The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.

Effectuez les protocoles expérimentaux ici dans l&#39;ordre décrit ci-dessous. les protocoles de microfabrication pour la création de la plate-forme microfluidique sont examinées à l&#39;étape 1 étape 2 décrit le protocole de culture bactérienne (figure 2), et l&#39;étape 3 se rapporte à l&#39;assemblage du dispositif expérimental (figure 3). Enfin, l&#39;étape expérimentale réel est décrit à l&#39;étape 4. Procédure de fabrication 1 Chip REMARQUE: les procédures de sécurité doivent être suivies pour les procédés décrits ci-dessous. Consultez l&#39;agent de sécurité institutionnel pour plus de détails. <ol><li> Concevoir le masque avec un logiciel approprié (par exemple, L-Edit). La conception de la chaîne se compose d&#39;un micro-canal principal 625 um de largeur. La région centrale de la chaîne contient un réseau de micro-messages 50 m de diamètre, espacés de 25 um à part (voir Fichiers supplémentaires). </li><li> Imprimez le design sur verre (5 &quot;x 5&quot; verre sodocalcique), Qui a une épaisseur de 0,09 &quot;et est recouvert par environ 70 couche épaisse nm de chrome (Cr), en utilisant le masquage de manière à préparer un masque de photo. Utilisation AZ400K développeur pendant 1 min. Ensuite graver la couche de Cr en utilisant du Cr décapant pendant environ 1 min de l&#39;acétone pour enlever la résine et le nettoyer avec une solution piranha froid. (H 2 SO 4 et H 2 O 2 dans un rapport de 3: 1). </li><li> Photolithographie <ol><li> Nettoyer une plaquette 4 &quot;de silicium norme chimiquement avec une solution piranha pendant 20 min. </li><li> Rincer la plaque avec de l&#39;eau déminéralisée et sécher. </li><li> Chauffer la pastille sur une plaque chauffante (200 ° C pendant 15 min). </li><li> Enduire la plaque de silicium de résine photosensible. Ici, l&#39;AZ4620 de résine photosensible positive a été enduite par centrifugation sur une tranche de silicium à 2000 tours par minute pendant 25 secondes pour obtenir une couche épaisse de 12,5 um. </li><li> Retirez tout le solvant par cuisson douce de la tranche sur une plaque chauffante en faisant flotter la tranche de 90 secondes sur les flux d&#39;azote à 100 ° C. Alors, gardez-le dans le vide à til même température pendant 60 sec. </li><li> Placez la tranche dans une boîte sombre pendant 24 heures pour la déshydratation. </li><li> Exposer la tranche à de la lumière UV afin de transférer le motif conçu à la résine photosensible. </li><li> Immerger la plaquette dans une solution de révélateur de résine photosensible (AZ400K) à 240 sec. Ensuite, rincer la tranche avec de l&#39;alcool isopropylique et le sécher en le plaçant dans un flux d&#39;azote gazeux. </li></ol></li><li> ICP-DRIE (Plasma à couplage inductif - Deep Reactive Ion Etching) Process <ol><li> Appliquer gravure DRIE. Choisissez la profondeur de gravure appropriée en fonction de la profondeur finale requise pour le dispositif (50 um dans cette enquête). Résine photosensible agit comme une couche de masquage au cours de ce processus. </li><li> Retirer la résine photosensible restante avec de l&#39;acétone et nettoyer la plaquette. </li></ol></li><li> PDMS (polydiméthylsiloxane) Castings <ol><li> Utilisez trichlorométhylsilane (SMTC) pour silaniser la moule maître de silicium. Versez 2 ou 3 gouttes de trichlorométhylsilane dans un flacon et le placer dans un dessiccateur à côté de lasilicium moule maître. Autoriser 2-3 h pour le processus de silanisation pour terminer. </li><li> Dans un récipient séparé, mélanger la base de silicone Sylgard 184 avec l&#39;agent de durcissement par rapport en poids de 10: 1 pour préparer des PDMS. Dégazer les PDMS en le soumettant à des conditions sous vide (environ 2 h). </li><li> Mettez le moule maître de silicium dans un support. Puis verser le PDMS sur le moule maître de silicium pour former le tampon en PDMS. Veiller à ce que les bulles ne se forment pas dans les PDMS cours de ce processus. </li><li> Guérir les PDMS pendant 2 heures à 80 ° C. </li><li> Décollez le timbre de PDMS du moule maître. Ensuite, couper les PDMS timbre en puces distinctes. Enfin, l&#39;utilisation d&#39;un noyau de coupe pour percer des trous pour l&#39;entrée (s) et sortie (s). </li></ol></li><li> Collage de PDMS à verre <ol><li> Dégager la lamelle et PDMS tampon à un plasma d&#39;oxygène pendant 30 secondes. Bond PDMS timbre à la lamelle. </li><li> Pour obtenir une bonne étanchéité entre le timbre de PDMS et la lamelle couvre-objet, le dispositif de recuit en le plaçant dans un four à 70 ° C pendant 10 min. </li&gt; </ol></li></ol> 2. culture bactérienne REMARQUE: Les protocoles de biosécurité doivent être suivies pour les étapes 2-4. Consultez l&#39;agent de sécurité institutionnel pour plus de détails. <ol><li> Préparer des plaques de gélose LB <ol><li> Ajouter 20 g de Luria-Bertani (LB) gélose (Miller) des poudres et 500 ml d&#39;eau ultra-pure à une fiole de 1 L. Remuez pour dissoudre la poudre. </li><li> Stériliser à l&#39;autoclave à 15 psi, 121 ° C pendant 15 min. </li><li> Laisser le flacon refroidir à 50-55 ° C sur un banc ou dans un bain d&#39;eau dans la hotte de biosécurité. </li><li> Ajouter l&#39;antibiotique tétracycline pour obtenir une concentration finale de 50 pg / ml. Bien mélanger en tourbillonnant. </li><li> Verser le mélange dans des assiettes. Remplir chaque plaque jusqu&#39;à 1.2 à 2.3 complet. </li><li> Air flamme bulles brièvement pour les faire éclater si elles se forment. Bulles d&#39;air solidifiées sont difficiles à diffuser la culture bactérienne sur. </li><li> Laisser les plaques refroidir à la température ambiante pendant une nuit. </li><li> Quand ils sont froids,mettre des plaques de retour dans leur manche, sceller le sac, l&#39;étiquette (antibiotique et la date), et conserver à 4 ° C. REMARQUE: Couvrir le stock de plaques avec du papier d&#39;aluminium, comme la lumière désactive de nombreux antibiotiques. </li></ol></li><li> Préparation du bouillon LB <ol><li> Ajouter 20 g de Luria-Bertani (LB) (Miller) des poudres et 1 L d&#39;eau ultra-pure à un ballon. Remuez pour dissoudre la poudre. </li><li> Stériliser à l&#39;autoclave à 15 psi, 121 ° C pendant 15 min. </li><li> Laisser refroidir ballon à 50-55 ° C sur un banc ou dans un bain d&#39;eau dans la hotte de biosécurité. </li><li> Ajouter l&#39;antibiotique tétracycline pour obtenir une concentration finale de 50 pg / ml. Bien mélanger en tourbillonnant. </li><li> Une fois refroidi, placez la bouteille étiquetée à 4 ° C. REMARQUE: Couvrir la bouteille avec du papier d&#39;aluminium, comme la lumière désactive de nombreux antibiotiques. </li></ol></li><li> Les bactéries de la culture sur une plaque de gélose LB (Ce protocole utilise Pseudomonas fluorescens) <ol><li> Prenez le stock bactérienne du congélateur (-80 °; C) et placez-le sur la glace. </li><li> Placez le -80 ° C stocks bactérienne et une plaque de gélose LB dans une hotte de sécurité biologique. </li><li> La série de souches bactériennes sur une plaque de gélose LB dans un motif en zigzag. Couvrir la plaque de gélose et incuber à 30 ° C pendant la nuit. Enfin, stocker la plaque au réfrigérateur à 4 ° C. </li></ol></li><li> Préparer la solution bactérienne (S1) <ol><li> Verser 50 ml de milieu de bouillon LB à un ballon autoclave. Effectuez cette opération dans une hotte de sécurité biologique. </li><li> Transférer une colonie bactérienne unique de la gélose LB plaque dans le ballon. Cette opération doit également être effectuée à l&#39;intérieur d&#39;une hotte de sécurité biologique. </li><li> Mettre la fiole dans un incubateur agitateur à 30 ° C et 150 tours par minute pendant un temps suffisant (4 heures). </li></ol></li><li> Préparer la solution bactérienne diluée (de S2) <ol><li> Verser 5 ml de milieu LB de bouillon dans un tube en plastique stérilisé. </li><li> Diluer S1 par mélange avec un bouillon LB. Ensuite, vortex la solution. Diluer la solution atteindre l&#39;optique désiréedensité al (DO mesurée à 600 nm = 0,1). REMARQUE: expériences biofilm utilisent généralement des valeurs de DO dans ce voisinage. </li></ol></li></ol> 3 Préparer la configuration expérimentale <ol><li> Utilisation des pinces connecter des tubes souples en matière plastique (0,20 &quot;d&#39;identification) dans l&#39;entrée (s) et sortie (s) de la puce électronique. Les entrées et les sorties ont été préalablement percés dans la partie de PDMS de la puce (étape 1.5.5). Dans cette enquête , la puce électronique est constitué de deux entrées et une sortie. </li><li> Remplir la seringue (s) avec une solution bactérienne (solution S2) et enlever toutes les bulles dans la seringue (s). </li><li> Connectez embout de la seringue (s) (30 G 0,5 &quot;d&#39;aiguille émoussée) dans le tube (s) d&#39;entrée. Ensuite, connectez le tube de sortie (s) de perdre conteneur. </li></ol> 4 Réalisation de l&#39;expérience <ol><li> Fixez la seringue (s) à la pointe (s) de la seringue. </li><li> Place et fixe seringue (s) sur la pompe à seringue. Ensuite, placez la puce sous un microscope optique avec lentilles de l&#39;objectif de desired grossissement (par exemple, 40X). Couvrir la puce avec un dispositif de chambre de cellules vivantes de maintenir un environnement à température constante pour la croissance bactérienne (à 30 ° C pour P. fluorescens). </li><li> Placer la pompe au niveau du débit souhaité (par exemple 10 pi / h) et de lancer pompage de fluide. </li><li> Une fois que les bactéries sont introduites dans la chambre, la formation du biofilm est également déclenchée. La formation du biofilm et la maturation se produisent généralement sur une période de plusieurs heures, voire plusieurs jours. Observer et prendre des images de la croissance du biofilm à travers le microscope. </li></ol>

<ol>
	<li>Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+web+of+streamers:+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device.">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).</li><li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Biofilms:+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections.">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li><li>Wong, G. C. L., O&#8217;Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+together+now:+Integrating+biofilm+research+across+disciplines.">All together now: Integrating biofilm research across disciplines.</a> MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).</li><li>Yazdi, S., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+aggregation+and+biofilm+formation+in+a+vortical+flow.">Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow.</a> Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).</li><li>Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+flow+regime+on+pressure+drop+increase+and+biomass+accumulation+and+morphology+in+membrane+systems.">Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems.</a> Water Res. 44, 689-702 (2010).</li><li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2.">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li><li>Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+biological+clogging+in+unsaturated+porous+media.">Modeling of biological clogging in unsaturated porous media.</a> J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation.">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).</li><li>Neethirajan, S., et al., Bhushan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encylopedia of Nanotechnology. , (2012).</li><li>Barathi, S., Vasudevan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+petroleum+hydrocarbons+by+Pseudomonas+fluorescens+isolated+from+a+petroleum-contaminated+soil.">Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil.</a> Environ Int. 26, 413-416 (2001).</li><li>Das, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+post-formation+dynamics+of+bacterial+biofilm+streamers+as+highly+viscous+liquid+jets.">Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets.</a> arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).</li><li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms.">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Phys Rev Lett. 93, (2004).</li><li>Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-chip+methodologies+for+the+study+of+transport+in+porous+media:+energy+applications.">Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications.</a> Lab Chip. 8, 689-693 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nous avons démontré un dispositif microfluidique simple qui imite les milieux poreux pour étudier le développement de biofilm dans des habitats complexes. Il ya plusieurs étapes critiques qui dictent les résultats des expériences. Ils comprennent la géométrie de l&#39;appareil. Alors que la géométrie de poste peut varier, pores suffisamment d&#39;espace pour banderoles pour former est nécessaire. En outre, Valiei et al. 1 ont démontré que la formation de banderoles a lieu seulement dans...

Récemment, nous avons démontré bactériennes dynamique de formation d&#39;un biofilm dans un dispositif microfluidique qui imite un milieu poreux 1. Les biofilms bactériens sont essentiellement des colonies de bactéries de surface agrégées qui sont encastrés par des substances polymériques extracellulaires (EPS) 2-4. Ces films minces de bactéries peuvent se former dans presque toutes les niches imaginables allant de surfaces lisses à l&#39;habitat beaucoup plus complexe de milieux poreux. Valiei et al. 1 a utilisé un dispositif microfluidique avec une matrice de micro-piliers pour simuler une structure de support poreuse et a étudié la formation de biofilms dans ce dispositif en fonction du débit de fluide. Ils ont constaté que dans un certain régime d&#39;écoulement, les biofilms filamenteux appelés banderoles ont commencé à émerger entre les différents piliers. Les banderoles peuvent être attachés à une ou deux extrémités de surfaces solides, mais le reste de la structure est suspendue dans un liquide. Serpentin formation commence typiquement après une première couche de biofilm est formé et son formation peut dicter l&#39;évolution à long terme de biofilm dans des habitats complexes. Récemment, plusieurs chercheurs ont étudié la dynamique de la formation de banderoles. Yazdi et al. 5 a montré que les banderoles peuvent se former dans les flux tourbillonnaire provenant d&#39;une bulle oscillante. Dans une autre expérience, Rusconi et al. Six étudié l&#39;effet de la courbure de la voie et de la géométrie de la voie de la formation de flammes. Ils ont constaté que les flammes peuvent se former dans les sections courbes de microcanaux, et streamer morphologie est liée à la mobilité. Des recherches récentes ont démontré que les banderoles peuvent avoir d&#39;importantes répercussions dans divers scénarios naturels et artificiels, car ils peuvent agir comme précurseurs pour la formation de structures matures dans les interfaces poreuses, conduire à une prolifération rapide et catastrophique biofilm dans un systèmes biomédicaux, et aussi causer accréditives importante interactions de structure, etc 1,7-9. banderoles de biofilms forment souvent ihabitats n complexes tels que les milieux poreux. La croissance du biofilm compréhension poreux environnement médiatique est pertinente à plusieurs procédés industriels et environnementaux tels que le traitement biologique des eaux usées 10, le maintien du bien-alésage intégrité dans des situations comme capture du CO 2 11 et le colmatage des pores dans le sol 12. Observer la formation de biofilm dans ces habitats complexes peut souvent être difficile en raison de l&#39;opacité du milieu poreux. Dans de telles situations, les plates-formes de médias poreux microfluidiques à base peuvent s&#39;avérer extrêmement avantageux car ils permettent en temps réel et le suivi in situ. Un autre avantage de la microfluidique est la possibilité de construire plusieurs bioréacteurs sur une seule plate-forme de bio-microfluidique et en même temps permettre le suivi et / ou l&#39;intégration de capteurs en ligne. La flexibilité de mettre en œuvre des expériences de laboratoire multiples dans un seul appareil et la capacité de recueillir des données pertinentes importantes pour l&#39;analyse statistique précise est une importante advantage de systèmes microfluidiques 13,14. Dans le contexte de la discussion ci-dessus, la compréhension dynamique de formation de banderoles dans un environnement de milieux poreux serait bénéfique à plusieurs applications. Dans cette étude, nous développons le protocole d&#39;enquête pour la formation de banderoles dans un appareil qui imite les milieux poreux. La fabrication de la plate-forme microfluidique, les mesures nécessaires pour la culture cellulaire et l&#39;expérimentation est décrite. Dans nos expériences, la souche bactérienne de type sauvage de Pseudomonas fluorescens a été utilisé. P. fluorescens, qui se trouve naturellement dans le sol, joue un rôle clé dans le maintien de l&#39;écologie du sol 15. La souche bactérienne utilisée a été génétiquement modifié pour exprimer la protéine fluorescente verte (GFP) constitutive.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1038">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:339px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Flourescent Microscope</td>
			<td style="width:255px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">LB agar</td>
			<td style="width:255px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1425-500</td>
			<td>suspend 40 g in 1 L of purified water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">LB broth</td>
			<td style="width:255px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1427-500</td>
			<td>suspend 20 g in 1 L of purified water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Biosafety hood</td>
			<td style="width:255px;">Microzone corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Petri-dish</td>
			<td style="width:255px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">875712</td>
			<td>sterile 100mmx15mm polystyrene petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:325px;">Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;">Excella E24incubator shaker series</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL sterilized centrifuge tube</td>
			<td style="width:255px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430828</td>
			<td>Polypropylene Rnase-/Dnase-free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Tetracycline free base</td>
			<td style="width:255px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">103012</td>
			<td>50 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">SYLGARD 184 silicone</td>
			<td style="width:255px;">Dow Corning Corporation</td>
			<td style="width:119px;">68037-59-2</td>
			<td>Elastomer Base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Positive photoresist (AZ4620)</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Plastic tube</td>
			<td style="width:255px;">Cole- Parmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for biofilm streamer formation in a microfluidic device with micro-pillars

Plusieurs espèces bactériennes possèdent la capacité de se fixer sur les surfaces et dans les coloniser la forme de films minces appelées biofilms. Les biofilms qui se développent dans les milieux poreux sont pertinentes pour plusieurs procédés industriels et environnementaux tels que le traitement des eaux usées et séquestration du CO 2. Nous avons utilisé Pseudomonas fluorescens, une bactérie aérobie Gram-négatif, à étudier la formation de biofilm dans un dispositif microfluidique qui imite les milieux poreux. Dispositif microfluidique est constituée d&#39;une matrice de micro-messages, qui ont été fabriqués en utilisant la lithographie molle. Par la suite, la formation de biofilms dans ces dispositifs à écoulement a été étudiée et nous démontrons la formation de biofilms filamenteux appelés banderoles dans notre dispositif. Les protocoles détaillés pour la fabrication et l&#39;assemblage de dispositif microfluidique sont fournis ici avec les protocoles de culture bactérienne. Les procédures détaillées pour l&#39;expérimentation avec le dispositif microfluidique sont également présentées, ainsi que représentantrésultats.

En utilisant le protocole de microfabrication mentionné ci-dessus, un dispositif microfluidique à base de PDMS a été construit. Figure 1 montre le microscope électronique à balayage (MEB) d&#39;images de l&#39;appareil PDMS. Figure 1a représente la section d&#39;entrée du dispositif. Une entrée en forme de fourche est créé pour égaliser la pression à travers la tête de l&#39;appareil. De plus l&#39;imagerie SEM a montré également que les parois de pilier sont presque ver...

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Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protocole pour la formation du biofilm Streamer dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

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Research

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Bioengineering

12.1K vues.  University of Alberta. Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated. 

Vidéo: Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Dispositif microfluidique pour Recréer un microenvironnement des tumeurs<em&gt; In vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Recherche

Bio-ingénierie

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Un dispositif microfluidique pour l&#39;étude de plusieurs souches distinctes

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Fabrication microfluidique de fibres polymères et biohybrides avec une taille et une forme redessinées

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analyse Inhomogénéité mélange dans un dispositif microfluidique par Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-culture de la vie microbiome avec Microengineered Human Intestinal Villi dans un Gut-on-a-Chip microfluidique périphérique

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

Irrigables réseau vasculaire avec un modèle de tissu dans un dispositif microfluidique

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Une plate-forme microfluidique pour stimuler les chondrocytes avec compression dynamique

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Établir des co-cultures à base de cellules uniques dans une manière déterministe avec une puce microfluidique

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Mise en place d’un dispositif microfluidique pour la production de bouchons combinatoires

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

Pleins feux sur l’auteur : Intégration des approches computationnelles et expérimentales en oncologie de précision

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

Dispositif microfluidique bicouche pour la production de bouchons combinatoires

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...