Nous remercions Pékin Wu pour l&#39;utilisation de ses données. Ce travail a été soutenu par une bourse de carrière NSF JEK

1. Préparation de ~ 50 nm de diamètre de petites vésicules unilamellaires (SUV) pour Folding des protéines membranaires <ol><li> Une solution de 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC) lipides dans le chloroforme est acheté et aliquotes dans des flacons en verre propre dans 20 mg par flacon pour le stockage de quantités. Une couche de gaz d&#39;azote est ajouté à chaque flacon pour éviter l&#39;oxydation des lipides, et les flacons sont scellés avec des bouchons et de parafilm. Les flacons sont conservés dans un congélateur à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Une seule fiole qui contient une aliquote de 20 mg de lipides dans le chloroforme est utilisé pour chaque expérience. Le contenu du flacon sont séchés en utilisant un flux d&#39;azote gazeux pendant 1 heure jusqu&#39;à ce qu&#39;il ne reste solvable. </li><li> Lipides séchés sont remis en suspension dans 1 ml de tampon phosphate 20 mM de potassium (pH = 7,3) en utilisant un sonicateur bain-marie pendant environ 30 secondes. Cette solution de lipides en suspension apparaîtra nuageux, et est transféré à un plastique de 15 ml tube avec un fond conique. Une autre aliquote de 1 ml de tampon phosphate est ajouté à la fiole de verre vide qui contenait à l&#39;origine des lipides, et sonication est répété, la solution est ensuite ajoutée à la même durée de 15 ml tube. Ce processus est répété un total de 4 fois jusqu&#39;à ce que le volume final dans le tube est de 4 ml, ce qui entraîne une concentration lipidique de 5 mg / ml de cette solution de vésicules stock. </li><li> Le volume 4 ml de solution de vésicules lipidiques est placé dans un endroit chaud (~ 30 ° C), bain d&#39;eau, et soniquées utilisant une micropointe ultrasonicator pendant 1 heure à 50% de cycle. Le but de l&#39;eau du bain est double. D&#39;abord, il empêche la solution lipidique de devenir trop chaud en raison du processus de sonication. Deuxièmement, le bain chaud assure que la température de la solution aqueuse de lipides demeure au-dessus de la température de transition de phase bicouche pendant la sonication; pour DMPC, cette température de transition est ~ 23 ° C. </li><li> La solution soniquée est passé à travers une seringue de 0,22 um de filtre pour enlever les débris de la pointe sonicateur, et cette solution filtrée est équilibré nuit à 37 ° C. </li></ol> 2. Préparation des échantillons pour la formation initiale Curve Dépliage fluorescence <ol><li> Une solution mère de 10 M d&#39;urée dans un tampon phosphate 20 mM (à pH 7,3) est faite. Il est essentiel que l&#39;eau soit ajoutée à la matière solide (et non vice-versa), car la grande quantité d&#39;urée occupe un volume significatif dans la solution. Cette solution d&#39;urée peut être fait par l&#39;ajout de solutés à un nettoyage, bouteille vide et en ajoutant de l&#39;eau jusqu&#39;au volume final prévu. Cette solution peut exiger le réchauffement dans un bain d&#39;eau ou sur une plaque chauffante avec agitation pour dissoudre le soluté. L&#39;urée est hygroscopique et par conséquent, la concentration réelle de la solution stock d&#39;urée devrait être déterminée en utilisant l&#39;indice de réfraction 1. </li><li> Une solution stock tampon de 20 mM de phosphate (pH 7,3) est faite. </li><li> Une solution stock de déplié protéine est préparée. Cette solution de protéines stock doit avoir une concentration de protéine de ~ 200 pM en urée 8 M, 20 mM de tampon phosphate. </li><li> Les échantillons pour les études de fluorescence sont préparés de la manière suivante. Des volumes appropriés de protéines d&#39;actions (article 2.3), solution lipidique des stocks (5 mg / ml de lipides, section 1), une solution d&#39;urée stock 10 M (section 2.1), et un tampon phosphate de stock (article 2.2) sont combinés pour faire des échantillons contenant ~ 4 protéines uM, 1 mg / ml de lipides, et de 0 à 8 M d&#39;urée par incréments de 1 M. Le volume total de chaque échantillon est de 200 mL. Un tableur par exemple (tableau 1) est inclus que les volumes de listes qui doivent utiliser une solution 200 uM stocks de protéines. </li><li> Échantillons de contrôle sont réalisés comme décrit dans la section 2.4, cependant, les protéines ne sont pas ajoutées. En lieu et place de protéines, 4 pi d&#39;une solution d&#39;urée 8 M peuvent être ajoutées afin concentrations des autres composants sont identiques à celles de la section 2.4. Ces espaces sont utilisés pour soustraire de diffusion et un signal de fond qui apparaît dans d&#39;autres les spectres de fluorescence de la protéine. </li><li> Des échantillons provenant des sections 2.4 et 2.5 sont autorisés à incuber à 37 ° C pendant au moins 2 heures avant la mesure de spectres de fluorescence pour assurer pliage complet et d&#39;équilibration. </li></ol> 3. Mesure des spectres de fluorescence Fluorescence de tryptophane de chaque échantillon et blanc est mesuré en utilisant un fluorimètre état stable. Les spectres de fluorescence doit être enregistré avec longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 290 nm pour éviter l&#39;excitation des résidus tyrosine, et numérisé 305 à 500 nm. Entrée typique et passe-bande de sortie est de 3 nm. L&#39;incrément de longueur d&#39;onde et le temps d&#39;intégration peut être optimisé pour signal-bruit. Les valeurs typiques pour incrémenter longueur d&#39;onde et le temps d&#39;intégration sont à 1 nm / étape et 0,5 sec / step, respectivement. Protéines membranaires en général plier en lipides synthétiques seulement lorsque la température est supérieure à la température de transition de phase bicouche. Par conséquent, dans ce cas de DMPC, la température de l&#39;échantillon est maintenue constante à 30 ° C. Une cuvette microvolume silice fondue avec 160 microlitres est utilisé dans ces exriences. 4. Génération de la courbe initiale et dépliage Estimation de énergie libre de Gibbs dépliage des protéines membranaires <ol><li> Les spectres de fluorescence sous la forme d&#39;un ensemble de données xy sont chargés dans des logiciels tels que Igor Pro, Matlab, origine, ou Excel. </li><li> Signal du fond des vésicules lipidiques de l&#39;urée et doit être soustraite suivant la procédure suivante: Spectre Le spectre de fluorescence = premières de protéines dans la présence de vésicules lipidiques et de concentration spécifique de l&#39;urée. Spectre B = spectre brut de fluorescence des échantillons à blanc correspondant qui contient des vésicules lipidiques et la concentration d&#39;urée même que dans le spectre de A; aucune protéine est dans les échantillons à blanc. Spectre corrigé = spectre A - C * B. Spectre C est un scalaire typiquement égal à 1,0. Dans certains cas, C est inférieur ou supérieur à 1,0 en raison de problèmes de dispersion qui causent sur-ou sous-soustraction près de la région ~ 305-320 nm. </li><li> La longueur d&#39;onde de fluorescence maximale, λ max, est totalisées à partir de spectres corrigés pour chaque concentration d&#39;urée. Une valeur typique pour complètement dépliée protéine membranaire est de 350 nm tandis que celle de la protéine repliée est ~ 330 nm. Longueurs d&#39;ondes tabulées sont convertis à la fraction déplié en convertissant la gamme des valeurs max λ (~ 330 à ~ 350 nm) à la gamme de 0,0 à 1,0 pour corréler la valeur λ max à la fraction de la population s&#39;est déroulée. Par exemple, une valeur λ max de 330 nm correspond à 0,0, à 350 nm correspond à 1,0, et 340 nm correspond à 0,5 en termes de fraction dépliée. Cette fraction de protéine est alors déplié fonction de la concentration d&#39;urée. Comme indiqué plus haut, la concentration d&#39;urée doit être déterminée expérimentalement en mesurant l&#39;indice de réfraction. </li><li> Nous supposons que la protéine peut exister dans deux états: pliée ou dépliée. L&#39;intrigue de la fraction déplié, f, fonction de la concentration d&#39;urée, C, peut être adapté à l&#39;équation: 2 <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq2.jpg" alt="Équation 2" /> Le coefficient m correspond à la vitesse de changement de l&#39;énergie libre par rapport à la concentration de dénaturant, et C m correspond à la concentration d&#39;urée milieu au cours de laquelle la population est égale à la population repliée dépliée. Ces valeurs sont les variables montage obtenu à partir des moindres carrés montage par le logiciel d&#39;analyse de données. R (0.001987 kcal / mol • K) est la loi constante des gaz et T est la température (303 K). </li><li> Les coefficients obtenus à partir de l&#39;ajustement sont utilisés pour déterminer l&#39;énergie libre de Gibbs (kcal / mol) de dépliage en l&#39;absence de l&#39;urée: <img src="/files/ftp_upload/2669/2669eq3.jpg" alt="Équation 3"/> . </li></ol> 5. Optimisé Dépliage Courbe pour une mesure plus précise de l&#39;énergie libre de Gibbs dépliage. <ol><li> La courbe de déroulement décrit ci-dessus révèle la gamme des concentrations d&#39;urée qui provoque le plus grand changement dans le λ max. Cette gamme est généralement faible, et la majorité de déroulement se produit dans cette gamme de petite taille. Afin de déterminer précisément l&#39;énergie libre du déroulement, des échantillons supplémentaires sont analysés dans cette région afin d&#39;obtenir une parcelle qui contient de nombreux points de données nécessaires pour optimiser les moindres carrés de montage. Par exemple, si la protéine se déroule entre 2 et 4 M d&#39;urée, les échantillons peuvent être faites qui contiennent de 2 à 4 M d&#39;urée par incréments de 0,2 M de manière plus précise révèle la forme de cette région importante dans la courbe de déploiement. Il n&#39;est pas nécessaire de mesurer les spectres vierge à chaque concentration d&#39;urée, il suffit de mesurer un spectre vierge tous les ~ 0,5 M étape. </li><li> L&#39;énergie libre de dépliage obtenus à partir de ce complot peut différer légèrement de celle obtenue dans la courbe originale se déroule, mais reflète une valeur plus précise. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: <table border="1"><tbody><tr><td> Exemple </td><td> final [urée], M </td><td> protéines de stock (uL) </td><td> lipides stock (uL) </td><td> stock de 10 M d&#39;urée (uL) </td><td> stock tampon (uL) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ~ 0.16 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 156 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 20 </td><td> 136 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 40 </td><td> 116 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 60 </td><td> 96 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 80 </td><td> 76 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 100 </td><td> 56 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 120 </td><td> 36 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 140 </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Volume de solutions de stock nécessaire de faire des échantillons de fluorescence <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Tryptophane spectres de fluorescence de la protéine de la membrane ~ 5 uM représentant qui contient un résidu tryptophane unique. (A) des spectres de fluorescence de la protéine brute (spectre A partir de 4.2), (B) des spectres de fluorescence des premières vierges (spectre B de 4,2), (C) rectifié spectre de 4,2. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Corrigé tryptophane spectres de fluorescence de la protéine de membrane de la figure 1 pour des concentrations d&#39;urée nombreux. <img src="/files/ftp_upload/2669/2669fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Dépliage courbe obtenue à partir des données de la figure 2, avec un ajustement de l&#39;équation en 4.4. L&#39;énergie libre de Gibbs est calculé conformément à la section 4.5.

<ol>
	<li>Shirley, B. A., Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Folding and Stability. , 177-190 (1995).</li><li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves.">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li><li>Lau, F. W., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Assessing+the+Stability+of+a+Membrane+Protein.">A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein.</a> Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).</li><li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro.">&#946;-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li><li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+scene+investigation:+membrane+proteins.">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li><li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces.">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li><li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Tryptophan+Microenvironment,+Soluble+Domain,+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding:+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA.">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li></ol>

Le protocole actuel décrit la génération de courbes de déroulement associée à la membrane des protéines et des peptides qui contiennent des résidus tryptophane. Ici, il est supposé que la fluorescence du tryptophane indique si la protéine est pliée et insérée dans les vésicules lipidiques synthétiques, ou dépliée en solution. D&#39;autres hypothèses, telles que les deux état ​​de pliage et de la dépendance linéaire de l&#39;énergie libre avec la concentration de dénaturant, sont faites dans le...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850345C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biochemicals</td>
<td>04821527</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P288</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P285</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

thermodynamics of membrane protein folding measured by fluorescence spectroscopy

Repliement des protéines membranaires est un sujet émergent ayant une importance fondamentale et liés à la santé. L&#39;abondance des protéines membranaires dans les cellules sous-tend la nécessité d&#39;étude exhaustive sur le pliage de cette famille de protéines ubiquitaires. En outre, les progrès dans notre capacité à caractériser les maladies associées à des protéines mal repliées ont motivé d&#39;importants efforts expérimentaux et théoriques dans le domaine du repliement des protéines. Des progrès rapides dans ce domaine important est malheureusement entravée par les défis inhérents associés à des protéines membranaires et la complexité du mécanisme de pliage. Ici, nous présentons une procédure expérimentale pour mesurer les propriétés thermodynamiques de l&#39;énergie libre de Gibbs se déroule en l&#39;absence de dénaturant, Δ G ° H 2 O, pour une protéine membranaire intégrale représentant de E. coli. Ce protocole met l&#39;accent sur l&#39;application de la spectroscopie de fluorescence pour déterminer l&#39;équilibre des populations d&#39;états plié et déplié comme une fonction de la concentration de dénaturant. Considérations expérimentales pour la préparation de vésicules lipidiques synthétiques ainsi que des principales étapes de la procédure d&#39;analyse de données sont mis en surbrillance. Cette technique est polyvalente et peut être poursuivie avec différents types de dénaturant, y compris la température et le pH, ainsi que dans divers environnements de pliage des lipides et des micelles. Le protocole actuel est celui qui peut être généralisé à toute membrane ou de protéines solubles qui répond à la série de critères discutés ci-dessous.

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Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Cet article détaille la vidéo la procédure expérimentale pour l&#39;obtention du énergie libre de Gibbs du repliement des protéines membranaires par le tryptophane de fluorescence.

Thermodynamique du repliement des protéines membranaires mesuré par fluorescence Spectroscopie

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

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18.2K vues.  University of California San Diego - UCSD. Cet article détaille la vidéo la procédure expérimentale pour l'obtention du énergie libre de Gibbs du repliement des protéines membranaires par le tryptophane de fluorescence.

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Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

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Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

Mélangeurs microfluidiques pour étudier repliement des protéines

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membrane-SPINE: un outil biochimique pour identifier les interactions protéine-protéine de protéines membranaires<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Préparation de la matrice extracellulaire des fibres de protéines pour Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Ingénierie « Golden » Fluorescence par l’Incorporation de la pression sélective d’amino-acides Non canoniques et analyse des protéines par spectrométrie de masse et de Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

Dans Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure single-molecular binding kinetics, assess mechanical properties of ligand-receptor interactions, visualize protein dynamic conformational changes and more excitingly elucidate receptor mediated cell mechanosensing mechanisms. More recently, BFP has been used to measure the spring constant of molecular bonds. This protocol describes the step-by-step procedure to perform molecular spring constant DFS analysis. Specifically, two BFP operation modes are discussed, namely the Bead-Cell and Bead-Bead modes. This protocol focuses on deriving spring constants of the molecular bond and cell from DFS raw data.

A biomembrane force probe (BFP) is an in situ dynamic force spectroscopy (DFS) technique. BFP can be used to measure the spring constant of molecular interactions on living cells. This protocol presents spring constant analysis for molecular bonds detected by BFP.

Analyse de la constante de ressort moléculaire par spectroscopie de sonde de force de biomembrane

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...