La coloration immuno-histochimique du cerveau des souris est une technique couramment utilisée dans la recherche en neurosciences. Cependant, la qualité, la fiabilité et la reproductibilité des résultats de l’histologie cérébrale peuvent varier d’un chercheur et d’un laboratoire à l’autre. Nous présentons une méthodologie établie pour les études histologiques du cerveau de souris qui s’est avérée reproductible, fiable et efficace.
Le Dr Chunmei Wang, professeur adjoint de mon laboratoire Après avoir confirmé une anesthésie réussie chez une souris noire C57 / 6J âgée de huit à 16 semaines, fixera la souris sur une planche de mousse et fera une incision superficielle longitudinale le long de la ligne médiane sur le thorax et l’abdomen, puis déplacez la peau pour exposer la paroi musculaire du thorax et de l’abdomen. Ensuite, faites une incision dans la couche musculaire pour exposer le foie et l’intestin. Ensuite, à l’aide de ciseaux, coupez la cage thoracique pour ouvrir le thorax et exposer le cœur et les poumons.
À l’aide de pinces hémostatiques, tirez la cage thoracique de côté pour élargir la zone de travail. Prochain. pour placer une canule de perfusion, pénétrer directement dans le ventricule cardiaque gauche avec une canule émoussée et l’insérer soigneusement dans l’aorte ascendante. Placez des broches autour de la conjonction de la canule et du tube couplé sur le panneau de mousse pour fixer la canule en place pendant la perfusion, et procédez à la coupe de l’oreillette droite pour permettre l’écoulement du sang de la circulation.
Pour la perfusion avec une solution saline, allumez le pressostat salin et perfuser la souris de manière transcardique avec 40 à 60 millilitres de solution saline. Observez de près l’écoulement de l’oreillette droite et la couleur du foie. Ensuite, pour perfuser avec du formol, éteignez le pressostat salin et allumez le pressostat de formol pour perfuser la souris avec 40 millilitres de formol tamponné à 10%.
Observez les membres de l’animal pour détecter des signes de tremblements. Pour l’isolement cérébral, utilisez des ciseaux pour retirer la tête et faites une incision de la ligne médiane le long du tégument pour exposer le crâne, puis coupez la peau et l’attachement musculaire. Ensuite, faites une coupe à la crête orbitale et placez l’extrémité pointue des ciseaux d’iris dans le foramen magnum.
Avancez les ciseaux le long de la surface interne du crâne, en maintenant la pression vers le haut pour éviter d’endommager le cerveau. Ensuite, retirez soigneusement les os pariétaux et frontaux et les méninges avant de retirer le cerveau du crâne ouvert. Placez de la glace carbonique sur la plaque de réglage de la hauteur d’un microtome coulissant et attendez que le gel blanc soit visible, puis étalez soigneusement cinq millilitres de saccharose à 30% sur le dessus de la plaque pour former une couche de base solide après le gel du saccharose.
Ensuite, placez tous les échantillons de cerveau horizontalement dans une ligne au-dessus de la base de saccharose avec 500 microlitres de saccharose à 30%. Après cinq à 10 minutes de congélation, lorsque le cerveau est devenu dur et blanc, coupez le cerveau jusqu’à ce que la couche ou la région souhaitée soit atteinte, puis passez du mode de coupe au mode d’alimentation et coupez le tissu cérébral pour générer des sections de 25 micromètres d’épaisseur. Ensuite, préparez une plaque de 48 puits remplie de PBS et marquez cinq puits pour un cerveau de souris.
À l’aide d’un pinceau, collectez une section et placez-la dans un puits, puis collectez la section suivante de la même souris et placez-la dans le deuxième puits. Répétez la procédure jusqu’à ce que le cinquième puits soit atteint en plaçant les sections six à 10 dans le premier au cinquième puits, et ainsi de suite. Placez une passoire cellulaire dans un puits d’une plaque de culture cellulaire de six puits remplie de PBS et, à l’aide d’un pinceau, transférez une série de sections cérébrales dans la passoire cellulaire.
Rincez ces sections dans PBS en transférant la passoire cellulaire dans un autre puits rempli de PBS sur le shaker. Ensuite, transférez les sections cérébrales de la passoire cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre contenant un millilitre de WFA marqué à la biotine et incubez sur une plate-forme à bascule à 50 tr / min pendant la nuit. Le lendemain, rincez les sections du cerveau avec du PBS comme démontré précédemment, puis transférez les sections dans un tube contenant un millilitre de solution de streptavidine-lumière du jour 488 et incubez pendant deux heures sur une plate-forme à bascule.
Après avoir rincé à nouveau les sections du cerveau avec du PBS, incubez-les dans un tampon bloquant pendant deux heures, suivi d’une incubation dans un anticorps primaire pendant la nuit sur une plate-forme à bascule. Le lendemain, après les rinçages PBS, incuber les sections dans un anticorps secondaire pendant deux heures. Remplissez deux boîtes de Petri avec 100 millilitres de PBS et transférez toutes les sections du cerveau d’une passoire dans le premier plat.
Aligner les sections du cerveau dans l’ordre neuroanatomique du caudal au rostral. Ensuite, immergez une glissière dans le deuxième plat avec une extrémité légèrement inclinée avec un support et, à l’aide d’un pinceau fin, placez doucement une section cérébrale juste en dessous de l’interface tampon d’air sur la glissière inclinée. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert, retirez lentement et doucement le tampon pour abaisser son niveau jusqu’à ce que la section du cerveau soit entièrement au-dessus de l’interface du tampon d’air.
Continuez à répéter ce processus jusqu’à ce que le bas de la diapositive soit atteint et que toutes les sections soient montées sur la diapositive. Pour l’imagerie, allumez le scanner et l’ordinateur, puis positionnez les diapositives dans le support de diapositive avec le dispositif de chargement et insérez le support dans le scanner. Ouvrez le logiciel du scanner et choisissez l’emplacement de stockage et le profil de numérisation appropriés.
Démarrez l’analyse d’aperçu en cliquant sur le bouton Démarrer l’analyse d’aperçu. Après l’analyse, ouvrez l’assistant de détection de tissus et encerclez les régions d’intérêt pour l’imagerie. Après avoir choisi les régions pour l’imagerie, cliquez sur le bouton Démarrer l’analyse et attendez que la machine termine la numérisation.
Vérifiez le fichier de résultats et exportez les images. Voici des images immuno-histochimie à fluorescence représentative de sections cérébrales de souris coronales à 0,82 millimètres de Bregma négatif, montrant la distribution de la glycine floribunda agglutinine, de la vasopressine d’arginine et de la DAPI. Les signaux d’agglutinine de Wisteria floribunda sont observés dans la zone péridurienne de l’hypothalamus antérieur et du noyau réticulaire, tandis que les signaux de vasopressine d’arginine sont observés dans le noyau paraventriculaire.
Lorsque vous essayez ce protocole pour la première fois, nous vous suggérons de l’exécuter sous la supervision d’un chercheur expérimenté. Le protocole aidera à générer des résultats histologiques optimaux et cohérents entre différents chercheurs et laboratoires, et servira de référence pour les débutants apprenant cette technique.
