We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.

1. Génération et validation des chimères de protéine fluorescente <ol><li> Ajouter protéine fluorescente verte (GFP) à l&#39;extrémité amino ou carboxy-terminales de la protéine d&#39;intérêt en utilisant des stratégies d&#39;ADN recombinant 13. REMARQUE: Bien que nous ayons utilisé GFP largement, d&#39;autres variantes telles que la protéine fluorescente cyan (CFP), la protéine fluorescente jaune (YFP), DsRed et mCherry peuvent être utilisés. L&#39;amélioration de l&#39;efficacité fluorophore pliage, la luminosité et photostabilité sont constamment faits, et les enquêteurs devraient se prévaloir des dernières constructions de génération. <ol><li> Confirmer la séquence d&#39;ADN correcte et se assurer que le fragment GFP est dans le cadre avec la protéine d&#39;intérêt. Effectuer séquençage utilisant des stratégies d&#39;ADN recombinant 21. NOTE: De nombreuses institutions ont des installations d&#39;ADN base, qui l&#39;enquêteur est encouragé à contacter pour des informations supplémentaires. </li><li> Pour les protéines membranaires de passe simples ou doubles, générerles deux versions du terminal amino et carboxyle des protéines de fusion 19. </li><li> Pour les protéines transmembranaires multiples insérer à l&#39;intérieur des boucles de la GFP extramembrane putatifs, ainsi que les extrémités. Prendre des précautions particulières lors de la génération des chimères transmembranaires avec la protéine de fusion fluorescente fixée à l&#39;extrémité amino de la protéine cible comme des séquences de signaux sont souvent clivés par protéolyse de la protéine une fois que se est écoulé à travers la translocation du RE. </li><li> Dans le cas de séquences de signaux existants, introduire la protéine de fusion fluorescente distale par rapport au site de clivage de façon à générer une protéine mature contenant une protéine fluorescente marqué amino-terminal intact. Employer des stratégies classiques d&#39;ADN recombinant pour la production de chimères 21. </li></ol></li><li> Déterminer la présence d&#39;un signal fluorescent localisé de manière appropriée suffisante dans la lignée cellulaire d&#39;intérêt. <ol><li> Respecter les cellules sous microscopie à épifluorescence en utilisant la fluorescence intrinsèque de la GFP sous appromangé conditions de filtre défini. Pour les ensembles de filtres GFP englobant 510-560 nm, confirment que les filtres appropriés sont utilisés pour le fluorophore utilisé. NOTE: Un signal suffisante est atteinte lorsque l&#39;évaluation à l&#39;oeil fournit un signal assez fort pour que la structure cellulaire dans laquelle le signal est facilement résolu réside dessus du fond. En outre, le motif de coloration de la protéine GFP doit être compatible avec celle des marqueurs pour l&#39;organite approprié, et de préférence identique à celle de la protéine native non marqué. </li></ol></li><li> Déterminer si une approche de transfection stable ou transitoire sera utilisé basé sur la protéine en cours d&#39;évaluation. NOTE: transfectants stables permettent généralement à des niveaux inférieurs d&#39;expression que les systèmes transitoires. Bien que l&#39;expression transitoire donne une expression de haut niveau de protéines et d&#39;intensité augmentation de signal (~ 5-24 heures après la transfection en fonction de la protéine), elle peut aussi conduire à des artefacts de surexpression de protéines telles que aggrdélé- ou la saturation des protéines ciblant voies, conduisant à la localisation subcellulaire erronée. </li></ol> 2. La transfection de cellules et culture cellulaire NOTE: Une variété de cellules se prêtent à l&#39;analyse FPP, y compris Hek293, HeLa, COS-7 et des cellules CHO 14. La description suivante est basée sur l&#39;expression de protéines membranaires dans des cellules HEK293. <ol><li> Cultiver les cellules humaines embryonnaires de rein (HEK293) sous forme de monocouches adhérentes dans 6 ml de Eagles modifié de Dulbecco (DMEM), complété avec du sérum 5% de fœtus bovin (FBS), du pyruvate de sodium à 1%, et 250 pg / ml de pénicilline / streptomycine à 37 ° C avec 5% de CO 2. Effectuer tous les travaux avec des cellules dans une hotte à flux laminaire de culture de tissus. Cultiver des cellules dans un milieu de culture jusqu&#39;à ~ 80% de confluence dans un flacon T-75. </li><li> cellules Transfecter utilisant ne importe quel haut rendement standard, à faible méthode de transfection de toxicité, y compris en lipides, technologies viral- ou à base électroporation à générer transient ou une expression stable. Typiquement, 2 pg d&#39;ADN plasmidique par 1 x 10 6 cellules donne une bonne expression de la protéine reproductible. Maintenir des cellules de 5 à 48 h dans un milieu de culture tissulaire approprié à 37 ° C dans un incubateur de culture capable de tissu CO 2. </li><li> Surveiller les cellules pour l&#39;expression de la protéine GFP-fusion en utilisant la microscopie à épifluorescence en utilisant le signal de fluorescence intrinsèque de la GFP, en utilisant les jeux de filtres appropriés selon le protocole du fabricant. Le signal de fluorescence atteint habituellement un maximum dans les 24 à 72 heures après transfection. Utilisation des cellules lorsque le signal de fluorescence atteint un niveau maximum. Surveiller les niveaux d&#39;expression de protéines par analyse par immunotransfert en utilisant des anticorps dirigés contre soit la protéine d&#39;intérêt ou du fragment GFP. </li><li> Pour les cellules de la plaque d&#39;analyse expérimentales sur des lamelles revêtues. Voir soit sous une configuration des cellules vivantes ou après fixation et monter sur des lames de microscopie. cellules de la plaque pour atteindre 60% -80% de confluence dans les 24-48 heures. <ol><li> Manteau de lamelles avec une solution de poly-lysine (0,1 mg / ml), de sorte que toute la surface soit couverte. Incuber pendant 30 min sous une lumière ultraviolette à la température ambiante, puis 60 min dans un incubateur de culture de cellules à 37 ° C. Retirer l&#39;excès de poly-lysine et rincer les lamelles dans du PBS trois fois. </li><li> Alternativement, la plaque les cellules sur un couvercle de verre chambré constituée de plaques de culture cellulaire avec un fond de verre optique pour permettre l&#39;imagerie directe avec les objectifs huile immersion. La configuration réelle de microscopie dépend de l&#39;équipement disponible à l&#39;enquêteur, mais devrait être capable de changements rapides de solutions. Selon la forme de type de cellule et la cellule, les cellules devraient être d&#39;environ 60 à 90% de confluence au moment de l&#39;essai FPP. </li></ol></li></ol> 3. Fluorescence Microscopy Setup <ol><li> Utiliser une ouverture numérique (NA) objectif de haut immersion dans l&#39;huile pour la collecte de signal maximal et la résolution spatiale, comme une 60X, 1,42 NA objectif à immersion d&#39;huile. Utilisez ee suivante lasers pour stimuler les fluorophores: argon 488 nm (GFP et YFP) et 561 diode (DP, mCherry). </li><li> Déterminer l&#39;exposition, le gain et la capture taux optimal d&#39;images pour chaque construction. Ajustez l&#39;intensité du laser et le temps d&#39;exposition afin de minimiser photoblanchiment (voir l&#39;étape 7.1.2). </li><li> Pour les études utilisant de multiples fluorophores (par exemple, un marqueur soluble pour perméabilisation de la membrane de concert avec un marqueur de protéine de la membrane), choisir un filtre approprié fixe pour minimiser le signal de diaphonie et de maximiser le rapport signal-bruit. </li></ol> 4. Mise en place des conditions optimales pour la membrane plasmique perméabilisation <ol><li> Retirer le milieu de culture cellulaire à partir de cellules exprimant seulement des protéines fluorescentes solubles (par exemple EGFP, DsRed). Laver les cellules trois fois (une minute chacun) dans du tampon KHM (110 mM d&#39;acétate de potassium, 3 mM de MgCl2, 20 mM de HEPES-NaOH, pH 7,2). Réaliser des expériences sur des cellules et tous les réactifs à la température ambiante. </li><li> La place des cellules on lamelles (voir l&#39;étape 2.4) dans un tampon KHM sur une scène de microscope à fluorescence et de recueillir la première image, qui représente la commande de l&#39;étage «non-perméabilisées &#39;. </li><li> Pour perméabiliser sélectivement la membrane plasmatique, ajouter la digitonine (30 uM) dans du tampon KHM aux cellules. Perfuser les cellules avec du tampon (tampon digitonine +) à un débit de 5 ml / min pendant 10 à 60 sec. </li><li> Déterminer la concentration optimale de la digitonine en augmentant progressivement la concentration de la digitonine. La concentration digitonine optimale est atteinte quand il ya perte totale de signal de fluorescence de EGFP soluble dans les 10 à 60 secondes d&#39;application digitonine. Pour de nombreuses cellules application de 10 à 50 uM digitonine est suffisante pour perméabiliser la membrane cellulaire. <ol><li> Pour toutes les applications utilisent la concentration la plus basse possible de digitonine. Recueillir images après digitonine perméabilisation pour perméabilisée signal de fond. </li></ol></li><li> Assurez-vous que la chimère GFP-protéine d&#39;intérêt est membraneITéS en confirmant rétention cellulaire du signal de fluorescence suivant la digitonine perméabilisation de la membrane plasmique 16. <ol><li> Exprimez un organite spécifique protéine fluorescente 23. Protéines mitochondriales fonctionnent bien à cet égard 16, par exemple, pDsRed2-Mito vecteur. Déterminer les conditions optimales d&#39;expression tel que décrit dans l&#39;étape 2.1. </li><li> Se assurer que la concentration de la digitonine est approprié pour le type de cellule employé en se assurant que la morphologie des organites intracellulaires et constants (jusqu&#39;à 60 min) une exposition prolongée à la digitonine. REMARQUE: utiliser des protocoles de microscopie d&#39;immunofluorescence standard en utilisant des anticorps contre divers compartiments cellulaires, telles que les lysosomes (par exemple, LAMPE1), l&#39;appareil de Golgi (par exemple, TGN38), réticulum endoplasmique (par exemple, la calnexine), endosomes (par exemple, Rab5), les mitochondries (par exemple, le cytochrome c). Si organite intracellulaire changements morphologie / intégrité considérablement over 60 min, il est probable que la concentration de la digitonine est trop élevé, et nécessite une réduction de la concentration de la digitonine et / ou le temps d&#39;exposition. REMARQUE: Digitonine est toxique par inhalation et par contact avec la peau. Porter un équipement de protection individuelle (EPI). </li></ol></li></ol> 5. Traitement de la protéase protéines fluorescentes <ol><li> Laver les cellules dans un tampon KHM puis ajouter protéase (protéinase K; 50 pg / ml dans un tampon KHM) directement sur les cellules. Perfuser les cellules à un débit de 5 ml / min en utilisant un système de perfusion alimenté par gravité pour la préparation en continu bain de flux. <ol><li> Stocker les solutions à 50 ml seringues et des tuyaux en polyéthylène raccordés réservoirs indépendants à un collecteur avec une sortie unique, dans le bain (débit 5 ml / min). Positionner une pipette d&#39;aspiration pour maintenir un (0,5 ml) Volume du bain constante et réaliser l&#39;échange de solution par commutation manuelle entre les réservoirs de perfusion. </li></ol></li><li> Recueillir des images pour déterminer si le fluorsignal de Escent persiste ou se dégrade. Une perte de&gt; 90% de l&#39;intensité de signal initial sur 30 à 60 secondes est compatible avec la dégradation protéolytique de la protéine chimère-GFP (voir résultats représentatifs). </li><li> Si aucune dégradation du signal est observé avec la protéinase K, lorsqu&#39;une telle perte est prévu, remplacer la solution de protéinase K avec de la trypsine (4-8 mM) dans le tampon KHM. Si nécessaire, utiliser un mélange de trypsine et la proteinase K. Il ne est pas nécessaire pour éteindre l&#39;activité de protease. </li></ol> 6. Approche alternative pour le plasma protéines membranaires avec des domaines externes <ol><li> Pour les protéines de la membrane plasmique, pour réaliser le dosage des protéines fluorescentes externes chimères avant la digitonine perméabilisation. Laver les cellules sur des lamelles dans du tampon KHM (5 ml / min x 3 min), et de prendre une image pour le traitement pré-protéase et quantifier signal de fluorescence pré-protéase comme à l&#39;étape 7. </li><li> Exposer les cellules de la protéase (protéinase K; 50 pg / ml ou trypsine 4-8 mM dans un tampon KHM) en til absence de digitonine par perfusion des cellules avec un milieu contenant KHM protéase (débit 5 ml / min). Recueillir des images de la protéine fluorescente, afin de déterminer comment rapidement le signal disparaît ou combien de temps le signal persiste. </li><li> Avant de perméabilisation de la digitonine, étancher toute activité de protease, par lavage des cellules trois fois (une minute chacun) dans des milieux de culture cellulaire contenant 10% de sérum (FBS). </li><li> Laver les cellules avec du tampon de perfusion KHM (taux de 5 ml / min) pendant 2 min. Acquérir une image pré-perméabilisation. Perméabiliser la membrane cellulaire comme décrit dans l&#39;étape 4. </li><li> Recueillir images suivantes plus protéase comme décrit à l&#39;étape 5. </li></ol> Analyse 7. Image <ol><li> Utilisation d&#39;un microscope inversé capable de «cellules vivantes&quot; enregistrement, dans lequel la perte du signal de fluorescence peut être surveillé en temps réel. Pour la surveillance continue, utiliser des paramètres identiques (temps d&#39;exposition, le gain, l&#39;intensité du laser, etc.). <ol><li> Déterminer experexpérimen- paramètres en observant le signal de fluorescence de la GFP-protéine d&#39;intérêt dans des conditions témoins (à savoir, KBH tampon seul). Ajuster le gain, l&#39;intensité du laser et des paramètres de temps d&#39;exposition sur le microscope commandé par ordinateur pour se assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de perte sensible de l&#39;intensité du signal sur une période de 10-20 min. REMARQUE: l&#39;intensité du signal ne est pas une valeur absolue, mais est basé sur le système de microscope et les paramètres disponibles à chaque PI. Suivre l&#39;évolution de l&#39;intensité relative de fluorescence. </li></ol></li><li> Alternativement, traiter les cellules à un calendrier établi points dans digitonine suivie par une protéase, et fixer les cellules avant de monter sur des lamelles pour l&#39;imagerie. Déterminer les points de temps empiriquement procédures dans les étapes 4 et 5. Pour l&#39;enquête initiale après, commencent à 0, 30, 60, 120 et 300 secondes après addition de digitonine ou protéase. <ol><li> Fixer les cellules (20 min à température ambiante) en utilisant une quantité suffisante de fixateur (3,7% de paraformaldehyde dans du PBS) pour submerger complètement èmecellules de e. </li><li> Quench paraformaldehyde résiduel par rinçage des cellules avec du PBS contenant de la glycine 20 mM (3 x 5 min). </li><li> Monter lamelles en éliminant l&#39;excès de liquide de la lamelle et l&#39;inversion de la lamelle sur support de montage 50 pi sur un microscope de lames de verre pour l&#39;imagerie. Laisser les lames sécher toute la nuit avant d&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Recueillir des images de microscopie par fluorescence (sous les filtres appropriés fixe compatible avec le fluorophore utilisé) en utilisant la fonction de capture d&#39;image vidéo sur un ordinateur contrôlé microscope à fluorescence. </li><li> Quantifier les intensités de signal fluorescent en fonction de la condition d&#39;incubation. Obtenir l&#39;intensité moyenne de pixels dans une région d&#39;intérêt (ROI) qui entoure une cellule individuelle. </li></ol>

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The authors declare no conflict of interest.

L&#39;orientation correcte et la topologie des protéines de la membrane sont essentielles pour leur bon fonctionnement. Malgré l&#39;importance de comprendre protéine membranaire topologie, il ya beaucoup de protéines pour lesquelles ces données sont complètement défaut. FPP fournit un moyen facile et efficace de détermination de protéine membranaire topologie, et qui peut être effectuée par la plupart des laboratoires. L&#39;approche FPP offre des avantages significatifs par rapport aux méthodes précédent...

Les membranes de plasma, ainsi que les nombreuses membranes intracellulaires, servent de barrières séparant deux compartiments aqueux. Dans le cas de la membrane plasmique, la séparation entre l&#39;extérieur et l&#39;intérieur de la cellule; pour organites intracellulaires elle est comprise entre le cytoplasme et la lumière des organites. Par exemple, la membrane du réticulum endoplasmique (RE) sépare un environnement oxydant dans la lumière du RE à partir d&#39;un environnement en réduisant une cytosolique. Les protéines membranaires sont synthétisées sur les ribosomes ER-associé, et d&#39;atteindre leur topologie finale dans la membrane du RE 2. L&#39;acquisition de l&#39;orientation de la membrane appropriée et la topologie des protéines est critique pour leur fonction normale. Corriger la topologie permet les domaines pertinents de protéines membranaires d&#39;interagir avec leurs partenaires de liaison, elle permet des modifications post-traductionnelles importantes se produisent, et dans le cas de protéines de la membrane plasmique, permet à la cellule d&#39;interagir avec et de répondre to son environnement. Pour apprécier pleinement la fonction d&#39;une protéine de membrane, il est impératif de connaître clairement comment cette protéine est orienté par rapport à la membrane à l&#39;intérieur duquel il se trouve, ce est à dire, sa topologie de membrane. En plus de l&#39;acquisition de connaissances scientifiques de base, la compréhension de la topologie d&#39;une protéine de membrane et les aspects d&#39;une surface de la protéine sont exposées à des environnements différents marqué a des implications cliniques depuis protéines membranaires constituent la majorité des trois cibles pharmacologiques. Jusqu&#39;à récemment, les approches de la détermination de protéine membranaire topologie ont nécessité un investissement considérable en temps et de l&#39;argent ou ont exigé des réactifs qui sont difficiles à trouver. Les deux approches expérimentales et in silico ont été employées pour déterminer la topologie de membrane de protéines résidant dans la membrane plasmique. Depuis les premières prédictions de domaines membranaires se étendant sur la base de l&#39;évaluation de l&#39;hydrophobicité indiviacides aminés double 3, de nombreux algorithmes prédictifs sont maintenant disponibles sur l&#39;Internet, et nécessitent tout simplement connaissance de la séquence d&#39;acides aminés de la protéine. Cependant, les hypothèses sont souvent au cœur de ces programmes de modélisation, des hypothèses qui peuvent conduire à des affectations incorrectes de topologie 4,5. En outre, si ces prédictions informatiques peuvent affecter provisoirement régions couvrant la membrane, ils ne déterminent pas toujours si l&#39;extrémité amino ou carboxy terminales de protéines sont dans le cytoplasme, des organites ou lumen extérieur de la cellule. Même avec une augmentation de puissance de calcul, et l&#39;utilisation de l&#39;apprentissage machine algorithmes 6, ces données est toujours un modèle, et doit être validée en utilisant des données expérimentales acquises. Détermination expérimentale directe de topologie de membrane a été réalisée en utilisant des panneaux d&#39;anticorps monoclonaux avec des epitopes connus répartis dans la protéine, où l&#39;évaluation de leur immunoréactivité a été effectuée avant et après perméabilisation de la cellule. Cetteapproche nécessite un ensemble d&#39;anticorps, qui peuvent ne pas être disponibles pour la protéine d&#39;intérêt. Une autre stratégie consiste à concevoir des étiquettes d&#39;épitopes tels que myc ou l&#39;hémagglutinine (HA) dans divers endroits de la protéine, à nouveau suivi par la détermination de l&#39;immunoréactivité avant et après perméabilisation de la membrane. En plus de balises immunogènes, étiquettes enzymatiques (y compris la phosphatase alcaline, β-galactosidase, β-lactamase ou) et des modifications chimiques telles que la numérisation de la cystéine ont tous été utilisée pour déterminer protéine membranaire topologie 7,8. Une autre méthode employée pour la cartographie topologique des protéines de la membrane plasmique se appuie sur une approche légèrement différente de marqueurs d&#39;épitopes. Dans ce procédé, la séquence de marqueur est la séquence consensus de glycosylation N-lié NXS / T. Etant donné que la glycosylation ne se produit que lorsqu&#39;une telle séquence est présente dans le lumen de la voie de biosynthèse, la présence de l&#39;étiquette par rapport à un luminaleun compartiment cytosolique est facilement observable comme un changement de masse sur des gels de SDS-PAGE. Une telle approche a été appliquée sur le canal ionique CFTR multispanning 9. Bien que toutes ces approches ont été utilisées, il est clair que tous exigent des investissements considérables de la biologie moléculaire et la séquence pour générer les constructions multiples. Pour déterminer les informations topologiques concernant protéines transmembranaires situés dans des organites intracellulaires se est avéré être plus difficile. L&#39;application des technologies à base de fluorescence cependant, a fait la détermination de la topologie de la membrane beaucoup plus simple. La technique de fluorescence bimoléculaire complémentation (BiFC) repose sur l&#39;interaction entre deux fragments non fluorescents d&#39;une protéine fluorescente, la restauration des propriétés fluorescentes de 10 cette protéine. Bien qu&#39;initialement décrit pour la détermination des interactions protéine-protéine in vivo 10, cette approche a aussi été utiliséepour déterminer la topologie membranaire protéine dans les cellules végétales 11. Toutefois, cette approche est également fastidieux car il nécessite la génération non seulement des protéines de fusion avec la protéine d&#39;intérêt, mais également une variété de protéines de fusion ciblées vers le cytosol ou organites lumière, et nécessite des connaissances dont intracellulaire membranes de la protéine d&#39;intérêt de réside dans . Une approche alternative plus simple à déterminer protéine membranaire topologie a été décrite 12. L&#39;analyse, par fluorescence de la protection de la protéase (FPP) nécessite la génération d&#39;une protéine de fusion entre la GFP et le gène d&#39;intérêt. L&#39;approche est basée sur l&#39;accessibilité relative des proteases non spécifiques à la fraction de la GFP; selon que la GFP est protégé de la protéolyse par la lumière résidant dans des organites intracellulaires ou est exposé à la protéolyse en étant présente dans le cytosol. Ainsi, si le fragment GFP de la protéine d&#39;intérêt est confronté le cytoplasme, il est exposé àactivité de la protease et le signal de fluorescence perdues. Inversement, si le fragment GFP de la protéine d&#39;intérêt est confronté à un environnement «protégé» à partir de la protéase (tel que la lumière de l&#39;appareil de Golgi), le signal de fluorescence persistera. Pour permettre d&#39;entrer les proteases de la cellule, mais pas entre les compartiments membranaires intracellulaires la liaison cholestérol digitonine médicament est utilisé. Le cholestérol est le sterol dominant chez les vertébrés, et est spécifiquement enrichi dans la membrane de plasma par rapport à compartiments intracellulaires. La toxine de glycoside, la digitonine, est extraite de la plante Digitalis purpurea. Digitonine a une affinité pour les membranes riches en cholestérol, où elle conduit à membrane sélective permeabiliztion 14,16 (figure 1). En plus de permettre la sortie des petits composants cytosoliques, la digitonine perméabilisation permet également l&#39;entrée de molécules exogènes, tels que la protéinase K ou de la trypsine. Le protocole FPP profite de la fact que la membrane de plasma contient jusqu&#39;à 80% de cholestérol cellulaire 17, tandis que d&#39;autres organelles, comme ER, l&#39;appareil de Golgi, endosomes, les mitochondries, qui ont une très faible teneur en cholestérol, 14 restent intacts. L&#39;incorporation sélective de cholestérol dans la membrane plasmique a été observé dans de nombreuses cellules eucaryotes, ce qui permet l&#39;utilisation de la digitonine dépendant membrane plasmique perméabilisation de ces espèces eucaryotes aussi divers que S. cerevisiae à 14,18 humain. Le dosage FPP fournit un moyen simple, rapide et assez robustes de déterminer (a) si une protéine est liée à la membrane / associé ou librement diffusable dans le cytosol et (b) quel domaine d&#39;une protéine de la membrane fait face le cytosol ou organites lumière. Si une protéine membranaire avoir plusieurs orientations, le signal se posera de la forme dominante et formes mineures ne sera pas détecté. Bien qu&#39;il puisse y avoir une certaine inquiétude que l&#39;addition d&#39;un fragment de la protéine GFP à l&#39;intérêt peut affecter sa fonction et/ Ou la localisation subcellulaire, ce est en fait plus théorique que réelle. En effet de nombreuses études ont clairement montré que la balise de la GFP ne modifie pas les propriétés de la protéine 19,20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="370">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:111px;">Name</td>
			<td style="width:80px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:64px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td align="right">300410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cav1-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td align="right">44433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pAcGFP-1 Golgi</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">632464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polylysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mounting Media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>cS704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Plasma Membrane perméabilisation Efficient perméabilisation de la membrane plasmique est déterminée par l&#39;utilisation de protéines fluorescentes solubles (par exemple, GFP, DsRed) (étape 4). Ces protéines, lorsqu&#39;elle est exprimée dans des cellules, sont libres de diffuser dans le cytosol, et sont perdus lors de la membrane plasmique est perméabilisées à l&#39;aide de la digitonine (figure 2). Une disparition complète du signal fluoresce...

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Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Détermination Membrane Protein topologie utilisant la fluorescence protection protéase (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

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Research

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Biology

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

17.6K vues.  Chicago Medical School. Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP. 

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Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

L&#39;utilisation du kit de détection de protéase fluorescent pour déterminer l&#39;activité de protéase

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Recherche

Biologie

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) Dosage pour les interactions protéine-protéine dans les cellules d&#39;oignon Utilisation du pistolet à gènes Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter lipid bilayer properties. This is important because membrane proteins are energetically coupled to their host bilayer by hydrophobic interactions. Changes in bilayer properties thus alter membrane protein function, which provides an indirect way for amphiphiles to modulate protein function and a possible mechanism for "off-target" drug effects. We have previously developed an electrophysiological assay for detecting changes in lipid bilayer properties using linear gramicidin channels as probes 3,12. Gramicidin channels are mini-proteins formed by the transbilayer dimerization of two non-conducting subunits. They are sensitive to changes in their membrane environment, which makes them powerful probes for monitoring changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins. We now demonstrate a fluorescence assay for detecting changes in bilayer properties using the same channels as probes. The assay is based on measuring the time-course of fluorescence quenching from fluorophore-loaded large unilamellar vesicles due to the entry of a quencher through the gramicidin channels. We use the fluorescence indicator/quencher pair 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonate (ANTS)/Tl+ that has been successfully used in other fluorescence quenching assays 5,13. Tl+ permeates the lipid bilayer slowly 8 but passes readily through conducting gramicidin channels 1,14. The method is scalable and suitable for both mechanistic studies and high-throughput screening of small molecules for bilayer-perturbing, and potential "off-target", effects. We find that results using this method are in good agreement with previous electrophysiological results 12.

We introduce a fast fluorescence-based assay that monitors the rate of fluorescence quenching as a measure of gramicidin channel activity. The gramicidin channels are used as molecular force transducers to monitor changes in lipid bilayer properties as sensed by bilayer spanning proteins.

Gramicidine basée Assay fluorescence; pour déterminer le potentiel de petites molécules pour modifier les propriétés bicouche lipidique

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.