéine en cage dans embryons de poissons zèbres en direct en utilisant microscopie à deux photons. Illustration schématique (AC) et des images représentatives (A&#39;-C &#39;) du processus de photoactivation. En direct d&#39;embryons de poisson zèbre (A, A &#39;) exprimer la GFP sous le contrôle de Neurogenin-1 promoteur (neurog1:: GFP) qui a été injecté avec cage fluorescéine traceur au stade 1 cellule. Au 3-5 - stade de somites, une zone discrète de l&#39;ébauche du prosencéphale (diencéphale) a été photoactivé et le Uncaged fluorescéine colorant traceur a pu être détecté (B, B &#39;). Suite à la procédure de photoactivation, l&#39;embryon a été incubé à 28,5 ° C et les cellules du cerveau contenant la fluorescéine ont été tracées par Uncaged anti-fluorescéine immunomarquage moins 24 heures après fécondation (HPF, C, C &#39;). Dien, diencéphale;. Tel, télencéphale..

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+(Brachydanio+rerio.">The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio.</a> , (1995).</li><li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon.">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li><li>Russek-Blum, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neuronal+cluster+size+is+determined+during+early+forebrain+patterning.">Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning.</a> Development. 135, 3401-3413 (2008).</li><li>Kozlowski, D. 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Photo-activable composés sont des molécules dont la fonction est masqué jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient éclairés par une longueur d&#39;onde spécifique (généralement UV), induisant une réaction photochimique qui convertit les molécules dans un état biologiquement ou chimiquement active. Ces sondes fournissent des outils très puissants dans la recherche en biologie cellulaire, puisque l&#39;activation peut être contrôlée avec précision temporellement et spatialement en limitant leur exposition à la lum...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D-3310</td>
<td>molecular probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose for injection trough and coated plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9539</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microloader tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pneumatic picopump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>PV820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>22290-9</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Low melting point agarose for embryo mounting</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra Pure LMP agarose</td>
<td>16520100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11426338910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fast Red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11496549001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
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two-photon-based photoactivation in live zebrafish embryos

Photoactivation de composés cibles dans un organisme vivant a prouvé une approche intéressante pour étudier divers processus biologiques tels que le développement embryonnaire, la signalisation cellulaire et la physiologie adulte. À cet égard, l&#39;utilisation de multi-microscopie biphotonique permet photoactivation quantitative d&#39;un agent donné réactive la lumière dans les tissus profonds, à une résolution seule cellule. Comme embryons de poissons zèbres sont optiquement transparents, leur développement peut être contrôlé in vivo. Ces traits font le poisson zèbre, un organisme modèle parfait pour contrôler l&#39;activité d&#39;une variété d&#39;agents chimiques et des protéines par la lumière concentrée. Nous décrivons ici l&#39;utilisation de la microscopie à deux photons pour induire l&#39;activation de la cage chimiquement la fluorescéine, qui à son tour nous permet de suivre le destin des cellules dans des embryons de poisson zèbre en direct. Nous utilisons des embryons exprimant un point de repère direct génétique (GFP) pour localiser et cibler précisément les cellules d&#39;intérêt. Cette procédure peut être également utilisé pour l&#39;activation induite précise la lumière des protéines, des hormones, des petites molécules et autres composés en cage.

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Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Microscopie multiphotonique permet de contrôler les photons de basse énergie avec une pénétration profonde et optiques phototoxicité réduite. Nous décrivons l&#39;utilisation de cette technologie pour l&#39;étiquetage de cellules vivantes dans des embryons de poissons zèbres. Ce protocole peut être facilement adapté à la photo-induction de diverses molécules lumière réactive.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

two-photon-based-photoactivation-in-live-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K vues.  Weizmann Institute of Science. Microscopie multiphotonique permet de contrôler les photons de basse énergie avec une pénétration profonde et optiques phototoxicité réduite. Nous décrivons l'utilisation de cette technologie pour l'étiquetage de cellules vivantes dans des embryons de poissons zèbres. Ce protocole peut être facilement adapté à la photo-induction de diverses molécules lumière réactive.

Vidéo: Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection d&#39;ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Recherche

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection d&#39;embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

La transplantation de blastomères exprimant la GFP pour l&#39;imagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glycanes imagerie dans embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et Chimie Cliquez Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analyse du profil métabolique des embryons de poisson zèbre

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...