Les auteurs reconnaissent Ryan Chaplin et le Dr Gregg Rentfrow de l&#39;Université du Kentucky Viandes Lab et le ministère des animaux et des sciences alimentaires de fournir des occasions de recueillir des tissus expérimentales utilisées ici.

Les procédures utilisées dans cette étude n&#39;avaient pas besoin de l&#39;approbation de l&#39;Université du Kentucky protection des animaux et l&#39;utilisation Comité car aucun des animaux vivants ont été utilisés. Avant la collecte de tout échantillon utilisé ici, tous les animaux ont été assommés avec une tige perforante et vidés de leur sang. Ceci a été effectué dans un centre de abattoir inspecté par le gouvernement fédéral à l&#39;Université du Kentucky. Un représentant officiel de la sécurité et de l&#39;inspection des services alimentaires USDA observé toutes les activités qui traitent de l&#39;animal vivant et la manipulation de la carcasse. 1 Préparation de l&#39;Instrumentation <ol><li> Pour minimiser la quantité de temps entre les collectes d&#39;échantillons de tissus au début de l&#39;expérience, mettre en place des équipements et préparer des tampons avant de recueillir le tissu expérimental (ou si le personnel supplémentaires sont disponibles, ces tâches peuvent se produire simultanément). NOTE: Ce ne fournit pas seulement la plus grande quantité de temps que le tissu reste viable pour mener des expériences, mais certainsexpériences peuvent fonctionner pendant de longues périodes de temps (ou il ya un désir de remplir de multiples expériences dans une journée), donc il est généralement souhaitable de commencer le plus tôt possible. </li><li> Allumez l&#39;ordinateur associé, le matériel d&#39;acquisition de données, bain d&#39;eau (pour le tampon (s)) et myographe unité (s). Placez l&#39;équipement d&#39;étalonnage de l&#39;appareil (s) de myographe et tournez à feu myographe (préréglée à 37,5 ° C) et permettre aux unités et d&#39;étalonnage se réchauffer à la température préréglée. <ol><li> Ouvrez un fichier de paramètres du logiciel graphique créé précédemment sur l&#39;ordinateur et commencer une course (mais pas l&#39;acquisition de données). </li></ol></li><li> Réchauffez-vous l&#39;équipement pour 10 min. <ol><li> Lancer l&#39;acquisition de données. </li><li> Zéro tous les canaux. </li><li> Vérifier et procéder à l&#39;étalonnage (si nécessaire) de chaque canal (4 canaux par multimyograph) pour normaliser le signal électrique fourni par le transducteur de force respectif associé à ce canal d&#39;une 2-g force fournie par un poids certifié. </li><li> Après calibration et une conversion d&#39;unités sont terminées, stocker toutes les données ultérieures que grammes. Modifier en conséquence en fonction des désirs de chaque laboratoire indépendant; le matériel et le logiciel permettent l&#39;utilisation d&#39;autres appareils, tels que milliNewtons et volts. </li></ol></li><li> Assurez-vous que les conduites de gaz sont clairement des blocages et tourner sur l&#39;approvisionnement en gaz (95% d&#39;O 2/5% de CO 2) à myographe (s) unités. Tous les tampons de gaz sans interruption (dans les chambres de myographe) pendant toute la procédure. </li><li> Remplir toutes les chambres de myographe avec 70% d&#39;éthanol et laisser tremper pendant 10 minutes, éliminer l&#39;éthanol, et répétez l&#39;opération pour un deuxième 10 minutes de trempage. <ol><li> Après élimination de l&#39;éthanol, rincer trois fois à l&#39;eau déminéralisée, suivis par trois rinçages avec le tampon préparé (voir la section 2 pour la préparation de tampon), laissant la troisième addition de tampon dans les chambres. NOTE: A ce stade, l&#39;équipement peut rester inactif dans cet état jusqu&#39;à ce que le tampon et les tissus sont préparés et le personnel est prêt à procéder à des expérit. </li></ol></li></ol> 2 Préparation des tampons <ol><li> Préparer une solution de tampon de 1 L de Krebs-Henseleit à utiliser dans le transport et le traitement d&#39;échantillons de tissus pour obtenir des concentrations finales de 11,1 mM de D-glucose; 1,2 mM MgSO4; 1,2 mM KH 2 PO 4; KCl 4,7 mM; NaCl 118,1 mM; 3,4 mM de CaCl 2; 24,9 mM NaHCO 3. <ol><li> Mélanger 9,6 g de sels Krebs dans environ 900 ml d&#39;eau déminéralisée sur une plaque d&#39;agitation. </li><li> Mélanger 0,373 g de dihydraté de chlorure de calcium, suivi par 2,1 g de bicarbonate de sodium par litre de tampon souhaitée. </li><li> solution tampon de gaz pendant 20 min avec 95% O 2/5% CO 2. </li><li> Après gazage, ajuster le pH à 7,05 (filtration de tampon pH augmente; pH final cible devrait être 7.4) et ajuster le volume à 1 L. </li><li> Stériliser par filtration tampon dans un tampon propre autoclave de médias 1 L de la bouteille et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Préparer séparé Krebs-Hsolution tampon enseleit pour une utilisation dans des expériences de myographe comme décrit dans l&#39;étape 2.1 pour le transport tampon Krebs-Henseleit avec des composés supplémentaires qui se rapportent aux expériences de contractilité. REMARQUE: En règle générale 2 L suffira pour les expériences décrites dans cet article, mais ce volume peut être augmenté ou réduit en fonction de la durée de l&#39;expérience, le nombre de chambres de myographe, et le remplacement des tampons de nombre (par rapport aux ajouts de traitement). <ol><li> Préalablement à l&#39;étape d&#39;introduction de gaz (étape 2.1.3), ajouter 9,1 mg (par L de tampon en cours de préparation) de la désipramine-HCl à un tampon. </li><li> Préparer une solution de propranolol HCl 1,0 uM et ajouter 1 ml (par L de tampon en cours de préparation) de cette solution à la solution de tampon de Krebs-Henseleit. Faire de cette mémoire tampon sur le jour de l&#39;utilisation et conserver à une température de myographe exploitation (une température qui donne une température de 37,5 ° C dans le myographe). NOTE: La désipramine est ajouté à inhiber les mécanismes de la recapture de amine biogèneet permettre la compensation des ajouts expérimentales de la mémoire tampon baignant les vaisseaux sanguins à se produire plus rapidement. L&#39;addition de propranolol empêche la liaison non spécifique de composés de traitement de β-adrénergiques. </li></ol></li></ol> 3. prélèvement et la préparation de la vascularisation <ol><li> Dès que possible, retirez le tractus gastro-intestinal de la carcasse. Une fois que l&#39;animal ne présente plus aucun réflexe involontaire, enlever la tête et se cacher, puis soulever la carcasse verticalement. Suppression des viscères gastro-intestinal (œsophage à l&#39;anus) de la carcasse doit être rempli par le personnel des abattoirs agréés (&lt;20 min de temps de l&#39;étourdissement). REMARQUE: Combien de temps, est généralement limitée par l&#39;emplacement / installation où le tractus intestinal sont recueillis et de procédures normalisées d&#39;exploitation ou des procédures prescrites par le gouvernement fédéral, suivi par le personnel de l&#39;établissement. <ol><li> Dans la plupart des installations, effectuer des manipulations de l&#39;appareil gastro-intestinalà un emplacement distinct de la transformation de la carcasse qui est destiné à entrer dans la chaîne alimentaire. Utilisez une proximité commode où le tractus gastro-intestinal peut être pris et étalé pour examen. </li></ol></li><li> Une fois que le tractus gastro-intestinal est étalé, identifier l&#39;intestin grêle, le pli iléo-caecale de liaison à l&#39;intestin grêle caecum et le rebord s&#39;étendant iléale proximale à la fois iléo-caecale (Figure 1A). <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un scalpel ou d&#39;un couteau, faire une incision très légèrement dans la membrane du mésentère au centre de la bride de l&#39;iléon. Avec deux doigts d&#39;index, carrément disséquer le tissu adipeux et conjonctif exposer le système vasculaire mésentérique (figure 1B). </li></ol></li><li> De cette bride ou d&#39;un renflement dans le mésentère intestinal, disséquer plusieurs branches (~ 2 cm de longueur) de l&#39;artère et la veine mésentériques faisceaux exposés qui prennent en charge cette partie de l&#39;iléon (figure 1C). <ol><li> Si uchanter une pince pour saisir les tissus, prendre soin de ne pas saisir directement ou tirer sur les vaisseaux sanguins à tout en les enlevant comme une sorte d&#39;étirement peut endommager et effectuer les performances du tissu 14. l&#39;enlèvement du vaisseau sanguin est préférable de faire, en coupant à travers chaque extrémité de la section à supprimer, puis coupe le long ou parallèlement à la section maintenant isolé. Pour plus de facilité, on peut enlever le tissu environnant ainsi que les navires de fournir un peu de tissu à saisir avec une paire de pinces. </li><li> Avec une pince, plonger l&#39;échantillon de tissu dans un tube contenant du tampon de Krebs-Henseleit froid glace et de stocker de la glace jusqu&#39;à transformation peut se produire dans le laboratoire. </li></ol></li><li> Placez échantillon de tissu sur une surface de coupe ou dans une boîte de Pétri et submerger partiellement glacée Krebs-Henseleit. <ol><li> Utilisation # 5 bijoutiers forceps, Noyes iris ciseaux et lampe loupe ou dissection portée (2.5 à 5.0x grossissement est suffisant), soigneusement disséquer le rappro graisse et ses environsve tissus et séparer l&#39;artère et la veine. Identification de l&#39;ouverture de l&#39;enceinte à une extrémité de la section et de saisir soigneusement le fascia entourant le récipient avec des pinces. </li><li> Faire une découpe avec des ciseaux parallèles à la cuve en faisant glisser la pointe du ciseau sous la planche de bord en relief. Après l&#39;incision initiale, la graisse et les tissus conjonctifs peuvent encore être détachés du récipient en réduisant part et d&#39;autre avec des ciseaux. Veiller à ce que les navires soient aussi propres que possible tout en minimisant la quantité de temps les navires passent sur le banc. </li><li> Retour vaisseaux sanguins à des tubes de tampon et magasin de Krebs-Henseleit frais à 4 ° C (échantillons peuvent rester stockés jusqu&#39;à 24 heures après la collecte et produire encore des données de contractilité valides). </li><li> En utilisant une lame de rasoir, récipient de tranche à utiliser dans myographe en nombre voulu de sections de 2 mm (il est utile d&#39;utiliser un limiteur de tissu pour obtenir des sections transversales uniformes). </li><li> Examinez chaque section sous un sco de dissectionpe (12,5X grossissement) de veiller à ce que chaque section a aucune anomalie, des branches, des distributeurs ou des dommages superficiels fait par inadvertance lors de la dissection et de nettoyage. Remplacer la section du navire s&#39;il ya une anomalie, branche, vanne, ou des dommages superficiels. </li></ol></li><li> des sections de magasins acceptables tranches de navires (immergées dans un tampon de Krebs-Henseleit) sur de la glace ou à 4 ° C jusqu&#39;au moment de monter dans des chambres de myographe (généralement &lt;30 min). </li><li> Monter doucement le navire sur la myographe en insérant les supports à travers la lumière et augmenter la tension (en utilisant micropositionneur sur le myographe) en faisant attention de ne pas étirer les navires ci-dessus 2 à 3 g de lecture. </li><li> Une fois que toutes les chambres sont couvertes, vide le tampon de toutes les chambres et le remplir avec 5,0 ml de tampon et démarrer une minuterie 15 min pour commencer la période d&#39;équilibrage et de l&#39;expérience. </li></ol> 4 Expérience <ol><li> Equilibrer toutes les sections du navire pendant 1,5 heure pour parvenir à une résolution stablesting tension de 1,0 g. <ol><li> Remplacer le tampon d&#39;incubation de Krebs-Henseleit toutes les 15 min. </li><li> Au cours de l&#39;équilibrage, ajuster en permanence la tension sur les sections des vaisseaux sanguins jusqu&#39;à 2 g et permettre ensuite de se détendre jusqu&#39;à environ 0,80 g. Essayez de ne pas permettre aux navires de se détendre trop (ils peuvent glisser les supports). Essayez d&#39;obtenir une tension de référence stable, où le navire est titulaire tension de 1 g sans nécessiter de réglage. </li></ol></li><li> Au cours de l&#39;équilibrage, de préparer une solution aqueuse 1,32 M de KCl à être utilisé en tant que référence. </li><li> Après la réalisation d&#39;un équilibre satisfaisant, ajouter 500 ul de la solution 1,32 M de KCl pour donner lieu à une solution 0,12 M dans 5,5 ml de la solution baignant la cuve. <ol><li> Après l&#39;addition de la 1,32 M de KCl, ne pas ajuster manuellement la tension dans la réponse maximale à partir de cette addition est utilisé pour évaluer la viabilité des tissus et peut être utilisé pour normaliser les données de traitement (par exemple les réponses à une concentration d&#39;ungonist). </li><li> Remplacez la solution à intervalles de 15 min jusqu&#39;à ce que la tension est revenue à la valeur de référence de 1,0 g. </li></ol></li><li> Une fois la ligne de base est atteint, changer le tampon et commencer simultanément un chronomètre de 1 min. Faites de même pour toutes les chambres en même temps pour éviter un étalement des heures de début. <ol><li> Vortex la norme à ajouter et préparer un commentaire pour la chambre 1 au cours de la 1 min compte à rebours. </li><li> Ajouter les normes en aliquotes de 25 pi de chaque chambre que les impératifs de l&#39;expérience (ce qui maintient le traitement inférieure à 0,5% du volume total). </li><li> Lorsque le dernier type a été ajoutée, lancez une minuterie 9 min. </li><li> A la fin de la 9 min d&#39;incubation standard, retirer le tampon contenant traitement des chambres et ajouter 5,0 ml de tampon frais, et démarrer la minuterie de 2,5 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.4.4. </li><li> A la fin de la seconde 2,5 min rinçage, vide les chambres et ajouter un tampon frais, et commencer une minuterie 1 min le compte à rebours du début de la seconded addition d&#39;étalon. </li></ol></li><li> Continuer ce cycle pour l&#39;ensemble des ajouts dosés de la journée. </li><li> Pendant l&#39;addition de la norme définitive et après 9 minutes d&#39;incubation préparer le composé de référence de 1,32 M de KCl à la fin de l&#39;addition de la dose de référence de l&#39;exécution de 500 pi. </li><li> Après l&#39;intervalle de 1 min après l&#39;addition finale de traitement, ajouter le KCl et commencer une minuterie 9 min. NOTE: L&#39;addition de KCl est de confirmer la viabilité des tissus à la fin de l&#39;expérience et est utile si l&#39;administration d&#39;un traitement qui conduit à une réponse négligeable. </li><li> A l&#39;issue de la finale 9 min composé de référence incubation, aspirer ou éliminer le tampon de toutes les chambres. Ne pas ajouter de tampon frais. Conclure l&#39;expérience. </li><li> Enregistrer le fichier graphique, supprimer des sections de vaisseaux sanguins et l&#39;éliminer correctement, et suivre le protocole de nettoyage (fournie par le fabricant et peuvent être spécifiques laboratoire) pour les équipements de myographe. </li></ol>

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Mention du nom commercial, produit breveté, ou l&#39;équipement spécifié ne constitue pas une garantie ou garantie par l&#39;USDA et n&#39;implique pas l&#39;approbation de l&#39;exclusion d&#39;autres produits qui peuvent être disponibles.

Le premier défi dans le développement de cet essai biologique a été la création d&#39;un site de collecte reproductible à la vascularisation mésentérique. L&#39;uniformité du site d&#39;échantillon est critique, car une partie des fonctions de la faible variation de l&#39;intestin au cours de la progression à travers le jéjunum de l&#39;iléon et du mésentère varient donc dans le même modèle. Les branches de l&#39;iléon de artère mésentérique et la veine sont les plus faciles à identifier grâce à ...

Modifications du débit sanguin à un lit de tissu peuvent avoir un impact important sur la fonction des organes. Une fonction primaire de l&#39;intestin grêle est l&#39;absorption des nutriments. Le débit sanguin artériel à la surface d&#39;absorption de l&#39;intestin est nécessaire pour l&#39;augmentation de l&#39;absorption et la circulation sanguine nutriments pour aider à l&#39;absorption des nutriments comme digesta se déplace le long de la surface 1. Une diminution du flux sanguin peut provoquer une réduction de l&#39;absorption des nutriments en raison d&#39;une diminution du gradient de transépithélial 2. En plus de nutriments, l&#39;intestin grêle peut également être exposé à des métabolites secondaires, des médicaments ou des toxines qui exercent un effet sur le flux sanguin localisé dans le mésentère. Dans le cas de l&#39;animal ruminant, les composés peuvent être libérés à partir d&#39;un aliment (par exemple, les nutriments, tels que des acides aminés, ou des toxines telles que les alcaloïdes de l&#39;ergot) par l&#39;intermédiaire des processus de fermentation de l&#39;intestin antérieur. Si ces composés survivre le métabolisme microbien de la fermentation ruminale, ils sont maintenant disponibles pour l&#39;absorptionou interaction en se déplaçant à travers le tractus gastro-intestinal de l&#39;animal. Il ya un certain nombre de différentes méthodes disponibles pour mesurer le débit sanguin in vivo (par exemple, l&#39;échographie Doppler, qui habite débitmètres sanguins, les microsphères radiomarquées et techniques indicateur-dilution) qui permettent l&#39;évaluation des différents scénarios expérimentaux ou traitements. Cependant, pour obtenir des informations sur les propriétés mécaniques ou pharmacologiques du muscle lisse vasculaire, les méthodes sont restées limitées aux grands navires jusqu&#39;à Mulvany et Halpern 3 a publié un article décrivant une technique utilisant un fil monté préparations d&#39;anneaux vasculaires dans un myographe. Depuis la mise au point de cette technique, des modifications continuent d&#39;être apportées aux systèmes de myographe associés qui permettent une variété d&#39;applications différentes pour l&#39;évaluation des structures tubulaires. Le système a également été adapté pour utiliser des barres fixes pour le montage de plus grands navires 4 où perfusiontechniques ne sont pas souhaitées. En raison de différences dans les vaisseaux d&#39;origines et de distinctions anatomiques différents dans les mêmes bateaux de différentes espèces animales, des données de navire et type d&#39;animal ne peut pas facilement être extrapolés à travers différents navires ou le même navire dans différents types de 5 animaux. Par conséquent, les essais biologiques distincts doivent être élaborés et validés à tout moment ces aspects sont modifiés. Récemment, plusieurs tests biologiques ont été développés avec ces technologies pour une utilisation chez les bovins veine latérale de la saphène et de l&#39;artère et la veine ruminale droite 6,7. Ce dosage biologique a été développé pour étudier spécifiquement les effets que les alcaloïdes de l&#39;ergot de support présentent sur le système vasculaire de l&#39;intestin grêle. Il a été rapporté que 50-60% d&#39;alcaloïdes nourris apparaissent dans le contenu de la caillette, mais seulement 5% sont récupérés dans les fèces 8. Strickland et al. 9 a déclaré dans une revue de alcaloïdes de l&#39;ergot, qui sugg de données disponiblesis que l&#39;intestin grêle peut être le site le plus important pour l&#39;absorption de ergopeptine. Eckert et al. 10 aspects biopharmaceutiques Avis alcaloïdes de l&#39;ergot et a déclaré qu&#39;une fois qu&#39;ils traversent la barrière épithéliale, les alcaloïdes de l&#39;ergot de seigle sont transportés soit par le système lymphatique de la veine sous-clavière ou via la veine mésentérique et dans le sang portail. Rhodes et al. 11 fait état ​​d&#39;une diminution du débit sanguin vers le duodénum et du côlon chez les bouvillons consommant une (haute alcaloïde de l&#39;ergot de seigle) alimentation riche en endophytes infectés. Utilisation de l&#39;artère et la veine essai biologique ruminale droite, Foote et al. 12 ont démontré que les alcaloïdes de l&#39;ergot de seigle sont vaso-actif dans le système vasculaire du rumen. Foote et al. Ensuite 13 ont démontré que l&#39;exposition in vivo du rumen à alcaloïdes de l&#39;ergot se traduit par un flux sanguin diminué épithéliale de rumen. Cette diminution du débit sanguin vers la surface d&#39;absorption du rumen a provoqué une réduction concomitante en nutriments (acides gras volatils) flux. Compte tenu de la quantité de alcaloïdes de l&#39;ergot de passage à l&#39;intestin grêle de l&#39;intestin antérieur; il a été émis l&#39;hypothèse que le même effet sur le système vasculaire intestinal petit et l&#39;absorption des nutriments pourrait se produire. Cela a nécessité le développement de l&#39;artère mésentérique et la veine essai biologique de l&#39;iléon proximal bovine.

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	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:105px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:259px;">Comment/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:105px;">Multi Myograph</td>
			<td style="width:127px;">Danish Myo Technologies</td>
			<td style="width:120px;">610M</td>
			<td style="width:259px;">A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:105px;">Powerlab 8/sp</td>
			<td style="width:127px;">ADIntruments</td>
			<td style="width:120px;">ML785</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:105px;">LabChart 7</td>
			<td style="width:127px;">ADInstruments</td>
			<td style="width:120px;">Version 7</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Force Calibration Kit</td>
			<td style="width:127px;">Danish Myo Technologies</td>
			<td style="width:120px;">100055</td>
			<td style="width:259px;">Specific to DMT myographs</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Bottle-top Filter</td>
			<td style="width:127px;">Nalgene</td>
			<td style="width:120px;">595-4520</td>
			<td style="width:259px;">0.22 um pore size; 45 mm neck size</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">#5 Jewler&#8217;s Forceps</td>
			<td style="width:127px;">Miltex</td>
			<td style="width:120px;">555008FT</td>
			<td style="width:259px;">Any brand of forceps can be used</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Noyes Iris Scissors</td>
			<td style="width:127px;">Miltex</td>
			<td style="width:120px;">18-1510</td>
			<td style="width:259px;">Any brand of scissors can be used</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Dissecting Scope</td>
			<td style="width:127px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">Stemi 2000-C</td>
			<td style="width:259px;">Any brand of dissecting light microscope will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:105px;">Adjustable Tissue Matrice</td>
			<td style="width:127px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:120px;">TM C12</td>
			<td style="width:259px;">This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Krebs-Hensleit Buffer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">K3753-10x1L</td>
			<td style="width:259px;">It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:105px;">Calcium chloride dehydrate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">C7902-500G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S5761-500G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Desipramine-HCl</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D3900-5G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Propranolol-HCl</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P0884-1G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:105px;">KCl</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P9333-500G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:105px;">95% O2/5% CO2</td>
			<td style="width:127px;">Scott Gross</td>
			<td style="width:120px;">UN3156</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine

Les systèmes gastro-intestinaux de mammifères sont constamment exposés aux composés (désirables et indésirables) qui peuvent avoir un effet sur le flux sanguin vers et à partir de ce système. Les changements dans le flux sanguin vers l&#39;intestin grêle peuvent avoir des effets sur les fonctions de l&#39;organe d&#39;absorption. Intérêt particulier pour les toxines libérées de produits alimentaires par des processus de fermentation et la digestion a développé chez les ruminants comme un domaine où des économies productives pourraient être améliorées. La vidéo associée à cet article décrit un essai biologique in vitro mis au point pour sélectionner des composés pour vasoactivité dans des sections isolées de bovins artère mésentérique et la veine à l&#39;aide d&#39;un multimyograph. Une fois que les vaisseaux sanguins sont montés et équilibrés dans le myographe, l&#39;essai biologique elle-même peut être utilisé: un outil de criblage pour évaluer la réponse contractile de la vasomotricité ou de composés d&#39;intérêt; déterminer la présence de types de récepteurs de ciblage sur le plan pharmacologique avec des récepteurs spécifiques agonistes; déterminer le rôle d&#39;un récepteur avec la présence d&#39;un ou plusieurs antagonistes; ou déterminer les interactions potentielles de composés d&#39;intérêt avec des antagonistes. Grâce à tout cela, les données sont collectées en temps réel, le tissu prélevé chez un seul animal peut être exposé à un grand nombre de différents traitements expérimentaux (un avantage in vitro), et représente le système vasculaire de chaque côté du lit capillaire pour fournir une précision image de ce qui pourrait se passer dans la afférents et efférents approvisionnement en sang soutenant l&#39;intestin grêle.

Les vaisseaux sanguins utilisés pour produire les résultats présentés ont été recueillies à partir de 6 bouvillons Holstein (425 ± 8 kg) dans un intervalle de 3 semaines. Un exemple d&#39;une réponse veine contractile mésentérique typique de KCl et des additions de traitement de plus en plus la concentration est présenté sur la figure 2. L&#39;ampleur de la réaction varie quelque avec la taille de la cuve (en corrélation avec la taille de l&#39;animal donneur), mais peut également être ...

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Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

L&#39;intestin grêle est fréquemment exposé à des toxines qui peuvent influer sur la circulation sanguine et un impact négatif sur l&#39;absorption des nutriments. L&#39;utilisation d&#39;un multimyograph et l&#39;artère mésentérique et la veine isolats, composés ou des toxines d&#39;intérêt peut être projeté pour vasoactivité.

L&#39;isolement et l&#39;aide de sections d&#39;encéphalopathie mésentérique artère et la veine comme les essais biologiques pour tester vasoactivité dans l&#39;intestin grêle

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

isolating-using-sections-bovine-mesenteric-artery-vein-as-bioassay-to

Research

JoVE Journal

Medicine

9.6K vues.  USDA-Agricultural Research Service.  L'intestin grêle est fréquemment exposé à des toxines qui peuvent influer sur la circulation sanguine et un impact négatif sur l'absorption des nutriments. L'utilisation d'un multimyograph et l'artère mésentérique et la veine isolats, composés ou des toxines d'intérêt peut être projeté pour vasoactivité. 

Vidéo: Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

Une stratégie pour identifier des mutations de novo dans les troubles courants comme l&#39;autisme et la schizophrénie

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Recherche

Médecine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

Contraction artère mésentérique et des études de relaxation utilisant myographie fil automatisé

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model creating an artificial fistula between the common carotid artery (CCA) and the external jugular vein (EJV) has been widely described and proved technically feasible. This construct provokes a consistent cerebral venous hypertension (CVH), and therefore has helped studying the contribution of venous hypertension to formation, clinical symptoms, and prognosis of brain AVMs and dural AVFs. Equivalent mice models have been only scarcely described and have shown trouble with stenosis of the fistula. An established murine model would allow the study of not only pathophysiology but also potential genetic therapies for these cerebrovascular diseases.
We present a model of arteriovenous fistula that produces a durable intracranial venous hypertension in the mouse. Microsurgical anastomosis of the murine CCA and EJV can be difficult due to diminutive anatomy and frequently result in a non-patent fistula. In this step-by-step protocol we address all the important challenges encountered during this procedure. Avoiding excessive retraction of the vein during the exposure, using 11-0 sutures instead of 10-0, and making a carefully planned end-to-side anastomosis are some of the critical steps. Although this method requires advanced microsurgical skills and a longer learning curve that the equivalent in the rat, it can be consistently developed.
This novel model has been designed to integrate transgenic mouse techniques with a previously well-established experimental system that has proved useful to study brain AVMs and dural AVFs. By opening the possibility of using transgenic mice, a broader spectrum of valid models can be achieved and genetic treatments can also be tested. The experimental construct could also be further adapted to the study of other cerebrovascular diseases related with venous hypertension such as migraine, transient global amnesia, transient monocular blindness, etc.

We describe a method for creating a reliable model of cerebral venous hypertension in the adult mouse. This model has been widely described and tested in the rat. This new counterpart in the mice opens the possibility of using genetic modified animals and thereby broadens the applications of the model.

Adulte souris veineuse Modèle d&#39;hypertension: l&#39;artère carotide commune à externe Veine jugulaire anastomose.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model ...

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Évaluer la réponse Myogenic et vasoactivité dans les artères mésentériques Résistance Utilisation myographie de pression

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Catheterization of the Carotid Artery and Jugular Vein to Perform Hemodynamic Measures, Infusions and Blood Sampling in a Conscious Rat Model

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. Intra-tracheal inoculation of a known amount of bacteria has been successfully used to reproduce the pathogenesis of pneumonia which then develops into sepsis. Monitoring hemodynamic parameters and providing standard clinical treatment including infusion of antibiotics, fluids and drugs to maintain blood pressure is critical to simulate routine supportive care in this model but to do so requires both arterial and venous vascular access. The video details the surgical technique for implanting carotid artery and common jugular vein catheters in an anesthetized rat. Following a 72 hr recovery period, the animals will be re-anesthetized and connected to a tether and swivel setup attached to the rodent housing which connects the implanted catheters to the hemodynamic monitoring system. This setup allows free movement of the rat during the study while continuously monitoring pressures, infusing fluids and drugs (antibiotics, vasopressors) and performing blood sampling.

Vascular accesses to measure hemodynamics, provide fluids and perform blood sampling are important to any small animal model study. We present a technique for implanting catheters into the carotid artery and the common jugular vein in an anesthetized rat for connecting to a system to perform monitoring, infusions and sampling.

Cathétérisme de l&#39;artère carotide et Veine jugulaire faire pour effectuer des mesures hémodynamiques, Infusions et prélèvement sanguin dans un modèle de rat Conscients

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusions de l&#39;artère carotide pour pharmacocinétiques et pharmacodynamiques Analyse des taxanes chez la souris

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe the use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations of superior and uniform quality to that which can be achieved by hand. The device comprises a base that holds 4 stainless steel rods and a top, which acts a cutting guide. The rods are inserted into the lumen of the small intestine [divided into thirds] and the colon. The rods and samples are then placed over a piece of filter paper or card into the holding slots in the base of the device. The top of the device is then positioned and serves as a cutting guide. The two angled sections in the center of the top piece are used to guide a knife or scalpel and cut the intestines longitudinally on the top of the rods. Once the intestinal sections have been cut, the top is removed and the card,&#160;tissue and rods gently removed from the device and placed on the bench. The rods are then gently rolled sideways to flatten and stick the intestinal segments onto the underlying piece of filter paper or card. The final preparation can then be examined or fixed and stored for later analysis. The preparations are invaluable for the study of intestinal changes in normal or genetically modified mouse models. The preparations have been used for the study and quantification of the effects of inflammation (colitis), damage, pre-cancerous lesions (aberrant crypt foci (ACFs) and mucin depleted foci (MDFs)) and polyps or tumors.

The use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

Un dispositif simple d&#39;élaborer rapidement entiers Monts de l&#39;intestin de souris

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, nutrient absorption and distribution, and post-prandial glucose excursions. Understanding the molecular mechanisms that regulate gut hormone secretion is fundamental for understanding and translating gut hormone physiology. Traditionally, the mechanisms underlying gut hormone secretion are either studied in vivo (in experimental animals or humans) or using gut hormone-secreting primary mucosal cell cultures or cell lines. Here, we introduce an isolated perfused rat small intestine as an alternative method for studying gut hormone secretion. The virtues of this model are that it relies on the intact gut, meaning that it recapitulates most of the physiologically important parameters responsible for the secretion in in vivo studies, including mucosal polarization, paracrine relationships and routes of perfusion/stimulus exposure. In addition, and unlike in vivo studies, the isolated perfused rat small intestine allows for almost complete experimental control and direct assessment of secretion. In contrast to in vitro studies, it is possible to study both the magnitude and the dynamics of secretion and to address important questions, such as what stimuli cause secretion of different gut hormones, from which side of the gut (luminal or vascular) is secretion stimulated, and to analyze in detail molecular sensors underlying the secretory response. In addition, the preparation is a powerful model for the study of intestinal absorption and details regarding the dynamics of intestinal absorption including the responsible transporters.

Here, we present a powerful and physiological model to study the molecular mechanisms underlying gut hormone secretion and intestinal absorption &#8212; the isolated perfused rat small intestine.

Mécanismes sous-jacents Gut sécrétion de l’Hormone à l’aide de l’isolé perfusé intestin grêle de Rat

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

Nanoparticules de Polyéthylèneimine recouvertes d’oxyde de fer comme un véhicule pour la livraison de petits ARN interférents à Macrophages In Vitro et In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...