The authors would like to thank Mr. Ryan Hart and Mr. Arriz Lucas for their invaluable feedback on this communication. This work was supported by NIH NINDS R01 NS065052 and Phoenix Children&#8217;s Hospital Mission Support Funds.

NOTE: Toutes les procédures ont été effectuées en conformité avec le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université de l&#39;Arizona. Une liste des matériaux et équipements recommandés peut être trouvé dans le tableau 1. 1. Préparation des tissus <ol><li> Perfusion <ol><li> Euthanasier rongeur avec une overdose de pentobarbital sodique (25 mg / kg, IP), et perfuser transcardiaque avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) jusqu&#39;à complètement exsangue (3-5 min) à un débit de 8 ml / min. Pour obtenir des instructions de perfusion en profondeur, voir Gage et al 2012 9. </li><li> Immédiatement après PBS chasse d&#39;eau, réparer les tissus par perfusion avec 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant 15-20 min à un débit de 8 ml / min de débit. </li><li> Retirer le cerveau et dans 4% de paraformaldehyde pendant 24 heures, suivie de solutions de saccharose graduées (15%, 30%, 30%, en séquence, préparé dans une solution saline tamponnée tris) à 4 ° C. Transférer le cerveau postérieur à la solution de saccharose oeuls après que le cerveau a sombré dans chaque solution. Note: Habituellement, 5 jours dans chaque solution est suffisamment de temps pour les tissus de couler. </li></ol></li><li> La congélation de tissus et Cryosectioning <ol><li> Placez le cerveau en milieu d&#39;inclusion, tel que le composé PTOM et plonger dans l&#39;isopentane à une température de -35 ° C. Laisser le cerveau de geler pendant un minimum de 10 min, puis stocker à -80 ° C. Des problèmes peuvent survenir si la diligence à la température ne sont pas prises; s&#39;il vous plaît voir la discussion des informations de dépannage. </li><li> Couper coupes sériées coronales d&#39;une épaisseur de 20 um et une température de -20 ° C. Prélever des tissus sur des lames chargées positivement. coupes de cerveau peuvent être placés dans une boîte de diapositives enveloppé dans une feuille dans un sac zip-top et à long terme conservés à -80 ° C. Cette méthode de stockage crée une double frontière pour prévenir l&#39;exposition à l&#39;air et au gel. </li></ol></li></ol> 2. Traitement des tissus NOTE: Exemple équipements et matériaux rbligatoire pour la coloration sont présentés dans la figure 3. Des alternatives sont disponibles, cependant, ces images vont aider les nouveaux à la coloration immunohistochimique de visualiser les éléments appropriés avant d&#39;acheter. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> Figure 3: Exemple éléments nécessaires pour la coloration immunohistochimique La boîte noire montré en (A) est une chambre d&#39;humidité idéal pour immunofluorescence, sous forme de diapositives sont protégés de la lumière sans la nécessité d&#39;envelopper la boîte sur une feuille.. Après sectionnement, diapositives peuvent être stockés dans une boîte comme la boîte jaune montré en (B). Envelopper la boîte hermétiquement dans du papier et placer dans un sac zip-top avant la congélation permet de protéger les échantillons de tissus de brûlures de congélation. Un exemple de lames est donnée en (C), avec des plats différents de coloration décrits dans (D) et (E </strong&gt;). Lamelles peuvent varier en taille et en épaisseur (F), cependant 1.2 lamelles épaisses fournissent des résultats d&#39;imagerie de belles sur la plupart des microscopes droits et confocale. Un crayon telle que celle représentée dans (G) peut être utilisé pour marquer les diapositives. Marqueurs permanents doivent être évités car l&#39;encre peut fonctionner, affectant à la fois la coloration et la capacité de déterminer ce que l&#39;échantillon est. Un mini stylo pap tel que représenté dans (H) permet une frontière imperméable à tirer sur des lames. <ol><li> Préparation de lames <ol><li> Retirer les lames du congélateur et décongeler à température ambiante. <ol><li> Facultatif: Si sections ont déjà flotté à partir de diapositives, placez diapositives décongelés dans un four à 60 ° C pendant plus de 4 heures pour aider à prévenir des coupes de tissus de flotter hors diapositives. </li></ol></li><li> Placer les lames dans un rack de diapositives et plat correspondant. </li><li> Laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 min de chaque solution entre les lavages changer. De ce pas en avant, éviter d&#39;avoir sections sans liquide pendant de longues périodes de temps. Note: Si les sections se dessèchent, la coloration de fond est augmentée et des données significatives ne peut pas être obtenue de manière fiable. </li></ol></li><li> La coloration des tissus <ol><li> Dans une boîte de coloration étanche à la lumière, de créer une «chambre d&#39;humidité&quot; avec des tissus non pelucheux trempé avec de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Sécher les bords de la lame avec un tissu non pelucheux, utiliser un mini stylo pap à faire une bordure de répulsif des liquides à l&#39;orée de la diapositive, loin des coupes de tissus. Cette frontière devrait garantir suffisamment d&#39;espace entre la surface du bain de liquide et le bord du tissu de telle sorte que la tension de surface ne modifie pas la coloration. NOTE: Le répulsif frontière stylo pap peut être appliqué avant la 2.1.3 si les anticorps d&#39;intérêt ne nécessitent pas de micro-ondes récupération d&#39;antigène. Si la plume de Pap a été appliquée avant le lavage en PBS, l&#39;intégrité de la frontière imperméable au liquide doit être vérifiée à ce stade. Utilisez un stylo mini-pap pour combler les lacunes dans la frontière. </li><li&gt; Avec glissières fixées horizontalement, la liaison bloc antigène non spécifique par incubation à 4% v / v de sérum dans du PBS (solution de blocage). Pipette 300 pi de solution de bloc par diapositive pendant 1 heure à température ambiante. Assurez-vous que la solution de bloc étend à la plume de Pap au bord de la diapositive et recouvre complètement le tissu pour éviter les taches inégale causée par la tension de surface à proximité du tissu. <ol><li> Utilisation sérum de la même espèce dans laquelle l&#39;anticorps secondaire est effectué. Remarque: Dans cette procédure, les anticorps secondaires sont fabriqués en âne, et donc sérum âne est utilisé. Si des anticorps secondaires à partir de deux ou plusieurs espèces différentes sont utilisées, y compris le sérum de chaque espèce. </li></ol></li><li> Pipette anticorps primaire sur des lames. Remarque: Les concentrations d&#39;anticorps pour cette coloration ont été optimisés au 1: 5000 et 1: 500 pour Iba1 et Pan-neuronale, respectivement. Ces concentrations ont été trouvées pour montrer coloration significative avec une absence de coloration de fond. <ol><li> Diluer la solution de bloc1% de sérum dans du PBS et ajouter des anticorps primaires. Pipeter 300 ul de solution d&#39;anticorps primaire dans 1% de sérum par lame. Encore une fois, d&#39;assurer le fluide est au bord de la plume de Papanicolaou. Incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Inclure trois lames de contrôle: l&#39;une qui contient des anticorps ni Iba1 ni Pan-neuronales, une avec Iba1 sans anticorps pan-neuronal, et l&#39;un avec l&#39;anticorps pan-neuronal sans Iba1. Colorer ces diapositives dans la même série avec les mêmes solutions, cependant omettre les anticorps primaires pour tester la liaison non spécifique des anticorps secondaires. </li></ol></li><li> Le lendemain matin, laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 min de chaque solution entre les lavages changer. </li><li> Anticorps fluorescents sont sensibles à la lumière, donc, de ce pas en avant, de minimiser l&#39;exposition de lumière en veillant à conteneurs de lavage sont enveloppés dans des feuilles et d&#39;hybridation boîtes sont soit noir ou incubées dans l&#39;obscurité. Introduire à la pipette les anticorps secondaires appropriés sur toutes les diapositives et incuber60 min à température ambiante à une concentration de 1: 250 dans une solution de bloc (voir l&#39;étape 2.2.3) dans une &quot;chambre d&#39;humidité&quot; étanche à la lumière (voir l&#39;étape 2.2.1). <ol><li> Utilisez Anticorps secondaires de différentes longueurs d&#39;onde. Ici, pour le lapin d&#39;anticorps primaire anti-Iba1, utiliser âne de lapin anti-594 comme anticorps secondaire approprié. Pour la souris de l&#39;anticorps primaire anti-pan-neuronal, utiliser âne anti-souris 488 comme anticorps secondaire approprié. Alternativement, utiliser anti-lapin 488 et 594 anti-souris. </li></ol></li><li> Laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 minutes chacun. </li><li> Facultatif: effectuer une coloration nucléaire. <ol><li> Place à Hoechst (ou autre colorant nucléaire) à une concentration de 0,03 pg / ml dans le double H 2 0 distillée pendant exactement 60 secondes. </li><li> Laver les lames trois fois dans PBS pendant 5 minutes chacun. </li></ol></li><li> Laver à ddH 2 0. </li></ol></li><li> Lamelles <ol><li> Lames couvre-objet avec un milieu de montage aqueux, tels que Fluoromount-G ou ProlongGold. Prendre soin d&#39;enlever toutes les bulles à l&#39;aide d&#39;un coton-tige. Note: D&#39;autres agents de montage pourraient être utilisés, si haut purge à travers entre les colorants a été noté par certains au sein de jours de lamelles. </li><li> Utilisez vernis à ongles transparent pour sceller les bords, ce qui empêche les sections du dessèchement dû à l&#39;évaporation. Laisser sécher le vernis à ongles dans un récipient étanche à la lumière tout en diapositives restent à plat et à la température ambiante, puis stocker dans un récipient étanche à la lumière enveloppé dans une feuille à 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Imagerie Tissue Stained <ol><li> Microscopie <ol><li> Laisser le vernis à ongles à sécher pendant au moins une heure avant le début de la microscopie, qui devrait avoir lieu dans une pièce sombre. </li><li> Acquérir photomicrographies utilisant un microscope confocal ou d&#39;un microscope de recherche avec une source de lumière fluorescente et un module appareil photo numérique. Utilisation du logiciel d&#39;accompagnement, régler l&#39;exposition pour chaque longueur d&#39;onde - 405, 488, et 594 - séparément. Remarque: en profondeur des instructions d&#39;imagerie devraient être disponibles en ligne à partir du fabricant de microscope. </li><li> Acquérir photomicrographies dans chaque canal sans déplacer les sections ou d&#39;ajuster la mise au point. Prendre des images en couleur, en niveaux de gris ou en alternance et de les convertir à la couleur par la suite. Remarque: couleur ou en niveaux de gris de chaque canal peuvent être rassemblés dans le post-traitement. </li><li> Veiller à ce que les coupes de tissus ne sont pas exposés à la lumière ambiante ou la lumière microscopique pendant de longues périodes de temps, comme photo-blanchiment des sections aura lieu. Pour éviter cela, augmenter le temps d&#39;exposition plutôt que d&#39;augmenter l&#39;intensité lumineuse / laser. </li><li> Ne coupez pas la source de lumière fluorescente dans les 30 minutes d&#39;être allumé. Note: Changement de la source sur et en dehors en succession rapide peut diminuer la durée de vie de l&#39;ampoule fluorescente. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+antigens+and+antibodies.">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> J Immunol. 45, 159-170 (1942).</li><li>Marshall, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+adrenocorticotropic+hormone+by+histochemical+and+immunochemical+methods.">Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods.</a> The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).</li><li>Mellors, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+demonstration+of+the+in+vivo+localization+of+antibodies:+antigenic+components+of+the+kidney+and+the+pathogenesis+of+glomerulonephritis.">Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).</li><li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-labeled+antibodies:+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens.">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li><li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application.">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).</li><li>Cuello, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunohistochemistry. , (1983).</li><li>Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Junqueira's basic histology : text and atlas. , (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li><li>Christensen, N. K., Winther, L., Kumar, G. L., Rudbeck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. , 103-108 (2009).</li><li>Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+method+in+multiple-label+immunofluorescence+confocal+microscopy).">Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy).</a> Methods. 18, 459-464 (1999).</li><li>Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+sections+of+70-100+mum:+a+novel+technique+and+its+benefits+for+studying+the+nervous+system.">Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system.</a> Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;objectif global de cette communication était d&#39;introduire des procédures d&#39;immunohistochimie pour le lecteur. Pour cela, l&#39;exemple de double marquage avec Iba1 et antigènes Pan-neuronales pour observer les microglies et les neurones dans paraformaldéhyde perfusé, le saccharose cerveau cryoprotégés, rat cryosectioned a été utilisé. Cette technique peut être adaptée pour servir des fins interminables. Un tableau d&#39;antigènes différents dans une variété de t...

<html> L&#39;immunohistochimie est un procédé pour la détection d&#39;antigènes (par exemple des protéines) dans des coupes de tissu en utilisant des anticorps primaires qui se lient spécifiquement à des antigènes d&#39;intérêt. L&#39;immunohistochimie a été lancée par JR Marrack en 1934 quand il a déterminé que les anticorps peuvent localiser des antigènes avec une grande spécificité 1. A partir de 1942, une partie de la première des études in vitro utilisant des anticorps fluorescents pour visualiser immunohistochimie ont été publiés 2,3, après quoi la première étude in vivo histochimique a été publié 4. Au cours des années 1960, trois ans après le début de méthodes immunohistochimiques, des anticorps conjugués enzymatiques ont commencé à être utilisés comme réactifs secondaires. Ces méthodes ont été développées simultanément et indépendamment en France et aux Etats-Unis 5,6. Aujourd&#39;hui, un large éventail d&#39;anticorps offre des possibilités infinies pour les études d&#39;immunohistochimie 7. &quot;&gt; L&#39;objectif global de cette correspondance est de fournir une brève introduction dans la coloration immunohistochimique; il est pas censé être un examen complet et exhaustif de cette technique dans le procédé décrit, des techniques d&#39;immunohistochimie pour deux antigènes sont présentés (marqueurs de la microglie et. neurones) pour la coloration de paraformaldehyde perfusé, le saccharose cryoprotégés, le cerveau de rat cryosectioned. La coloration immunohistochimique commence par bloquer la liaison pour réduire la coloration de fond antigène non spécifique. Ensuite, l&#39;incubation avec l&#39;anticorps primaire permet de se lier à un antigène spécifique dans le tissu. À la suite de l&#39;anticorps primaire, un autre anticorps, appelé anticorps secondaire, est appliquée pour lier l&#39;anticorps primaire à un signal de visualisation conjugué 8. L&#39;anticorps secondaire cible de l&#39;immunoglobuline G (IgG) domaine spécifique de l&#39;espèce dans laquelle l&#39;anticorps primaire a été soulevée. L&#39;anticorps secondaire amplifie le signal de l&#39;anticorps primaire depuis les régions Fab de til anticorps secondaire se lient à des sites multiples sur le domaine IgG de l&#39;anticorps primaire. Chacune des enzymes ou des molécules fluorescentes conjuguées aux régions F c de l&#39;anticorps secondaire permettent la visualisation. Par exemple, un anticorps primaire anti-lapin Iba1 est une molécule d&#39;IgG de lapin spécifique pour Iba1. Lorsque âne anti-IgG de lapin est appliqué comme un anticorps secondaire, on reconnaître et se lier à de multiples régions de l&#39;anticorps de lapin anti-IgG Iba1 (voir figure 1). L&#39;anticorps peut être visualisé âne par divers procédés. Cette correspondance met l&#39;accent sur la détection d&#39;un fluorophore conjugué à l&#39;anticorps secondaire qui reconnaît l&#39;anticorps primaire, pour la visualisation par microscopie fluorescente. En immunohistochimie fluorescent, un colorant nucléaire Hoechst ou comme DAPI peut être utilisée pour visualiser tous les noyaux. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> Figure 1: Schreprésentation hématique des vs. directe des techniques de marquage d&#39;anticorps indirecte. anticorps se lient à l&#39;antigène d&#39;intérêt et peut être amplifié par des anticorps secondaires dirigés contre les espèces des anticorps primaires. Cette technique peut être effectuée en utilisant le complexe avidine-biotine (ABC) pour l&#39;amplification et pour la visualisation DAB (A), ou un anticorps secondaire fluorescent directement conjugué (B). Alternativement, des anticorps primaires peuvent être directement conjugués avec de nombreuses balises différentes, y compris la biotine ou un fluorophore (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Une méthode alternative pour la visualisation de la coloration immunohistochimique utilise le 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB; voir les figures 1 et 2). Cela diffère de la fluorescence en utilisant un ou biotinyléla peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à un anticorps secondaire, qui fournit une enzyme pour convertir DAB à un précipité qui est visible en microscopie à fond clair. Dans les cas où un seul antigène est d&#39;intérêt ou de coloration est appelé à être de longue durée, DAB peut être plus approprié de coloration fluorescente. Cependant, DAB coloration est pas bien adapté pour la différenciation entre des marqueurs multiples, en particulier si deux antigènes nucléaires présentent un intérêt. Pour plus d&#39;informations sur les matériaux de DAB et les modifications de protocole, consulter le tableau 1. En variante, un groupe nitro bleu de chlorure de tétrazolium / 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT / BCIP) peut être utilisée pour visualiser une phosphatase alcaline (AP) conjugué secondaire anticorps. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> Figure 2:. Des images représentatives de sections individuelles marqué DAB nickel améliorée rat tissus du cerveau de rat cerveau tilisezctions qui sont étiquetés avec des DAB de nickel-amélioré pour Iba1 (A) et Pan-neuronale (B) permettre une analyse de longue durée de la microglie ou neurones seul. Barre d&#39;échelle 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Il faut considérer l&#39;abondance estimée de l&#39;antigène d&#39;intérêt dans le tissu analysé. Les méthodes indirectes (comme décrit ci-dessus) sont utiles pour cibles avec une faible abondance. Lorsque l&#39;antigène d&#39;intérêt est en grande abondance, méthodes directes peuvent être appliquées. Les méthodes directes impliquent un anticorps primaire qui est directement conjugué à un signal de visualisation, et donc pas d&#39;anticorps secondaire est exigée. Cette méthode simplifie le processus de coloration, mais élimine l&#39;amplification réalisée par des méthodes indirectes. Utilisation d&#39;un anticorps primaire conjugué directement élimine également la réactivité croisée des anticorps secondaireslors d&#39;un double étiquetage. Cette communication détaille le protocole pour double marquage avec Iba1 et Pan-neuronales (détails dans le tableau 1). Iba1 colore la microglie dans de nombreux états d&#39;activation, notamment ramifiée, hyper-ramifié, activé, amoeboid, et la tige. Taches Pan-neuronales neuronale axones, dendrites, et Soma. Depuis Iba1 taches les plus microglie et les objectifs pan-neuronales le neurone, cette combinaison de taches est utile à acquérir une large compréhension des interactions neurone-microglie. En somme, la coloration immunohistochimique repose sur la sélection rigoureuse des anticorps. Comme la question de la recherche devient plus spécifique, des anticorps dirigés contre les antigènes de rechange peuvent être souhaités. Pour cibler un état d&#39;activation de la microglie spécifique, on peut choisir d&#39;utiliser CD45 ou CD68, plutôt que Iba1. En outre, en travaillant avec des souris, F4 / 80 peut fournir les résultats nécessaires. De même, les éléments neuronaux peuvent être spécifiquement ciblées avec des anticorps raised contre le noyau, synapse (avant ou après), axone, et le cône de croissance. En outre, il ya d&#39;autres marqueurs qui différencient l&#39;âge du neurone (Double-Cortin, NeuN), et la régénération neuronale (GAP-43).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1171">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:523px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-034-979</td>
			<td>Used for tissue mounting (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Oven</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51028112</td>
			<td>Used for tissue drying (2.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mini Pap pen</td>
			<td style="width:132px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">00-8877</td>
			<td>Used in step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-149-429</td>
			<td>Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-666-A</td>
			<td>Used for drying slides (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Black Staining Box</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:119px;">21050</td>
			<td>Used for blocking and staining steps (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-413-253</td>
			<td>Used for block and antibody incubation (2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse &#945;-Pan-neuronal</td>
			<td style="width:132px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB2300</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rabbit &#945;-Iba1</td>
			<td style="width:132px;">Wako Chemical</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td>Used for primary antibody (2.2.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-Rabbit 594</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">711-585-152</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Donkey &#945;-mouse 488</td>
			<td style="width:132px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-545-150</td>
			<td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Caterer&#39;s foil</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used in steps 1.2.2 and 2.3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:132px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:119px;">0100-01</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Coverslips</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12544E</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Clear Nail Polish&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Any</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for coverslipping (2.2.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Axioskop A2</td>
			<td style="width:132px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Used for imaging (3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CitriSolv&#160;</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ABC</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAB Peroxidase kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1100</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated horse &#945;-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-2001</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Wheaton slide racks and staining dishes</td>
			<td style="width:132px;">TedPella</td>
			<td style="width:119px;">21043</td>
			<td>For DAB protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Masterflex perfusion pump and tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td>Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Thermometer (-50 to 50 C)&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15-059-228</td>
			<td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>CM3500S</td>
			<td>Used for tissue sectioning (1.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining Dish, Plastic with 2 Lids</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>353</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 Place Staining Rack, Slides Horizontal</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>354</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microwave</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For antigen retrival</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons

Immunohistochimie est une technique largement utilisée pour détecter la présence, l&#39;emplacement et l&#39;abondance relative des antigènes in situ. Ce protocole de niveau d&#39;introduction décrit les réactifs, le matériel et les techniques nécessaires pour compléter la coloration immunohistochimique du tissu cérébral des rongeurs, en utilisant des marqueurs pour les microglies et les éléments neuronaux comme un exemple. Plus précisément, ce document est un protocole étape par étape pour la visualisation fluorescente des microglies et les neurones via immunohistochimie pour Iba1 et Pan-neuronale, respectivement. Fluorescence double marquage est particulièrement utile pour la localisation de multiples protéines dans le même échantillon, en fournissant la possibilité d&#39;observer avec précision les interactions entre les types de cellules, des récepteurs, des ligands, et / ou de la matrice extracellulaire par rapport à l&#39;autre ainsi que des protéines co- localisation à l&#39;intérieur d&#39;une seule cellule. Contrairement à d&#39;autres techniques de visualisation, la fluorescence immunohistochimie intensité de la coloration peut diminuer enles semaines ou mois suivants coloration, à moins que des précautions appropriées soient prises. Malgré cette limitation, dans de nombreuses applications fluorescence double marquage est préférée à d&#39;autres solutions telles que la 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) ou la phosphatase alcaline (AP), en tant que fluorescence est plus efficace du temps et permet la différenciation plus précise entre deux ou plusieurs marqueurs. La discussion inclut des trucs et conseils pour favoriser la réussite de dépannage.

Ce protocole de coloration résultats dans des coupes de tissus de cerveau de rat qui ont microglie marquées par fluorescence dans le canal 594 (rouge) et neurones marqués dans le canal 488 (vert; voir la figure 4). Si un colorant nucléaire a été fait, il apparaîtra dans le canal 405 (bleu). Les images peuvent être prises dans les différents canaux et superposées pour une comparaison directe des trois canaux, ou entre deux chaînes. De nombreuses suites logicielles d&#39;acquisition numériques...

Watch this Scientific Journal Video about Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons at JoVE.com

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primaire pour Immunohistochimie sur tissus Cryosectioned cerveau de rat: Exemple coloration pour microglies et les neurones

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

primer-for-immunohistochemistry-on-cryosectioned-rat-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.6K vues.  University of Arizona College of Medicine - Phoenix. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example. 

Vidéo: Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Étiquetage DiOLISTIC des neurones à partir de rongeurs et non-humains tranches de cerveau des primates

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Recherche

Neurosciences

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation des neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et de l&#39;image terminaisons présynaptiques

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

Immunohistochimie Wholemount de la topographie du cerveau révélatrice complexe

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Analyse immunohistochimique dans le système nerveux central et périphérique Rat ganglionnaire sections de tissu

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Préparation du Primat tissu cérébral non humain pour immunohistochimie pré-enrobage et microscopie électronique

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolement et Extraction de l’ARN des neurones, les Macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As the first responders, microglia have important functions to mitigate neuron and glia dysfunction, and in this process, they undergo a broad range of morphologic changes. Microglia morphologies can be categorized descriptively or, alternatively, can be quantified as a continuous variable for parameters such as cell ramification, complexity, and shape. While methods for quantifying microglia are applied to single cells, few techniques apply to multiple microglia in an entire photomicrograph. The purpose of this method is to quantify multiple and single cells using readily available ImageJ protocols. This protocol is a summary of the steps and ImageJ plugins recommended to convert fluorescence and bright-field photomicrographs into representative binary and skeletonized images and to analyze them using software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) and FracLac for morphology data collection. The outputs of these plugins summarize cell morphology in terms of process endpoints, junctions, and length as well as complexity, cell shape, and size descriptors. The skeleton analysis protocol described herein is well suited for a regional analysis of multiple microglia within an entire photomicrograph or region of interest (ROI) whereas FracLac provides a complementary individual cell analysis. Combined, the protocol provides an objective, sensitive, and comprehensive assessment tool that can be used to stratify between diverse microglia morphologies present in the healthy and injured brain.

Microglia are brain immune cells that survey and react to altered brain physiology through morphologic changes which may be evaluated quantitatively. This protocol outlines an ImageJ based analysis protocol to represent microglia morphology as continuous data according to metrics such as cell ramification, complexity, and shape.

Quantifier les cellules microgliales morphologie de microphotographies d’immunohistochimie préparé des tissus à l’aide de ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.