Ce protocole peut être utilisé pour évaluer les attaches au nucléosquelette plutôt que d’utiliser le séquençage DamID, et il s’agit d’un test à cellule unique. Le principal avantage de l’utilisation de cette méthode est qu’elle est rentable et facilement accessible. Il peut mettre en évidence des différences fonctionnelles entre les gènes et les chromosomes qui ne se produisent pas normalement avec d’autres techniques de visualisation.
Les organisations spatiales et fonctionnelles au sein du génome dans les cellules cancéreuses et progériales traitées et les différences comportementales génomiques dans les cellules sénescentes peuvent être évaluées à l’aide de ce protocole. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel type de cellule ou de tissu tout au long de la vie et de n’importe quelle maladie. Il peut également être utilisé dans des organismes modèles où des sondes sont disponibles.
Pour commencer, préparez 500 millilitres d’acide chlorhydrique à 10% et versez-le dans un grand bécher. Déposer les lames de microscope individuellement dans l’acide et les incuber pendant une heure à température ambiante sur un shaker réglé sur deux G.Decant l’acide du bécher et laver les lames 10 fois à l’eau du robinet. Puis 10 fois de plus dans l’eau désionisée.
Rincez deux fois les lames dans du méthanol et conservez-les dans du méthanol jusqu’à la stérilisation. Renversez les lames sur une serviette en papier pour les sécher et enveloppez-les dans du papier d’aluminium pour les stériliser dans un autoclave ou un four chaud. Cultiver des cellules dans le milieu approprié avec du sérum pendant au moins 48 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce que 60 à 70% de confluence soit atteinte.
Récoltez chaque type de cellule et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ensemencez une fois 10 à cinq cellules dans 10 millilitres de milieu par lame. Retirez la boîte de culture contenant les lames et les cellules attachées de l’incubateur.
Jetez le support et étiquetez les lames à l’aide d’un crayon. Ensuite, placez-les dans un pot de coplin contenant 50 millilitres de tampon de cytosquelette glacé. Incuber le pot pendant 15 minutes sur de la glace ou à quatre degrés Celsius.
Jetez le tampon du cytosquelette et rincez rapidement les lames dans 50 millilitres de tampon de halo d’ADN à trois reprises en les trempant dans un pot de coplin avec le tampon. Transférer les lames dans un pot de coplin contenant 50 millilitres de tampon d’extraction et incuber pendant quatre minutes à température ambiante. Ensuite, incuber consécutivement les lames dans 50 millilitres de 10 fois, cinq fois, deux fois et une fois tampon de halo d’ADN pendant une minute chacune.
Lorsque vous avez terminé, trempez les lames dans une série séquentielle d’éthanol de 10, 30, 70 et 95% d’éthanol. Prenez les diapositives à travers une série séquentielle d’éthanol de 50 millilitres de 70, 90 et 100% d’éthanol pendant cinq minutes chacune. Séchez-les à l’air sur une plaque chauffante.
Ensuite, faites cuire dans un four à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes. Dénaturez les lames en les plaçant dans du formamide à 70% deux fois une solution de SSC pendant deux minutes à 70 degrés Celsius. Placez les lames dénaturées dans 50 millilitres d’éthanol glacé à 70% pendant cinq minutes.
Ensuite, déplacez-les à travers une série d’éthanol de 90, 95 et 100% à température ambiante pendant cinq minutes chacun. Lorsque vous avez terminé, séchez à l’air libre les lames sur une plaque chauffante. Dénaturez les sondes d’ADN à 75 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un bloc chaud ou un bain-marie.
Ensuite, incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avant de pipeter 10 microlitres sur la lame appropriée. Superposez la sonde avec un couvercle de 21 millimètres sur 21 et scellez-la avec du ciment en caoutchouc. Incuber les lames pendant au moins 18 heures à 37 degrés Celsius dans une chambre d’hybridation humidifiée.
Après l’incubation, retirez délicatement le ciment en caoutchouc avec une pince. Incuber ensuite les lames dans 50 millilitres de 50% formamide deux fois une solution de SSC à pH sept qui a été préchauffée à 45 degrés Celsius pour trois incubations de cinq minutes. Ensuite, placez les lames dans 50 millilitres de solution 0,1 fois SSC qui a été préchauffée à 60 degrés Celsius, mais placée dans un bain-marie de 45 degrés Celsius.
Incuber pendant cinq minutes et remplacer le tampon deux fois pour des incubations de cinq minutes. Placez les lames dans un pot de coplin contenant 50 millilitres de solution quatre fois SSC à température ambiante et incuber pendant 15 minutes avec trois changements de tampon. Pour éviter la liaison d’anticorps non spécifiques, appliquez 100 microlitres de solution 4% BSA quatre fois SSC sur chaque lame et superposez-la avec un morceau de film de paraffine.
Incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Incuber ensuite les lames avec 100 microlitres de streptavidine Cy3 diluée une sur 200 pendant une heure à température ambiante pour détecter la sonde marquée. Placez les lames dans un pot de coplin contenant 50 millilitres de solution quatre fois SSC à température ambiante et incuber pendant 15 minutes avec trois changements de tampon.
Montez les lames dans 20 microlitres d’une solution de montage contenant DAPI et superposez avec une glissière de couverture de 22 x 50 millimètres. Visualisez les halos d’ADN et les territoires chromosomiques à l’aide d’un microscope à épifluorescence avec un objectif d’huile 100X. La préparation du halo d’ADN permet de voir le bord d’un noyau résiduel, l’ADN restant dans le noyau résiduel et l’ADN non attaché qui s’est déplacé dans la zone environnante.
Des halos d’ADN de fibroblastes dermiques humains en prolifération ont été créés à partir de cellules avec BRDU incorporé et ensuite colorés avec des anticorps anti-BRDU. Les cellules proliférantes étaient positives pour BRDU et anti-pKi-67. Ce protocole a été utilisé pour visualiser les territoires chromosomiques dans les halos d’ADN.
Les chromosomes individuels ont été marqués avec des sondes de peinture chromosomiques spécifiques du bras entier pour les chromosomes 1, 13, 17 et 18. L’anti-pKi-67 a été utilisé pour marquer la prolifération des cellules et son absence au sein d’une même culture. Les préparations de halo d’ADN avec des télomères en vert sont montrées ici.
Il est possible d’observer la proportion de télomères dans le halo d’ADN, en particulier dans l’image de l’expérience deux. Le pourcentage moyen de télomères était d’environ 17% dans les cellules quiescentes. Des différences dans l’attachement chromosomique ont été détectées dans les fibroblastes de contrôle primaire et dans les cellules malades atteintes du syndrome typique et atypique de Hutchinson-Gilford progeria, exprimant une isoforme Sun1 différente et aucune mutation Lamin A.
Les chromosomes un et 13 montrent des différences statistiquement significatives dans leur attachement dans les noyaux résiduels par rapport aux halos d’ADN contrôlés. La position de l’ensemble du territoire chromosomique était corrélée au noyau résiduel et au halo d’ADN. Lorsque vous essayez ce protocole, assurez-vous que les cellules sont ensemencées à la bonne densité et extraites au bon moment.
Suite à cette procédure, une immunofluorescence indirecte et ARN FISH peuvent être effectuées.
