Nous remercions J. Chen pour fournir le protocole de synthèse en cage fluorescéine-dextran. Cette recherche a été soutenue par le Mars de la sentence Dimes 5-FY09-78, l&#39;American Heart Association Award 09BGIA2090075, et le prix du NIH / NHLBI R01-01 à HL107369 SS Un merci spécial à C. Closson pour son aide microscopie.

1. Synthèse de la cage de fluorescéine-dextran (adapté de réf. 14) <ol><li> Préparer une solution 0,1 M de borate de sodium dilué dans ddH 2 O. </li><li> Mesure 4 mg de 10 kDa aminodextrane et l&#39;ajouter au tube CMNB-cage fluorescéine. </li><li> Ajouter 500 ul de la solution de borate de sodium préparée (étape 1.1) pour le tube CMNB-cage fluorescéine. Boucher le tube et le vortex pendant 30 secondes pour dissoudre le mélange. </li><li> Laisser le mélange réagir toute la nuit sur un nutator à température ambiante. Couvrez le tube avec une feuille de métal pour empêcher l&#39;exposition du mélange à la lumière ambiante. </li><li> Obtenir une colonne Zeba tour dessaler et enlevez le bouchon du bas. Marquer un point sur la colonne, qui sera utilisé pour orienter la colonne lors de la centrifugation. Placer la colonne dans un tube 15 ml coniques Falcon. Remarque: La solution dans la colonne de spin est tampon de colonne. </li><li> Desserrez le capuchon sur la colonne de centrifugation dessaler. Placer 15 ml de la forme conique du tube Falcon qui abrite la colonne de centrifugation dessaler dans une centrifugeuse. Orienter la colonne de spin avec le point marqué (étape 1.4) face au centre de l&#39;rotor de la centrifugeuse. Centrifuger le tube à 1000 xg pendant 2 minutes à température ambiante. </li><li> Après centrifugation, enlever la colonne de centrifugation dessaler du tube Falcon. Jeter la fois le débit recueillies dans le cadre et le tube 15 ml conique. Obtenir un nouveau 15 ml conique tube Falcon, et placer la colonne de centrifugation dessaler dans le nouveau tube Falcon. Remarque: Après centrifugation, le lit de résine colonne devrait apparaître compacté. Utilisez la colonne immédiatement. </li><li> Obtenir le mélange ayant réagi (en cage fluorescéine-dextran) dans l&#39;étape 1.3. Enlever le capuchon de la colonne de centrifugation et aspirer le mélange a réagi et l&#39;appliquer lentement vers le centre de la colonne de centrifugation dessaler. Après avoir appliqué le mélange ayant réagi, replacez le bouchon sur la colonne. </li><li> Placer le tube Falcon qui abrite la colonne de centrifugation dessaler dans une centrifugeuse. Comme fait à l&#39;étape 1.5, d&#39;orienter la colonne de spin avec le point marqué face au centre de l&#39;rotor de la centrifugeuse. Centrifuger le tube à 1000 xg pendant 2 minutes à température ambiante. </li><li> Après centrifugation, un mélange jaune (fluorescéine-dextran en cage) seront collectées (environ 400 pi) dans le tube de 15 ml Falcon. Transférer la cage fluorescéine-dextran mélange dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Recouvrir immédiatement le tube avec une feuille de métal pour empêcher l&#39;exposition du mélange à la lumière ambiante. Lyophiliser l&#39;cage fluorescéine-dextran mélange dans un speedvac. La lyophilisation de 350 uL devrait prendre environ 4 heures. </li><li> Après lyophilisation complète, resuspendre la poudre (environ 3 mg) dans le trou DDH 2 O à une concentration finale d&#39;environ 1% p / v. Mélanger par vortex de suspendre brièvement la poudre. </li><li> Aliquoter la cage fluorescéine-dextran dans les tubes séparés feuille métallique couvert, et de les stocker à -20 ° C. </li></ol> 2. La récolte des embryons et la microinjection de cage fluorescéine-dextran * Cette procédure utilise le poisson zèbre comme modèle animal. <ol><li> Le jour avant les injections, mis en place des croix zebrafish soit 1h01 mâle-femelle ou mâle 02h01-femmes dans l&#39;élevage des réservoirs avec des intercalaires. </li><li> Le lendemain matin de changer l&#39;eau du réservoir d&#39;élevage et de supprimer les diviseurs. Immédiatement préparer un 5 uL dixième solution diluée de travail de cage fluorescéine-dextran soit dans une des médias X Danieau (voir Préparation des solutions) ou ddH 2 O. Couvrir le tube solution de travail avec une feuille de métal pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Pipeter l&#39;préparées en cage fluorescéine-dextran solution (étape 2.2) dans l&#39;aiguille. Avant de couper le bout de l&#39;aiguille à une taille appropriée sous le microscope de dissection, placez un morceau de filtre transparent jaune en face de la source de lumière blanche. Le filtre jaune préviendra uncaging spontanée de la fluorescéine-dextran lors des injections. Lorsque regardant à travers l&#39;oculaire oculaire, la source de lumière devrait apparaître jaune. </li><li> Recueillir les embryons et les pipettes dans un bac de moisissures microinjection. Réglez le temps de livrer la microinjection de 3 à 4 nL de cage fluorescéine-dextran. Sous le microscope de dissection, d&#39;orienter les embryons avec une pince et d&#39;injecter (3 à 4 NL) en cage fluorescéine-dextran dans la base des cellules blastomères (blastomère-jaune de l&#39;interface). Le stade de l&#39;embryon pour l&#39;injection doit être de 1 - à 2 cellules-scène. </li><li> Après l&#39;injection, éliminer les embryons du bac moule microinjection et les placer dans un plat propre de Pétri contenant les poissons d&#39;eau douce. Le bleu de méthylène peut être ajouté à l&#39;eau du poisson pour prévenir la croissance fongique à une concentration finale de 0,02% p / v. Couvrir le plat de Pétri avec une feuille de métal pour empêcher uncaging de l&#39;injection de fluorescéine-dextran en cage. </li><li> Levez les embryons injectés à un stade où les cellules d&#39;intérêt doivent être photoactivé. Pour photoactivation, préparer un faible point de fusion de 0,6% dans la solution d&#39;agarose ddH 2 O. Selon le stade d&#39;embryon, tricaïne (MS222) peut être ajouté à la basse température de fusion d&#39;agarose. Pour ce faire, diluer 0,02% de tricaïne basse température de fusion d&#39;agarose à une concentration finale de 0,0014%. </li><li> Dès que les embryons atteignent le stade de développement approprié, dechorionate les embryons dans une des médias X Danieau avec une pince. Lorsque dechorionating, assurez-vous qu&#39;un filtre jaune transparent est placé dans le chemin de la source de lumière blanche (voir étape 2.3). </li><li> Faites chauffer l&#39;0,6% point de fusion bas solution d&#39;agarose à 37 ° C. Pipeter 1 mL de fusion bas agarose dans le puits d&#39;une lame de LabTek lamelle chambrée. Soigneusement monter de 3 à 4 embryons en basse température de fusion d&#39;agarose et de les orienter avec une pince avec les cellules d&#39;être confrontés à la baisse photoactivé contre la lamelle inférieure. </li><li> Laisser l&#39;agarose se solidifier. Après solidification, une pipette de 1 mL de 1 média X Danieau sur l&#39;agarose. </li><li> Répétez les étapes 2.8 à 2.9 pour plus d&#39;embryons. </li></ol> 3. Deux photons d&#39;activation de cage fluorescéine-dextran * Cette procédure suppose que l&#39;embryon exprime la GFP journaliste. L&#39;embryon est visualisé en utilisant l&#39;ion d&#39;argon (488 nm) source laser attachés à la loupe LSM 510 META ONL. Une cellule GFP positif unique est sélectionné et photoactivé utilisant le Mai Tai au laser (laser femtoseconde) couplé à la LSM 510. La procédure est la même pour les non-fluorescente embryons. Alternativement, la lumière blanche peut être utilisée pour trouver la cellule pour être activé, suivie de l&#39;activation à l&#39;aide de la source laser Mai Tai. <ol><li> Chargez le logiciel LSM 510. Placer un filtre jaune transparent dans le faisceau de lumière blanche. </li><li> Sélectionnez Numériser nouvelle image et cliquez sur Démarrer Mode Expert. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet laser. Allumez l&#39;ion d&#39;argon (488 nm) et de Mai Tai (femtoseconde) des sources laser. </li><li> Réglez le Mai Tai longueur d&#39;onde de 740 nm. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet de configuration. Définir la configuration du chemin optique de l&#39;ion argon et de Mai Tai laser. </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet Numérisation. Changer l&#39;objectif de 20X/0.8. </li><li> Réglez la vitesse de balayage max en cliquant Max. </li><li> Set Mode, Mode, et le numéro de ligne, moyenne, et 1. </li><li> Sous l&#39;onglet Canaux désélectionner toutes les sources laser, à l&#39;exception du Mai Tai. </li><li> Placez un mètre de puissance dans le faisceau optique. </li><li> Sélectionnez le bouton pour activer Cont balayage continu. </li><li> Réglez le% de transmission jusqu&#39;à ce que le wattmètre indique une puissance laser moyenne de 47 mW. </li><li> Arrêter le scan en sélectionnant le bouton Stop. </li><li> Sous l&#39;onglet Canaux désélectionner le Mai Tai source laser et sélectionner les ions argon (488 nm). </li><li> Sélectionnez le bouton XY rapide. Sous l&#39;onglet Canaux ajuster le sténopé, gain du détecteur, un amplificateur de compensation, et de gain de l&#39;amplificateur pour le laser à ions argon pour atteindre la meilleure qualité d&#39;image. </li><li> Utilisation du contrôleur stade, trouver et se concentrer sur la cellule pour l&#39;activer. </li><li> Cliquez sur le bouton Stop. </li><li> Utilisation de l&#39;outil de zoom, zoom sur la cellule activée jusqu&#39;à ce que le facteur de zoom dans l&#39;onglet Mode affiche 50 à 70. </li><li> Arrêter le scan en sélectionnant le bouton Stop. </li><li> Sous l&#39;onglet Canaux désélectionner l&#39;laser à ions argon (488 nm) et sélectionnez le Mai Tai laser. </li><li> Sous l&#39;onglet Mode de régler la vitesse de balayage à 31,46 sec. </li><li> Sélectionnez le bouton Simple pour lancer le scan des deux photons d&#39;activation de cage fluorescéine-dextran de la cellule sélectionnée. </li><li> Après activation, décochez la case Mai Tai laser sous l&#39;onglet Canaux, et resélectionner le laser à ions argon (488 nm). </li><li> Régler le facteur de zoom dans le mode à 1, puis cliquez sur le bouton Max sous la rubrique de vitesse pour régler la vitesse la plus rapide de balayage. </li><li> Sélectionnez xy rapide pour examiner la région photoactivé. Vérifiez que la région n&#39;est pas photoactivé laser ablation. Pour plus d&#39;informations sur l&#39;ablation laser, s&#39;il vous plaît se référer à la section de discussion. </li><li> Répétez les étapes ci-dessus pour d&#39;autres embryons. </li></ol> 4. Immunodétection de Uncaged fluorescéine-dextran (adapté de réf. 16) <ol><li> Après photoativation, placer un filtre transparent jaune en face de la source de lumière blanche et supprimer manuellement chaque embryon de basse température de fusion d&#39;agarose en utilisant une pince forte. Placez tous les embryons supprimés dans un nouveau plat de Pétri contenant fraîche 1 X Danieau médias. Couvrir le plat de Pétri avec une feuille de métal pour éviter l&#39;exposition des embryons à la lumière. </li><li> Si nécessaire, l&#39;arrière des embryons jusqu&#39;au stade désiré de développement. En attendant, préparer une solution de paraformaldéhyde à 4% (voir Préparation des solutions). Aliquoter 1,5 ml de paraformaldéhyde préparé dans un tube à centrifuger. </li><li> Après les embryons ont atteint le stade de développement d&#39;intérêt, une pipette les embryons dans le tube à centrifuger (de l&#39;étape 4.2). Couvrez le tube avec une feuille de métal pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Nutate le tube nuit à 4 ° C. Pour préparer le lendemain classés éthanol (EtOH) des solutions dans un tampon phosphate salin (PBS) et ddH 2 O, 30% EtOH: PBS, 50% EtOH: PBS, 70% EtOH: DDH 2 O, et 100% EtOH. </li><li> Le lendemain, retirez les embryons à partir de 4 ° C. Retirez la feuille de métal recouvrant le tube d&#39;aspiration et rapidement hors paraformaldehye (laisser un petit volume qui est suffisant pour couvrir les embryons). Pipeter 1,5 ml de 30% EtOH: PBS dans le tube. Re-couvrir le tube avec une feuille métallique. Nutate le tube à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.5 utilisant 50, 70 et 100% nivelées solutions EtOH. Après le lavage 100% EtOH, rincez à nouveau les embryons dans EtOH 100% pendant 10 minutes. </li><li> Après les lavages, de stocker les embryons nuit à -20 ° C. Pour le lendemain de préparer un tampon phosphate Tween (PBT, voir Préparation des solutions), 5 tampons X blocage (voir le protocole du fabricant pour la préparation), l&#39;acide maléique (protocole de préparation peut être trouvé dans le protocole de tampon de blocage), 10 mg / ml de protéinase K, et une solution d&#39;anticorps 10 X (anti-fluorescéine-AP, voir Préparation des solutions). </li><li> Préparez aussi 2% de sérum d&#39;agneau (LS, voir Préparation des solutions) dilué dans PBT. Magasin de l&#39;anticorps à 4 ° C pendant la nuit secouer sur un nutator. Le LS 2% peuvent être conservés à 4 ° C. </li><li> Le lendemain enlever les embryons de -20 ° C. Retirez la feuille de métal recouvrant le tube d&#39;aspiration et rapidement hors EtOH 100%. Ajouter 1,5 ml de EtOH à 70%: DDH 2 O pour le tube. Re-couvrir le tube avec une feuille métallique. Nutate le tube à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.8 utilisant 50 et 30% classés solutions EtOH, et 100% de PBT. Après le lavage 100% PBT, rincez les embryons fois 3 plus de 100% PBT pendant 10 minutes. </li><li> Si les embryons sont plus vieux que 24 heures, la protéinase K de les traiter. Si non, passez à l&#39;étape 4.13. Pour ce faire, diluer le prêt protéinase K (étape 4.7) 1:1000 dans PBT. Incuber les embryons dans la protéinase K pendant 10 minutes, ou plus si les embryons sont plus âgés. Gardez les embryons recouverts d&#39;une feuille de métal pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Après la protéinase K traitement, se laver les embryons 5 fois en PBT pour 10 min. Après le lavage, fixer les embryons dans du paraformaldéhyde 4% pendant 30 min à température ambiante sur une nutator. Ensuite, lavez immédiatement les embryons 5 fois en PBT pour 10 min. Gardez les embryons recouverts d&#39;une feuille de métal pour éviter l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Faire tampon de blocage en diluant tampon 5 X bloque dans le tampon d&#39;acide maléique à 1 X. Retirez les embryons de PBT et de les placer dans une mémoire tampon X blocage. Couvrir les embryons avec une feuille de métal et les nutate à température ambiante pendant 5 à 6 heures. </li><li> Après 5 à 6 heures du choc thermique de blocage, les embryons à 65 ° C pendant 15 à 20 min. </li><li> Obtenir la solution d&#39;anticorps et le LS 2% préparée la veille. Centrifuger la solution d&#39;anticorps au régime maxi. Transférer la phase aqueuse dans le tube LS 2%. Inverser le tube pour mélanger. </li><li> Transfert des embryons à partir du tampon de blocage au mélange LS-anticorps. Gardez les embryons recouverts d&#39;une feuille de métal pour éviter l&#39;exposition à la lumière. Nutate les embryons à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Le lendemain laver les embryons à la température ambiante 6 fois pendant 15 minutes dans le PBT. Préparer tampon AP (voir Préparation des solutions). </li><li> Laver les embryons à température ambiante 2 fois pendant 10 minutes dans le tampon de l&#39;AP. Préparer NBT / BCIP solution de développement (voir Préparation des solutions). </li><li> Transfert des embryons au NBT / BCIP. Laissez la tache se développer dans l&#39;obscurité. </li><li> Arrêtez le développement par le lavage des embryons 3 fois en PBT pour 5 mn chacun. </li><li> Pour l&#39;acquisition des images monter les embryons de 0,6% point de fusion bas agarose ou méthylcellulose 3%, et d&#39;acquérir des images à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé composé ou debout. </li><li> Échantillons photoactivé peut être conservé pour analyse future (coloration reste stable) en les déshydratant dans un lave-gradué EtOH. Suivez les étapes 4.4 à 4.7 pour la déshydratation des échantillons. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Photoactivation de cage fluorescéine-dextran. (A, B) clair et image de fluorescence d&#39;un embryon de poisson zèbre vue latérale au stade 13/14-somite avant photoactivation. (C, D) L&#39;embryon a été photoactivé au stade the13/14-somite dans l&#39;un des somites (flèche) avec une longueur d&#39;onde de 740 nm, temps de cycle de 31 secondes, et une puissance laser moyenne de 47 mW. Post-activation, (d) la fluorescence de la fluorescéine-dextran Uncaged est observée. Orientation: dorsale (à droite), ventrale (à gauche). La barre d&#39;échelle 100 um. <img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Immunodétection de cage fluorescéine-dextran. La figure 2 illustre l&#39;immunomarquage d&#39;Uncaged fluorescéine-dextran dans un embryon de poisson zèbre 18/19 HPF. Au stade 10 somites une petite région de l&#39;embryon a été activé dans le mésoderme de la plaque latérale en utilisant les paramètres du laser même déclaré à la figure 1. En utilisant la procédure immunodétection, la flèche identifie la région activée avec la coloration de fond minimal. Orientation: dorsale (haut), ventrale (en bas). La barre d&#39;échelle 100 um.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

<html> Ce document décrit une méthode polyvalente pour la cartographie de la cellule destin unique basé sur la photoactivation de cage fluorescéine-dextran. Uncaging des cages fluorescéine-dextran dans des cellules individuelles est réalisé en utilisant absorption à deux photons d&#39;un laser femtoseconde Maï Taï couplé au microscope Zeiss LSM 510 META confocale. Uncaged fluorescéine-dextran dans les cellules photoactivé est rapidement visualisées en utilisant une technique immunohistochimique simple. Dans ce protocole la longueur d&#39;onde d&#39;absorption à deux photons pour photoactivation de cage fluorescéine-dextran est de 740 nm. Cette longueur d&#39;onde a été déterminée expérimentalement par photoactivating cage fluorescéine-dextran embryons de type sauvage injecté. La longueur d&#39;onde d&#39;excitation laser a été variée de 600 à 800 nm, et la présence ou l&#39;absence de fluorescence de la fluorescéine après activation était qualitativement déterminé. Nous avons constaté que 740 nm produite l&#39;activation du signal le plus fort fluorescéine suivants. Idéalement, 740 nm devrait fonctionner pour tous les systèmes de modèle, mais nous vous conseillons de tester un éventail de longueurs d&#39;onde pour déterminer la longueur d&#39;onde d&#39;excitation optimale à deux photons pour votre échantillon. En cage fluorescéine-dextran embryons de type sauvage injecté, pour chaque longueur d&#39;onde d&#39;excitation à deux photons testé nous avons également fait varier la puissance du laser en moyenne. Pour une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 740 nm, une puissance laser moyenne de 47 mW produit un signal fort à la fluorescéine région activée en comparaison à la baisse des puissances laser moyenne. Supérieur puissances laser moyen n&#39;a pas de produire des signaux de fluorescéine plus fort, mais l&#39;ablation des tissus induits. Depuis impulsions laser femtoseconde sont efficaces à l&#39;ablation de tissus biologiques 15, nous recommandons de déterminer la puissance du laser seuil moyen pour la photoactivation qui évite l&#39;ablation des tissus. Absorption à deux photons se produit dans un volume faible interaction. Pour assurer l&#39;activation correcte de cage fluorescéine-dextran, la cellule doit être mis en évidence appropriée. Dans le protocole ci-dessus, cellules GFP-positives ont été simultanément imagé sous la lumière blanche pour confirmer l&#39;accent cellule. Par conséquent, l&#39;acquisition de lumière blanche en plus d&#39;autres canaux est conseillé. Après avoir confirmé l&#39;accent cellulaire, notre protocole suggère grossissant la cellule activée. Un facteur de zoom de 50 à 70 est suggéré, toutefois, cette valeur dépend de la taille de la cellule choisie. Accroître le zoom isole les cellules activées par les cellules adjacentes, et les limites de la zone de numérisation pour les deux photons d&#39;activation. Idéalement, la zone de numérisation devrait couvrir une grande surface de la cellule. Détection de simples cellules activées exige que le bruit de fond minime. Dans le protocole ci-dessus immunodétection, il est important que l&#39;échantillon est bloqué en tampon de blocage pendant 5 à 6 heures (étape 4.13). Lors du développement avec le NBT / BCIP, Uncaged fluorescéine-dextran devrait devenir visible dans 10 à 20 minutes. Si la coloration de fond est solide, nous proposons un temps plus long blocage et lavages supplémentaires pour retirer l&#39;anticorps (étape 4.17). Les figures 1 et 2 fournissent des résultats représentatifs de la photoactivation et immunodétection. Dans la figure 1, au début 1 - 2 cellules embryons au stade de type sauvage ont été injectés avec cage fluorescéine-dextran. Les embryons ont été soulevées à la mi somitogenèse et monté à faible fondre agarose dans l&#39;orientation latérale. La figure 1 (a, b) dépeignent clair et des images fluorescentes de l&#39;embryon avant photoactivation. Preuve que l&#39;embryon est resté Uncaged est démontré par l&#39;absence de fluorescéine fluorescence dans la figure 1 (b). Une petite région au sein d&#39;un somite a été activé avec une longueur d&#39;onde de 740 nm pendant 31 secondes en utilisant un laser de puissance moyenne de 47 mW, la figure 1 (c; flèche). Post-activation, à deux photons de la fluorescéine uncaging-dextrane produit comme indiqué par la fluorescence de la zone est activée, la figure 1 (d; flèche). L&#39;activation n&#39;a pas été accompagnée par ablation laser, comme le tissu somitique est restée intacte, la figure 1 (c). La figure 2 montre l&#39;immunodétection de Uncaged fluorescéine-dextran. Une petite région dans le mésoderme de la plaque latérale d&#39;un embryon au stade 10 somites a été photoactivé utilisant les paramètres du laser mêmes que ceux mentionnés dans la figure 1. L&#39;embryon a été soulevée et traitées en utilisant les étapes 4.1 à 4.20. La flèche de la figure 2 localise la région activée, comme indiqué par l&#39;accumulation de précipité bleu. Seul l&#39;emplacement est clairement détecté activé sans interférer coloration de fond. Préparation des solutions: 1 X PBT (1 L) 100 ml 10 X PBS 2 g de BSA 10 ml de Tween 20% 10 X PBS (1 L) 80 g de NaCl 2 g de KCl 6,1 g de Na 2 HPO 4 1,9 g de KH 2 PO 4 ddH 2 O à 1 L pH à 7,3 Paraformaldéhyde à 4% (160 ml) Paraformaldéhyde 32% (deux flacons de 10 ml) 8 ml 20 X PBS 132 ml ddH 2 O jove_content &quot;&gt; tampon AP (50 ml) 1 ml de NaCl 5 M 2,5 ml à 1 M MgCl 2 5 ml Tris 1 M pH 9,5 250 uL de Tween 20% 41,25 mL ddH 2 O Solution d&#39;anticorps (pour 1 échantillon) 5,5 uL poudre acétonique 40 ul PBT 0.8 LS uL 0,1 uL anti-fluorescéine-AP d&#39;anticorps LS 2% (360 ul pour 1 échantillon) 7.2 LS uL à 100% 352,8 uL PBT 1 X Danieau médias (1 L) ‡ 11,6 ml 5 M de NaCl 700 uL 1 M KCl 400 pi 1 M MgSO 4 600 pi 1 M Ca (NO 3) 2 5 ml 1 M HEPES ddH 2 O à 1 L pH 7,6 à s&#39;adapter à ‡ Danieau est une solution idéale de sel pour l&#39;élevage des embryons de poisson zèbre dechorionated. D&#39;autres médias peuvent être utilisés, à condition qu&#39;ils soient correctement avec des solutions isotoniques osmolarité (~ 300 mOsm pour le poisson zèbre) NBT Stock (1 ml) 50 mg Nitro Bleu de tétrazolium 0,7 ml d&#39;anhydride diméthyl formamide 0,3 ml ddH 2 O BCIP stock (1 ml) 50 mg de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate 1 ml d&#39;anhydride diméthyl formamide NBT / BCIP solution de développement 1 ml tampon AP 4,5 stock de NBT uL 3.5 Stock BCIP uL Poudre acétonique <ol><li> Sélectionnez 20 poissons adultes et les congeler dans l&#39;azote liquide. </li><li> Broyer les poissons congelés avec un mortier et un pilon pour obtenir une poudre. </li><li> Transférer la poudre de poisson dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Remplir le tube conique avec 100% d&#39;acétone. Vortexer le tube. </li><li> Spin le tube au régime maxi pendant 10 minutes. Jeter le surnageant. </li><li> Laver le culot encore 3 fois dans de l&#39;acétone à 100% et de spin le tube au régime maxi pendant 10 minutes. Par le dernier lavage du surnageant doit être limpide. </li><li> Ajouter 100% d&#39;acétone à la pastille à nouveau et laisser le tube à température ambiante. Les particules plus denses se déposent, tandis que les particules plus fines restent en suspension. </li><li> Décanter les particules fines dans un nouveau tube. Aliquoter la solution de poudre dans des tubes séparés et de les stocker à -20 ° C. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> CMNB-cage fluorescéine SE </td><td> Invitrogen </td><td> C20050 </td></tr><tr><td> 10 kDa aminodextrane </td><td> Invitrogen </td><td> D1860 </td></tr><tr><td> Colonne Zeba Spin Dessaler </td><td> Pierce </td><td> 89889 </td></tr><tr><td> Basse température de fusion d&#39;agarose </td><td> Amresco </td><td> 0815-100G </td></tr><tr><td> Borate de sodium </td><td> Amresco </td><td> 1131117-100G </td></tr><tr><td> Tricaïne méthylsulfonate / MS222 </td><td> Biologique Recherche </td><td> 1347A </td></tr><tr><td> Anti-fluorescéine-AP </td><td> Roche </td><td> 11376622 </td></tr><tr><td> Blocage de tampon </td><td> Roche Applied Sciences </td><td> 11 096 176 001 </td></tr><tr><td> L&#39;acide maléique </td><td> Sigma </td><td> MO375-500G </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> 15714 </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Sigma </td><td> I8377-250mg </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> Fischer Scientific </td><td> PI-34040 </td></tr><tr><td> Microinjecteur </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-2000 </td></tr><tr><td> LabTek chambrée lamelle diapositives </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 155380 </td></tr><tr><td> Protéinase K </td><td> Invitrogen </td><td> AM2544 </td></tr><tr><td> Agneau de sérum </td><td> Invitrogen </td><td> 16070096 </td></tr><tr><td> LSM 510 META ONL </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> 20X 0,8 NA Air apochromatique objectif </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Transparent filtre jaune </td><td> Théâtre House Inc </td><td> Couleur Roscolux feuille de filtre: 312 </td></tr></tbody></table>

single cell fate mapping in zebrafish

La capacité de l&#39;étiquette de façon différentielle des cellules individuelles a des implications importantes en biologie du développement. Par exemple, pour déterminer comment hématopoïétiques, les lignages vaisseau lymphatique et sanguin surviennent dans les embryons en développement nécessite la cartographie destin et la lignée de traçage des cellules précurseurs indifférenciés. Récemment, des protéines photoactivables qui comprennent: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, Kaede 4-7, pKindling 8 et 9 KikGR, 10 ont reçu un grand intérêt en tant que sondes de cellules de traçage. Le spectre de fluorescence de ces protéines photosensibles peuvent être facilement convertis avec excitation UV, permettant une population de cellules doit être distinguée de celles adjacentes. Cependant, le photoefficiency de la protéine activée peut limiter à long terme de cellules de suivi 11. Comme alternative aux protéines photoactivables, cage fluorescéine-dextran a été largement utilisé dans des systèmes modèles embryon 7, 12-14. Traditionnellement, pour uncage fluorescéine-dextran, l&#39;excitation UV d&#39;une lampe maison de fluorescence ou d&#39;un laser seul photon UV a été utilisé, cependant, de telles sources de limiter la résolution spatiale de photoactivation. Nous rapportons ici un protocole de cartographier le destin, trace la lignée, et de détecter les simples cellules marquées. Les cellules individuelles dans les embryons injectés avec cage fluorescéine-dextran sont photoactivé avec des impulsions laser dans le proche infrarouge produite par un laser femtoseconde titane saphir. Ce laser est de coutume dans tous les microscopes à deux photons confocale tels que le microscope LSM 510 META RNL utilisées dans ce document. Depuis les tissus biologiques est transparent pour l&#39;infrarouge proche d&#39;irradiation 15, les impulsions laser peut être focalisé en profondeur au sein de l&#39;embryon sans uncaging cellules au-dessus ou en dessous du plan sélectionné focale. Par conséquent, non-linéaire d&#39;absorption à deux photons est induit seulement au foyer géométrique pour uncage fluorescéine-dextran dans une seule cellule. Pour détecter la cellule contenant Uncaged fluorescéine-dextran, nous décrivons un protocole d&#39;immunohistochimie simples de 16 à visualiser rapidement la cellule activée. Le protocole d&#39;activation et de détection présenté dans cet article est polyvalent et peut être appliquée à tout système modèle. Remarque: Les réactifs utilisés dans ce protocole peut être trouvée dans le tableau annexé à la fin de l&#39;article.

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Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Une méthode est décrite pour photoactiver cellules individuelles contenant une protéine fluorescente utilisant cage absorption à deux photons à partir d&#39;un Ti: saphir oscillateur laser femtoseconde. Pour mapper le destin de la cellule photoactivé, l&#39;immunohistochimie est utilisée. Cette technique peut être appliquée à n&#39;importe quel type de cellule.

Simple cartographie du destin cellulaire chez le poisson zèbre

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K vues.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Une méthode est décrite pour photoactiver cellules individuelles contenant une protéine fluorescente utilisant cage absorption à deux photons à partir d'un Ti: saphir oscillateur laser femtoseconde. Pour mapper le destin de la cellule photoactivé, l'immunohistochimie est utilisée. Cette technique peut être appliquée à n'importe quel type de cellule.

Vidéo: Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

La transplantation de moelle rein entier chez le poisson zèbre pour adultes

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Recherche

Biologie

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Enregistrements aspiration simple cellule à partir de cônes photorécepteurs de la souris

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

Une approche pratique de la cartographie inductible destin génétique: un guide visuel à Mark et Track Cellules In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Cartographie sort des cellules souches embryonnaires humaines par la formation de tératome

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la régénération des adultes Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Les explants blastomères à l&#39;essai pour l&#39;engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Génération d&#39;dispersée présomitique mésoderme cultures cellulaires pour l&#39;imagerie de la segmentation Horloge poisson zèbre dans des cellules individuelles

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Identification de MyoD Interactome Utilisation Tandem Affinity Purification couplée à la spectrométrie de masse

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open Source Analyse unique pour particules super-résolution Microscopie avec VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...