This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre th&#233;matique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.

NOTE: Les expériences ont été effectuées en conformité avec le Guide canadien pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité de protection des animaux Laval Université. Préparation de l&#39;échantillon 1. NOTE: Dans cet exemple, nous avons utilisé des cerveaux de souris au jour postnatal 1. <ol><li> Utilisez l&#39;hypothermie anesthésie glace pilée pendant 3 à 4 min pour les chiots, puis disséquer le cerveau le plus rapidement possible dans un milieu de L15 glacée. Effectuez cette étape à moins de 2 min. </li><li> Transfert disséqué les cerveaux en intégrant moule (cf. La liste du matériel) et remplir avec les médias tissu congelé enrobage en prenant soin d&#39;orienter l&#39;échantillon dans la position souhaitée. Congeler les échantillons immédiatement dans de l&#39;azote liquide et conserver à -80 ° C. Effectuez cette étape dans les 30 secondes. NOTE: Les échantillons peuvent être conservés quelques mois sans compromettre la qualité de l&#39;ARN. </li></ol> 2. sectionnement <ol><li> Traiter coa à membranelames de verre TED (cf. la liste de matériel) avec une solution RNAse de surface de décontamination afin d&#39;éliminer toute trace de RNAses. Laver les lames dans de l&#39;eau DEPC et les laisser sécher. Alternativement, diapositives cuire pendant une nuit à 200 ° C. </li><li> Transférer les échantillons congelés dans un cryostat préalablement nettoyée avec une solution surface RNAse de décontamination. Réglez la température de la chambre cryostat à -20 ° C et tranche spécimens à 10 um d&#39;épaisseur. Recueillir des coupes de tissus sur les lames de membrane enduite et les laisser sécher 10 min avant la coloration. Alternativement, magasin glisse à -80 ° C jusqu&#39;à coloration. </li></ol> 3. Préparation des solutions de coloration <ol><li> Préparer toutes les solutions juste avant le début de l&#39;expérience, et en utilisant un inhibiteur de RNAse dans toutes les solutions de coloration (à l&#39;exception des solutions de lavage) afin d&#39;empêcher la dégradation de l&#39;ARN. </li><li> Préparation de la solution tampon. Utiliser le même dans toutes les solutions tampon (composée de RNAse-free solution saline tamponnée au phosphate (PBS) additionné de 1% de BSA,0,2% de Triton et l&#39;inhibiteur de RNAse 2%). Pour chaque lame, préparer 400 ul de solution tampon (200 pi pour la première et 200 ul d&#39;anticorps secondaires). </li><li> Préparer la solution de fixation: utiliser 70% d&#39;éthanol maintenue à -20 ° C. Gardez tissus procédure de fixation minimale pour éviter une réduction drastique du rendement d&#39;extraction de l&#39;ARN. NOTE: Vous pouvez également utiliser une solution d&#39;éthanol à 95% complété d&#39;acide acétique de 5% maintenue à -20 ° C. </li><li> Préparer la solution d&#39;anticorps primaire par dilution de l&#39;anticorps primaire dans la solution tampon. Pour l&#39;étiquetage des neurones dopaminergiques, utiliser un anticorps ciblant la protéine tyrosine hydroxylase (TH, enzyme limitant pour la production de dopamine taux). Utiliser une forte concentration d&#39;anticorps pour compenser le temps d&#39;incubation rapide. Utilisation anticorps TH à une dilution de 1:25. NOTE: Dans le protocole d&#39;immunofluorescence normale, cet anticorps donne un signal fort quand incubé pendant une nuit à une dilution de 1: 1000. Dans ce protocole, il est utilisé 40X plus concentrated en raison du temps d&#39;incubation est courte. En raison de la forte concentration d&#39;anticorps utilisé pour cette méthode, effectuer une immunocoloration norme en parallèle afin de vérifier toute augmentation de marquage non spécifique. </li><li> Préparer la solution d&#39;anticorps secondaire en diluant l&#39;anticorps secondaire dans la solution tampon. Utilisation d&#39;un anticorps secondaire biotinylé à une concentration de 1: 100. NOTE: Dans cet exemple, nous avons utilisé un anticorps biotinylé anti-lapin. </li><li> Préparation du complexe (ABC) solution avidine-biotine pour la détection d&#39;anticorps secondaires biotinylés. Faire ABC solution en ajoutant le composé A et le composé B à une concentration de 1: 100 dilué dans du PBS supplémenté avec du DEPC inhibiteur de RNAse à 2%. Préparation du complexe avidine-biotine 30 min avant de l&#39;ajouter aux diapositives. </li></ol> 4. coloration <ol><li> Décongeler une ou deux diapositives à l&#39;époque de -80 ° C en les feuilletant rapidement dans l&#39;air (ou utilisez un ventilateur). Sections surround, avec un hydrophobestylo barrière et laisser sécher pendant quelques secondes. <ol><li> Mettre les lames dans la solution de fixateur froid pour pas plus de 5 minutes à -20 ° C. Agiter une fois dans l&#39;air pour éliminer l&#39;excès de solution de fixation, puis, rapidement plonger diapositives en temps DEPC PBS 6-8 pour le lavage. </li><li> Feuilletez les diapositives pour enlever l&#39;excès de DEPC PBS. Veiller à ce que les diapositives étape de dégivrage ne dépasse pas 5 min. </li></ol></li><li> Placer les lames sur un plateau propre (prétraité avec une solution de décontamination RNAse surface pour éliminer toute trace de RNAses) et mis 200 ul de la solution d&#39;anticorps primaire sur chaque lame (lapin anti-TH) pendant 10 min à température ambiante. Tremper les lames rapidement DEPC PBS trois fois pour le lavage et feuilleter les diapositives une fois pour éliminer l&#39;excès de DEPC PBS. </li><li> Mettre 200 ul de la solution d&#39;anticorps secondaire sur chaque lame pendant 6 min à température ambiante. Tremper les lames rapidement trois fois dans DEPC PBS pour le lavage et feuilleter les diapositives à éliminer l&#39;excès de DEPC PBS. </li><li> Mettez 200 pi de la solu ABCtion sur chaque lame pendant 4 min à température ambiante. Tremper les lames rapidement DEPC PBS trois fois pour le lavage et feuilleter les diapositives pour enlever l&#39;excès DEPC PBS. </li><li> Préparer le DAB (3,3 &#39;diaminobenzidine) la solution pendant 4 min d&#39;incubation dans la solution ABC. Utilisez les réactifs fournis dans le kit (kit DAB substrat de peroxydase). Mélanger une goutte de tampon fourni, une goutte de solution DAB et une baisse de 30% de H 2 O 2 dans 2,5 ml d&#39;eau DEPC. Mélanger la solution en inversant. </li><li> Prendre 196 ul de la solution de DAB et ajoute 4 ul (2%) de solution d&#39;inhibiteur d&#39;ARNase avant étalement sur des lames. Placer les lames sur un plateau propre (prétraité avec une solution de décontamination de RNAse de surface) et mis les 200 pi de solution DAB sur des lames. NOTE: solution DAB doit réagir within1 ou 2 min. </li><li> Tremper les lames rapidement DEPC PBS trois fois pour le lavage et mis diapositives pendant quelques secondes dans de l&#39;éthanol absolu. Sécher les diapositives en les feuilletant dans l&#39;air (ou utilisez un ventilateur). &lt;br /&gt; NOTE: Les diapositives peuvent être conservés à -80 ° C pour une utilisation ultérieure ou traitées à LCM. </li></ol> 5. Microdissection laser <ol><li> Décongelez diapositives rapidement en les feuilletant dans l&#39;air (ou utilisez un ventilateur). Veiller à ce que les diapositives étape de dégivrage ne dépasse pas 5 min. </li><li> Passez à LCM. Placer la lame sous le microscope avec le côté faisant face à l&#39;échantillon le bouchon du tube de collecte. Choisissez le meilleur grossissement pour l&#39;échantillon. Réglez la mise pour voir les cellules d&#39;intérêt. <ol><li> Définir la zone de coupe et de commencer à couper avec le laser. Recueillir les cellules disséquées ou un morceau de tissu dans le bouchon du tube de collecte rempli avec 50 ul de tampon de lyse (du kit d&#39;extraction d&#39;ARN). Se assurer que l&#39;étape de LCM ne dépasse pas 30 min. </li></ol></li><li> Extraire l&#39;ARN total à partir de cellules isolées en utilisant un kit d&#39;extraction d&#39;ARN (cf. La liste des matériaux). Suivre le protocole du fabricant. <ol><li> Incuber les cellules recueillies pendant 30 min à 42 ° C etlyser les cellules. Condition préalable de la colonne de purification de l&#39;ARN par addition de 250 ul de tampon de conditionnement. Charge 50 pi d&#39;éthanol à cellules lysées. Charger les 100 pi de cellules lysées sur une colonne de purification préconditionné. </li><li> Centrifuger la colonne à 16 000 xg pendant 2 minutes à température ambiante. Laver la colonne deux fois avec des tampons de lavage. Eluer dans le volume minimale recommandée (11 pi) d&#39;eau RNAse free (non dépces traités comme il peut interférer avec l&#39;Bioanalyser). Gardez 2 pi à la qualité de test. NOTE: Toutes les solutions et les réactifs sont fournis dans le kit. </li></ol></li></ol> 6. Synthèse d&#39;ADNc et RT-PCR quantitative <ol><li> Transcrire en inverse des échantillons d&#39;ARN provenant de cellules dopaminergiques laser capturé dans l&#39;ADN complémentaire en utilisant une transcriptase inverse et d&#39;oligo (dT). Suivez le protocole du fabricant (cf. Liste du matériel). </li><li> Utilisez une ul d&#39;ADNc pour l&#39;amplification qRT-PCR avec des amorces spécifiques de gènes. Mettre en place rea PCRctions de volume de 20 pi avec un chaud mélange réactionnel de départ à un composant pour la PCR quantitative que recommandé par le fabricant. Effectuer chaque réaction en trois exemplaires. <ol><li> Pour les expériences décrites ici, utiliser les paires d&#39;amorces suivantes: Gapdh-F (5&#39;-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 &#39;) / Gapdh-R (5&#39;-GGA TGC GAT GAT AGG GTT CT-3&#39;); Rpl13a-F (5&#39;-ACA ACT GCC CTG GAG GAG AA-3 &#39;) / Rpl13a-R (5&#39;-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3&#39;); Th-F (5&#39;-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 &#39;) / Th-R (5&#39;-AAT GAA CAC GGG CAG ACA G-3&#39;); AADC-F (5&#39;-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 &#39;) / AADC-R (5&#39;-GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3&#39;). </li></ol></li><li> Effectuer l&#39;amplification RT-PCR quantitative en utilisant les paramètres de cycles rapides suivantes: 95 ° C pendant 5 min, puis de 45 cycles de 10 sec 95 ° C, 10 sec à 60 ° C et 10 sec à 72 ° C. Effectuer fusion analyse de la courbe en utilisant le réglage par défaut de l&#39;instrument à déterNE formation homogène du produit. </li><li> Analyser les données en utilisant le logiciel intégré. <ol><li> Normaliser les valeurs d&#39;expression des gènes marqueurs DA Th AADC et à l&#39;expression des deux gènes de référence GAPDH et Rpl13a pour obtenir des niveaux d&#39;expression relatifs de la manière décrite précédemment 14. </li></ol></li></ol>

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T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+the+genomic+and+proteomic+era:+targeting+the+genetic+basis+of+cancer.">Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer.</a> International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).</li></ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Le point le plus critique de cette méthode consiste à étiqueter les cellules d&#39;intérêt, tout en empêchant la dégradation des ARN. Comme RNAses sont actives dans des solutions aqueuses, ce qui diminue les temps d&#39;incubation permet d&#39;améliorer la conservation de l&#39;ARN 11,15. Toutes les solutions utilisées doivent être traités avec DEPC pour inactiver RNAses. Tous les matériaux et les surfaces doivent être traités avec une solution de décontamination de surface d&#39;ARNase pour em...

Le cerveau est composé d&#39;une grande variété de différents types de neurones formant des réseaux complexes. Ces neurones sont organisés en groupes et sous-groupes distincts en fonction de leur morphologie, la connectivité et l&#39;expression du gène modèle 1. Le développement de puces à ADN, séquençage de nouvelle génération, et qRT-PCR offrir la possibilité de comparer les profils d&#39;expression génique de populations neuronales dans différents contextes biologiques 1,2. Ces analyses sensibles nécessitent l&#39;identification précise et l&#39;isolement de types de cellules d&#39;intérêt tout en maintenant l&#39;intégrité de l&#39;ARN 2-4. Tri cellulaire (FACS) fluorescent activé technique a été largement utilisée pour isoler des types de cellules spécifiques sur la base de marqueurs et / ou morphologie de surface cellulaire. FACS nécessite une étape de dissociation de cellules avant le tri, qui se traduit par une perte complète de 5 résolution spatiale. De nombreux sous-populations neuronales se distinguent les unes des autres en fonction de leur distribution anatomique dans the cerveau. microdissection laser appliqué sur des coupes de cerveau minces fournit une option appropriée pour l&#39;isolement spécifique de cellules à haute résolution spatiale 6-8. Une limite importante de LCM a été la nécessité d&#39;identifier les cellules d&#39;intérêt en fonction de critères morphologiques ou journalistes de protéines fluorescentes génétiquement modifiées dans des modèles animaux. Le développement de nouvelles techniques pour réaliser les méthodes d&#39;immunomarquage rapides qui conservaient l&#39;intégrité de l&#39;ARN, en combinaison avec LCM, permet maintenant l&#39;isolement des sous-populations de cellules pour procéder à des expériences de profilage de gène. Cette approche a déjà été effectuée et a brièvement décrit dans quelques publications 1,9-13. Ici, nous démontrons une procédure détaillée pour obtenir l&#39;ARN de haute qualité à partir d&#39;un sous-ensemble spécifique de cellules dans une structure de tissus complexes en combinant immunomarquage rapide avec LCM. Nous montrons comment effectuer les étapes clés essentielles pour obtenir la récupération de l&#39;ARN maximale et d&#39;éviter la dégradation de l&#39;ARN comme il peut sigsignificative gène d&#39;impact profilage d&#39;expression. Pour la démonstration de ce protocole, les neurones dopaminergiques du mésencéphale de la souris d&#39;un jour vieux ont été ciblés. Les neurones dopaminergiques peuvent être immunomarquées utilisant un anticorps dirigé contre la tyrosine hydroxylase (TH), l&#39;enzyme limitant la vitesse pour la synthèse de la dopamine. Suite à une immunocoloration TH, des groupes de neurones dopaminergiques individuel ou peut ensuite être isolé en utilisant LCM. Microdisséquées cellules sont recueillies dans le tampon de lyse, et l&#39;ARN est extrait en utilisant un kit d&#39;isolement d&#39;ARN. Qualité et quantité de l&#39;ARN extrait sont mesurées en utilisant un bioanalyseur 5. Une analyse plus poussée de l&#39;expression génique en utilisant le séquençage d&#39;ARN, puce à ADN, ou qRT-PCR peut ensuite être effectuée 2,4,6. A titre d&#39;exemple, en deux étapes une qRT-PCR est mise en évidence sur les domaines capturé laser dopaminergiques isolé. Quantification relative des niveaux de gènes marqueurs de deux neurones dopaminergiques d&#39;expression illustre la sélectivité de ce protocole.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="895">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:420px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Membrane coated slides&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">11505158</td>
			<td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &#181;m; 50 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Surface RNAse decontamination solution</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">AM9780</td>
			<td>RNaseZap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Fixative</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>70% Ethanol kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-TH&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Pel-Freez</td>
			<td style="width:99px;">P40101</td>
			<td>&#160;1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse free buffer</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse inhibitor</td>
			<td style="width:148px;">Promega</td>
			<td style="width:99px;">N2615</td>
			<td>Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-rabbit biotinylated</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Vectastain Elite ABC kit Standard</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">PK-6100</td>
			<td>8&#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DAB Peroxidase Substrate Kit&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNA isolation kit</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">H2O2 30%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laser microdissection system</td>
			<td style="width:148px;">Leica microsystems</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Model AS-LMD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DEPC</td>
			<td style="width:148px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:99px;">B22753-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Embedding mold&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">14702218311</td>
			<td>6x8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Frozen tissue embedding media</td>
			<td style="width:148px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:99px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer chip</td>
			<td style="width:148px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:99px;">5067-1513</td>
			<td>RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Hot start reaction mix for quantitative PCR</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td style="width:99px;">6402712001</td>
			<td>Fast Start Essential DNA Green Master</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reverse transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">11752-050</td>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling

microdissection laser (LCM) permet l&#39;isolement de cellules spécifiques de coupes de tissus minces à haute résolution spatiale. LCM efficace nécessite une identification précise des sous-populations de cellules d&#39;un tissu hétérogène. Identification des cellules d&#39;intérêt pour LCM est généralement basée sur des critères morphologiques ou journalistes de protéines fluorescentes. La combinaison de LCM et immunomarquage rapide offre un moyen alternatives et efficaces pour visualiser des types cellulaires spécifiques et de les isoler du tissu environnant. L&#39;ARN de haute qualité peut alors être extraite d&#39;une population cellulaire pur et un traitement supplémentaire pour des applications en aval, y compris l&#39;ARN-séquençage, ou puce à ADN qRT-PCR. Cette approche a déjà été effectuée et a brièvement décrit dans quelques publications. Le but de cet article est d&#39;illustrer comment effectuer immunomarquage rapide d&#39;une population de cellules tout en conservant l&#39;intégrité de l&#39;ARN, et comment isoler ces cellules spécifiques en utilisant LCM. Ici, nous illustronsd de cette procédure à étapes multiples et la capture par immunomarquage des cellules dopaminergiques dans le tissu cérébral de souris une jours d&#39;âge. Nous soulignons étapes critiques clés qui méritent une attention particulière. Ce protocole peut être adapté à une variété de tissus et de cellules d&#39;intérêt. Des chercheurs de différents domaines seront probablement bénéficier de la démonstration de cette approche.

Cette procédure d&#39;immunomarquage permet de visualiser rapidement les cellules d&#39;intérêt tout en gardant l&#39;intégrité de l&#39;ARN. La figure 1 illustre les étapes de la préparation du tissu avant l&#39;extraction de l&#39;ARN. Après cryosectioning, les neurones dopaminergiques sont marquées en utilisant un anticorps dirigé contre la tyrosine hydroxylase (neurones marqués apparaissent en brun). Selon de la question expérimentale, des cellules individuelles ou plus région d&#39;int...

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RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Gene analyse de l&#39;expression d&#39;un sous-ensemble de cellules dans un tissu spécifique représente un défi majeur. Cet article décrit comment isoler l&#39;ARN total de haute qualité à partir d&#39;une population de cellules spécifiques en combinant une méthode de immunomarquage rapide avec microdissection laser.

Isolement de l&#39;ARN à partir de sous-populations cellulaires spécifiques en utilisant le laser capture microdissection Combiné avec Rapid immunomarquage

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

rna-isolation-from-cell-specific-subpopulations-using-laser-capture

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K vues.  Université Laval.  Gene analyse de l'expression d'un sous-ensemble de cellules dans un tissu spécifique représente un défi majeur. Cet article décrit comment isoler l'ARN total de haute qualité à partir d'une population de cellules spécifiques en combinant une méthode de immunomarquage rapide avec microdissection laser. 

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Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Microdissection laser des tissus de mammifères

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Recherche

Biologie

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

Extraction d&#39;ARN à partir de cellules Neuroprecursor Utiliser le Bio-Rad ARN total Kit

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

Transcription in vitro et plafonnement de l&#39;ARNm de luciférase Gaussia Suivie par la transfection de cellules HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

L&#39;utilitaire de la phase spécifique-mi-à la fin<em&gt; Drosophila</em&gt; Folliculo Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Isolement de l&#39;ARN de souris Pancréas: un tissu de Ribonuclease riche

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Isolement des régions génomiques spécifiques et l&#39;identification des molécules associées par enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Saisie Microdissection de trabéculum très Pure de souris yeux de laser pour l’analyse de l’Expression génique

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq : Type-spécifiques des cellules épigénome profilage

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

Protocole d’isolement de gouttelettes lipidiques rapide à l’aide d’un Kit d’Isolation des organites bien établie

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Un protocole de microdissection de capture de laser qui donne l'ARN de haute qualité des os frais-congelés de souris

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...