Name: adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory at JoVE.com

L’auteur remercie Susan Whitfield pour la préparation des figures et Camille Martin et Hillary Samagaio pour assistance avec quelques-unes des expériences.

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	<li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere:+a+review.">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).</li><li>Beuchat, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+factors+influencing+survival+and+growth+of+human+pathogens+on+raw+fruit+and+vegetables.">Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables.</a> Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).</li><li>Berger, C. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cellulose+overproduction+on+binding+and+biofilm+formation+on+roots+by+Agrobacterium+tumefaciens.">The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).</li><li>Matthysse, A. G., Kijne, J. W., Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+of+Rhizobiaceae+to+plant+cells.">Attachment of Rhizobiaceae to plant cells.</a> The Rhizobiaceae. , 235-249 (1998).</li><li>Matthysse, A. 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L’auteur déclare qu’elle n’a aucun intérêts financiers concurrents.

Il est important d’être conscient de toutes les surfaces à laquelle les bactéries peuvent adhérer pendant l’expérience. Ainsi les bactéries qui sont capables de se lier au verre peuvent être sous-estimée si le nombre de cellules viables est effectué à l’aide de pipettes et tubes de verre. Si les plantes sont cultivées dans la gélose ou sol et certains de la gélose ou de saleté sur les plantes, puis les bactéries peuvent lier à la matière adhérente, plutôt qu’aux plantes. D’autre part, laver la surface de la plante, en particulier dans le cas des racines, peut enlever les revêtements de surface naturelles tels que muqueux et altèrent ainsi les résultats des tests d’adhérence.
Il est important de s’assurer que les bactéries ajoutées au mélange d’incubation restent en vie pendant l’expérience. Ainsi du nombre de cellules viables de bactéries libres ainsi que joints devrait systématiquement effectué. Certains traitements ou mutations bactériennes peuvent réduire le taux de croissance bactérienne ou effectivement causer la mort d’une fraction de la population bactérienne. Bactéries vivantes et mortes ne soient pas reconnaissables au microscope, à moins que les colorations spéciales sont utilisées. Il y a un kit de tache utile pour vivre/morts bactéries qui dépend de l’exclusion des colorants des bactéries vivantes. Toutefois, si une population mixte d’espèces bactériennes est présente du nombre de cellules viables des espèces d’intérêt est susceptible d’être la méthode la plus simple pour déterminer si l’incubation a entraîné la mort bactérienne.
Composition du milieu influeront sur la croissance et la survie bactérienne. Exsudat racinaire et matériaux libérés de la plaie et couper les sites fourniront substrat pour soutenir la croissance bactérienne modeste. Phosphates, azote et le fer ont tendance à se limiter dans ces conditions. Des cations divalents comme le calcium et le magnésium peuvent influencer l’adhérence. Dans certains cas, source de carbone peut influencer adhérence. pH est également important. En général, le pH de la rhizosphère est entre 5,5 et 6,5.
Il est nécessaire d’être prudent en utilisant marquées avec la résistance aux antibiotique des bactéries. Antibiotiques les plus souvent utilisées sont la rifampicine et à l’acide nalidixique. La résistance à ces antibiotiques est généralement due à des mutations dans des gènes chromosomiques (ARN polymérase et gyrase, respectivement) et donc ne peut facilement être transférée à une autre souche durant l’incubation. Ce type de résistance aussi n’entraîne pas la dégradation ou la modification de l’antibiotique. Marquage des bactéries avec un plasmide gène marqueur n’est pas recommandée à moins que le plasmide peut s’appliquer à toutes les autres bactéries. La résistance aux antibiotique ne doit pas être dû à une modification chimique ou de dégradation de l’antibiotique, comme des bactéries sensibles aux antibiotiques sera alors capables de croître sur plaques d’antibiotiques si elles sont situées à proximité de la bactérie résistante.
Les méthodes décrites dans cet article sont utiles pour la petite taille des échantillons et/ou des expériences où les échantillons doivent être contenus (par exemple, dans les expériences impliquant des agents pathogènes humains). Pour les grands échantillons (au-dessus de 100 g de matériau ou de plus de 50 plants) autres méthodes ou modification drastique de ces méthodes seraient nécessaires10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. la présence d’un grand nombre de micro-organismes autres que les espèces étudiées peut également poser des problèmes importants. Les solutions possibles comprennent l’utilisation de bactéries marquée d’une protéine fluorescente ou la résistance aux antibiotique comme décrit aux étapes 6.1.2 et 7.3. Toutefois, lorsque les bactéries d’intérêt sont rares individus dans une population importante d’autres micro-organismes ces marqueurs ne peut-être pas suffisantes pour permettre une évaluation claire du nombre de bactéries étudiées.
Toutes les méthodes décrites ici sont des méthodes de laboratoire. Des modifications seraient nécessaires pour les études à effet de serre. Des modifications plus importantes sont susceptibles d’être requis pour les études sur le terrain où les protozoaires, insectes et autre animale variation de la prédation et le climat compliquent la fourniture de conditions définies pour les expériences. À l’avenir ces méthodes peuvent être prolongés pour inclure les interactions entre deux ou plusieurs microorganismes sur la surface de la plante.

La mesure de fixation bactérienne de planter des surfaces est devenu importante dans trois situations disparates. La première situation est l’examen de la transmission d’agents pathogènes humains sur plante surfaces1,2,3. Le but ici est d’empêcher les bactéries ou d’enlever ou tuer les bactéries liées et donc de réduire la transmission de la maladie de matériel végétal. La deuxième situation est l’examen de la fixation des agents phytopathogènes pour planter des surfaces4. Une fois de plus, le but ici est d’empêcher la liaison ou pour enlever ou tuer les bactéries liées et donc de réduire la maladie. La troisième situation est l’examen de la fixation des bactéries symbiotiques ou favorisant la croissance des plantes5,6. Le but ici est de promouvoir les bactéries contraignant et donc à l’augmentation de la santé des plantes et des cultures donne.
Les techniques pour mesurer la liaison bactérienne de planter des surfaces décrites dans cet article sont relativement faciles à réaliser et peu coûteux. Les seules exigences sont un microscope et des matériaux trouvés généralement dans un laboratoire de bactériologie. Pour certaines techniques un sonicateur bain est utile. Les techniques décrites sont conçus pour la liaison d’expériences réalisées à l’aide de relativement petite taille des échantillons. Mesures de liaison sont effectuées en laboratoire, bien qu’il peut être possible de modifier certaines de ces techniques pour utilisation en serre ou dans le domaine.
Ces techniques ont été utilisées pour mesurer la fixation bactérienne aux racines, pousses, feuilles coupées, fruits coupés et des tomates cerises intacts dans le laboratoire7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Ils ont également été utilisés pour mesurer la colonisation des racines des plantes qui poussent dans le sol ou le sable dans le laboratoire16. Les techniques ont été utilisées avec de nombreuses espèces bactériennes, y compris les Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica et Pseudomonas fluorescens. Une description utile des méthodes d’évaluation de l’interaction d’a. tumefaciens avec surfaces se trouvent à Morton et Antoine Fuqua (2012)17. Dans tous les cas la taille de l’échantillon impliquée était petite, généralement moins que 25 à 50 plantes. Les techniques décrites sont adaptés pour une utilisation avec des agents pathogènes humains qui doivent rester confinée au cours des expériences.

<table><tbody><tr><td>light microscope</td><td>any</td><td>N/A</td><td>phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.</td></tr><tr><td>seeds</td><td>any&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>make a note of the seed lot number and the cultivar</td></tr><tr><td>bleach</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td>any scientific supply company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>nutrient agar&amp;nbsp;</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>soytone</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>Sand</td><td>sea sand Fisher Scientific</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>sand</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>conetainers</td><td>Stuewe &amp;amp; Sons, Inc.</td><td>Ray-Leach cone-tainers</td><td>many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow</td></tr><tr><td>parafilm</td><td>any scientific supply company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MS salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>parrafin</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>centrigfuge</td><td>any scientific company</td><td>N/A</td><td>to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed</td></tr><tr><td>vortex mixer</td><td>any scientific company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrometer</td><td>ACCU-SCOPE Accessories</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Sedgwick-rafter counting cell</td><td>Hauser Scientific</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>probe-clip press-seal incubatin chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>naladixic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead stain</td><td>In Vitrogen Molecular Bioprobes</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory

Cet article décrit une méthode pour mesurer la liaison bactérienne aux surfaces de plantes axéniques au microscope et grâce à l’utilisation du nombre de cellules viables. Matières végétales utilisées comprennent des racines, des pousses, des feuilles et coupez les fruits. Les méthodes décrites sont peu coûteux, facile et adapté pour la petite taille des échantillons. Liaison est mesuré en laboratoire et une variété de conditions et du milieu d’incubation peut être utilisée. Les effets des inhibiteurs peuvent être déterminées. Des situations qui favorisent et inhibent la liaison peuvent également être évaluées. Dans certains cas, il est possible de distinguer si diverses conditions modifient liaison principalement en raison de leurs effets sur la plante ou sur les bactéries.

A. tumefaciens colonise la surface des racines. Afin de déterminer si la production bactérienne de la cellulose joue un rôle dans la colonisation des racines, les effets de mutations bactériennes qui empêchent la synthèse de la cellulose ont été examiné16. Les techniques décrites aux étapes 1.3 et 7.1 ont été utilisés. Graines de tomate étaient en surface stérilisé et germent dans l’eau stérile. Lorsque les racines étaient environ 2 cm de long, ils étaient trempés dans une suspension de 105 bactéries / mL et plantés dans le sol pasteurisé dans des conteneurs. Les plantes ont été cultivées pendant 14 jours à 25 ° C sur un cycle foncé h de lumière/12 12 h. Après indiqué temps les plantes ont été récoltées dans les conteneurs. Les racines ont été lavés et sonication dans un sonicateur bain pour éliminer les bactéries liés. Nombre de bactéries ont été déterminées à l’aide du nombre de cellules viables. La figure 2 montre l’effet de deux mutations différentes de cellulose-moins sur la capacité des bactéries à coloniser les racines de la tomate. Bien que les écarts de quelques mesures ont été aussi hauts que 0,9 log10 (un problème courant avec ce type de mesure) la réduction obligatoire des mutants cellulose-minus est évidente et nous pouvons conclure que la production bactérienne de cellulose favorise les bactéries la colonisation des racines de la tomate.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> Figure 2 : Racine de colonisation de type sauvage et des mutants de cellulose-moins d’a. tumefaciens. Log10 nombre total de bactéries par cm de longueur racine extraite des racines de tomates inoculés avec la souche de type sauvage a. tumefaciens C58 et mutants de cellulose-moins C58:1 et C58:A60. Les chiffres indiqués sont les moyens d’un minimum de quatre expériences distinctes. Les barres indiquent des écarts-types des moyens. Racines ont été inoculés par leur immersion dans une suspension de 105 bactéries / mL pour un min. Les plantes ont été cultivées dans des récipients et la bactérie faiblement adhérente est enlevée par lavage des racines dans le tampon non contrôlé dans un flacon en verre de lavage. Bactéries étroitement adhérentes ont été supprimés en utilisant un sonicateur de bain et de la suspension qui en résulte plaqué pour déterminer la numération de cellules viables16. De Matthysse et McMahan, ce chiffre a été modifié. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
A examiné le rôle des exopolysaccharides dans la liaison d’e. coli et autres bactéries aux germes de luzerne. Certains foyers de maladie diarrhéique due à e. coli O157 : H7 ont été attribuées aux germes de luzerne contaminés. Liaison des bactéries de type sauvage et des mutants incapables de faire diverses exopolysaccharides a été mesurée en utilisant les méthodes décrites dans les étapes 1.1, 5.1 et 7.2. Germes de luzerne ont été surface stérilisé et mises à germer pendant une journée dans l’eau stérile à 25 ° C dans l’obscurité. Quatre choux avec des téguments ci-joint ont été placés dans des plats en plastique stériles contenant 5 mL d’eau. Bactéries cultivées dans un bouillon Luria ont été ajoutés à une concentration finale d’environ 5 x 103 / mL. Les germes inoculés ont été incubées à 25 ° C dans l’obscurité pendant 3 jours. Les pousses ont été lavés deux fois dans 5 mL d’eau dans un flacon stérile par inversion vigoureuse et homogénéisés dans le tampon à l’aide d’un homogénéisateur de verre téflon moteur de lavage. Des expériences antérieures à l’aide de bactéries marquées avec un plasmide porteur du gène de la GFP ont montré aucune bactérie intériorisée, même si les bactéries de surface ont été observées facilement. Les résultats figurent dans le tableau 1. Deux souches d’e. coli O157 : H7 ont été examinés. Dans les deux souches de la production de poly-β-1, 6-glucuronique acid(PGA) semblait contribuent le plus à la liaison du pathogène e. coli de planter des surfaces. L’acide colique a également joué un rôle significatif dans la liaison. Alors que la réduction obligatoire chez les mutants de cellulose-minus était significative, il n’était pas aussi importante que celle pour les deux autres polysaccharides.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Effets des Mutations dans les gènes de la Production d’exopolysaccharides sur reliure d’e. coli O157 : H7 aux choux et ouvert des téguments</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Souche bactérienne</td>
			<td rowspan="2">Mutation ou génotype (phénotype pertinente)</td>
			<td colspan="2">Numéro10 journal de bactéries lié par sprout ou tégument</td>
		</tr>
<tr>
<td>Luzerneb
</td>
			<td>Téguments ouverts</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>Aucun (type sauvage)</td>
			<td>4,7 ± 0,6</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (cellulose-minus)</td>
			<td>de 2,9 ± 0,7c
</td>
			<td>3,5 ± 0,6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>C 8624</td>
			<td>
wcaD (colique acide-minus)</td>
			<td>1.8 ± 0,7c
</td>
			<td>2,4 ± 0,5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624P</td>
			<td>
ACGP (PGA-minus)</td>
			<td>< 1,0c
</td>
			<td>1,0 ± 1,0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>Aucun (type sauvage)</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
			<td>6.1 ± 0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (cellulose-minus)</td>
			<td>4,8 ± 0,8d
</td>
			<td>4,1 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (colique acide-minus)</td>
			<td>3,9 ± 0,5c
</td>
			<td>4,8 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
ACGP (PGA-minus)</td>
			<td>< 1,0c
</td>
			<td>1,2 ± 0,7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">un moyenne ± écart-type d’un minimum de trois mesures du nombre de bactéries (log10) lié après 3 jours.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Choux de b ont été lavés avant la mesure.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">c significativement différente de la souche sauvage : P < 0,01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">d significativement différente de la souche sauvage : P < 0,05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Cette table a été modifiée de Matthysse, Desclaux, Mishra et Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : effets des mutations dans les gènes de la production d’exopolysaccharides sur fixation de E. coli O157 : H7 pour les choux. Afin de déterminer le rôle des divers exopolysaccharides et lipopolysaccharide dans la liaison du pathogène souches d’e. coli O157 : H7 aux germes de luzerne, la liaison d’une série de mutants pour les choux et les téguments ouverts a été étudiée en utilisant les méthodes décrit à l’étape 6. Les résultats ont montré que poly-ß-1, 6 -N-acétyl-D-glucosamine (PGA) semble être essentiel pour la liaison aux germes et que la cellulose et colanique l’acide sont nécessaires pour la liaison maximale d’e. coli O157. Cette table a été modifiée de Matthysse, Desclaux, Mishra et Torres10.
Afin de déterminer si la production de PGA est suffisante pour provoquer la liaison bactérienne de planter des surfaces, un plasmide (pMM11) portant l’opéron cloné codant les gènes nécessaires à la PGA, la production a été introduite dans deux bactéries différentes qui ne seraient pas normalement être capable de se lier à la tomate racines10. A. tumefaciens A1045 est un mutant de la souche de type sauvage C58 qui omet de faire 1,2 cyclique-β glucanes et aussi ne peut pas lier de planter des surfaces29. Sinorhizobium meliloti 1021 formant des nodules racinaires sur luzerne ne parvient pas à lier les non-légumineuses dont12de la tomate. Les techniques décrites dans les étapes 1.1, 5.1, 6,3 et 7,1 servaient à déterminer si la capacité de faire PGA généralement augmentée fixation bactérienne à la surface des racines. Graines de tomate étaient en surface stérilisé et germent dans l’eau stérile. Racines ont été coupés en segments de 1 cm de longueur et placés dans l’eau stérile et les bactéries ont été inoculés. Comme ces deux espèces de bactéries croissent à des taux différents, contraignant a été mesurée à des moments différents pour permettre à peu près égales de la croissance bactérienne. La présence de le pMM11 de plasmide entraîne une augmentation significative similaire dans le nombre de bactéries dépendant de ces deux espèces (tableau 2)10. Une augmentation significative de la liaison a été également vu au microscope, mais la liaison était très différente chez les deux espèces (Figure 3). A. tumefaciens A1045 lié comme des bactéries à la surface de la racine. S. meliloti lié en larges bouquets où seulement quelques uns des bactéries ont été liés directement à la racine et la majorité des bactéries était attachée à d’autres bactéries. Cet exemple montre que l’analyse simplement le nombre de bactéries liés sans inclure l’observation au microscope peut donner une impression trompeuse des résultats d’une expérience. Bien que les deux méthodes (nombre de cellules viables et observation au microscope) montrent que pMM11 a augmenté fixation bactérienne aux racines de la tomate, le type de liaison causée par la production de PGA était différent pour les deux espèces bactériennes10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">L’effet de la pMM11 de plasmide sur la liaison des bactéries aux racines de la tomate</td>
		</tr>
<tr>
<td>Souche bactérienne</td>
			<td>Plasmide</td>
			<td>Nombre de bactéries lié par la longueur des racines mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. tumefaciens A1045un
</td>
			<td>aucun</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (synthèse de la PGA)</td>
			<td>10 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. meliloti 1021b
</td>
			<td>aucun</td>
			<td>aucun détecté</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>aucun détecté</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (synthèse de la PGA)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">une liaison bactérienne a été mesurée après 2 heures</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b fixation bactérienne était mesure après 18 heures</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Cette table a été modifiée de Matthysse, Desclaux, Mishra et Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : l’effet d’un plasmide porteur de gènes pour la synthèse de PGA sur la liaison de A. tumefaciens A1045 et S. meliloti 1021 à sections de racines de tomates. Afin d’examiner la possibilité de poly-ß-1, 6 -N-acétyl-D-glucosamine (PGA) pour favoriser la fixation de bactéries pour planter des racines, l’effet d’un plasmide qui confère la capacité de faire PGA (pMM11) sur la liaison de deux souches de bactéries associées aux plantes à racines de tomates a été examinée. Aucune souche de la bactérie ont montré une liaison significative aux racines de la tomate en l’absence du plasmide ou en présence de plasmide sans les gènes codant la synthèse PGA (pBBR1mcs). L’ajout du plasmide porteur de gènes de synthèse de PGA a augmenté la fixation par les deux types de bactéries. Parce qu’a. tumefaciens se développe plus vite que la liaison de S. meliloti a été mesurée après 2 h d’incubation pour a. tumefaciens et après 18 h pour S. meliloti. Les techniques utilisées sont celles qui sont indiquées à l’étape 7. Cette table a été modifiée de Matthysse, Desclaux, Mishra et Torres10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> Figure 3 : L’effet de la pMM11 du plasmide portant les gènes de biosynthèse de PGA sur la liaison d’a. tumefaciens A1045 et S. meliloti 1021 aux poils absorbants tomate. Liaison aux poils absorbants tomate de A) a. tumefaciens A1045, B) a. tumefaciens A1045 pMM11, C) S. meliloti 1021 et D) S. meliloti 1021 pMM11. Bien que l’augmentation dans la liaison des deux espèces bactériennes est à peu près similaire, les détails de la liaison comme vu au microscope sont très différentes. Les techniques utilisées sont celles qui sont indiquées à l’étape 6. Ce chiffre a été modifié par Matthysse, Desclaux, Mishra et Torres10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Il est parfois possible d’utiliser la liaison à surfaces non biologiques pour aider à distinguer l’apport de bactéries et de la plante dans une interaction spécifique. Le polysaccharide(UPP) unipolaire d’a. tumefaciens a démontré pouvoir de médiation bactérienne contraignant à une variété de ces deux surfaces biologiques et non biologiques30. Calcium a été observée à inhiber la liaison de a. tumefaciens de planter des surfaces médiées par l' UPP28. Afin de déterminer si l’inhibition par les ions calcium de fixation bactérienne de planter des surfaces est due à un effet sur les bactéries ou sur la surface de la plante, la fixation des bactéries sur les filets en nylon a été examinée. Les techniques décrit à l’étape 8.2 ont été utilisés. Graines de tomate étaient en surface stérilisé et germent dans l’eau tel que décrit à l’étape 1. Les bactéries ont été cultivés sur un milieu minimal avec saccharose et ajoutés aux racines de tomates ou de fils de nylon à une concentration finale d’environ 105/ml comme indiqué au point 5.1. A examiné l’effet de l’ACIC ajouté2 sur fixation bactérienne aux racines de tomates et de fils de nylon au microscope. La figure 4 montre une inhibition similaire de liaison par le calcium à l’aide soit surface ce qui suggère que l’effet du calcium est principalement sur les bactéries10.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> Figure 4 : L’effet du calcium sur la liaison d’a. tumefaciens à poils absorbants tomate et fils nylon. A. tumefaciens est incubé avec les racines de la tomate (A et B) ou de fils de nylon (C et D) pendant 24 h dans une 01:10 dilution des sels de MS et une 01:20 dilution du milieu minimal AB, 0,4 % de sucrose (A et C) ou dans un 01:10 dilution des sels MS et 01:20 dilution du milieu minimal AB , 0,4 % de sucrose contenant 60 mM CaCl2 (B et D)31. L’ajout CaCl2 inhibent la liaison bactérienne à la fois des racines et des filets en nylon, ce qui suggère que l’inhibition est principalement due à un effet sur les bactéries plutôt que sur la surface de la plante. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

Une méthode simple permettant de mesurer et de caractériser l’adhérence bactérienne aux plantes, en particulier les racines et les pousses, est décrit dans cet article.

Adhérence des bactéries à planter des Surfaces mesurées en laboratoire

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

Research

JoVE Journal

Environment

12.6K vues.  University of North Carolina at Chapel Hill. Une méthode simple permettant de mesurer et de caractériser l’adhérence bactérienne aux plantes, en particulier les racines et les pousses, est décrit dans cet article.

Vidéo: Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Test in vitro de l&#39;adhésion bactérienne sur des mammifères cellules épithéliales

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Recherche

Immunologie et infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Ingénierie bactéries adhérentes en créant un simple synthétique Curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Bio-ingénierie

Détection de la colonisation par des rhizobactéries chez Arabidopsis thaliana

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

Pleins feux sur l’auteur : Améliorer la colonisation des rhizobactéries sur les racines des plantes pour améliorer l’efficacité des engrais microbiens

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.

Mesure de la colonisation bactérienne sur les racines d’Arabidopsis thaliana dans des conditions hydroponiques

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Environnement

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Matériaux biomimétiques à caractériser les interactions bactéries-hôtes

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, rhizosphere colonization by plant growth-promoting bacteria (PGPB) can increase the health or the development of host plants relative to uncolonized plants. However, in field settings, bacterial treatments with PGPB often do not provide substantial benefits to crops. One explanation is that this may be due to loss of the PGPB during interactions with endogenous soil microbes over the lifespan of the plant. This possibility has been difficult to confirm, since most studies focus on the initial colonization rather than maintenance of PGPB within rhizosphere communities. It is hypothesized here that the assembly, coexistence, and maintenance of bacterial communities are shaped by deterministic features of the rhizosphere microenvironment, and that these interactions may impact PGPB survival in native settings. To study these behaviors, a hydroponic plant-growth assay is optimized using Arabidopsis thaliana to quantify and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after transfer to different growth environments. This system&#8217;s reproducibility and utility are then validated with the well-studied PGPB Pseudomonas simiae. To investigate how the presence of multiple bacterial species may affect colonization and maintenance dynamics on the plant root, a model community from three bacterial strains (an Arthrobacter, Curtobacterium, and Microbacterium species) originally isolated from the A. thaliana rhizosphere is constructed. It is shown that the presence of these diverse bacterial species can be measured using this hydroponic plant-maintanence assay, which provides an alternative to sequencing-based bacterial community studies. Future studies using this system may improve the understanding of bacterial behavior in multispecies plant microbiomes over time and in changing environmental conditions.

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Here we describe a hydroponic plant growth assay to quantify species presence and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after their transfer into different growth environments.

Surveillance de la colonisation bactérienne et de l'entretien des racines d'Arabidopsis thaliana dans un système hydroponique flottant

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Use of Fimbrial Rod for F18ab Fimbriae+ STEC Colonization to Host Cells

Type 1 fimbriae are important virulence determinants of some Gram-negative pathogens, which promote bacterial colonization. The fimbrial rod is primarily composed of multiple copies of the major fimbrial subunit FimA. FimH adhesin, however, is present as a fibrillar tip structure that drive bacteria binding to host cellular mannose containing receptor. Here, we provide protocols to evaluate and compare the function of type 1 fimbrial subunits in F18ab fimbriae+ Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC). We found that both FimA and FimH are required for bacterial adhesion, invasion, and biofilm formation. Deleting fimA gene showed much more reduction in bacterial adhesion and invasion to porcine intestinal columnar epithelial cells IPEC-J2, than that of fimH mutant. Biofilm formation was significantly reduced in both mutants with an equal level. In addition, qPCR demonstrated that either fimA or fimH deletion down-regulated the bacterial flagella and F18 fimbriae genes expression, while up-regulated adhesin was involved in diffuse adherence-I (AIDA-I) gene expression, suggesting the co-regulation of cell surface-localized adhesins in F18ab fimbriae+ STEC.

Use of Fimbrial Rod for F18ab Fimbriae+ STEC Colonization to Host Cells

Here we present a protocol to study the function of fimbriae in bacterial colonization.

Type 1 fimbriae are important virulence determinants of some Gram-negative pathogens, which promote bacterial colonization. The fimbrial rod is primarily ...

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

C. parapsilosis (Cp) is an emerging cause of bloodstream infections in certain populations. The&#160;Candida clade, including Cp, is increasingly developing resistance to the first and the second line of antifungals. Cp is frequently isolated from hands and skin surfaces, as well as the GI tract. Colonization by Candida predisposes individuals to invasive bloodstream infections. To successfully colonize or invade the host, yeast must be able to rapidly adhere to the body surfaces to prevent elimination by host defense mechanisms. Here we describe a method to measure adhesion of Cp to immobilized proteins under physiologic fluid shear, using an end-point adhesion assay in a commercially available multichannel microfluidic device. This method is optimized to improve reproducibility, minimize subjectivity, and allow for the fluorescent quantification of individual isolates. We also demonstrate that some clinical isolates of Cp show increased adhesion when grown in conditions mimicking a mammalian host, whereas a frequently used lab strain, CDC317, is non-adhesive under fluid shear.

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

Adhesion is an important first step in colonization and pathogenesis for Candida. Here, an in vitro assay is described to measure adhesion of C. parapsilosis isolates to immobilized proteins under fluid shear. A multichannel microfluidics device is used to compare multiple samples in parallel, followed by quantification using fluorescence imaging.

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