Le protocole présenté décrivant l’analyse de l’excroissance neurite qui est très pertinent pour la biologie humaine et l’évaluation de la neurotoxicité d’une petite molécule composés. Le potentiel translationnel élevé et la pertinence physiologique des cellules progénitrices neurales humaines en tant que modèle principal de cellules humaines offrent un avantage considérable dans le criblage et l’évaluation de neurotoxicité liés à la découverte de drogues liées à la croissance neurite. En utilisant le protocole présenté, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme et les neurones humains dérivés de cellules souches embryonnaires peuvent également être utilisés comme sources cellulaires alternatives pour l’analyse de la prolifération des neurites et l’évaluation de la neurotoxicité.
Commencez par recueillir les médias avec des neurosphères flottantes et le transférer dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger le tube à 300 à 400 fois g pendant trois minutes. Ensuite, aspirez soigneusement le surnatant.
et résuspendez les sphères dans 500 microlitres de réaménagement de dissociation cellulaire décongelé. Incuber les sphères à 37 degrés Celsius pendant cinq à 15 minutes. Ajouter ensuite de cinq à 10 millilitres de médias de culture préchauffés et centrifuger le tube à 300 à 400 fois g pendant cinq minutes pour sédimenter les neurosphères.
Aspirez le supernatant et ajoutez deux millilitres de tuyaux de médias culturels de haut en bas avec une pipette de 1000 microlitres jusqu’à ce que les neurosphères forment une suspension cellulaire unique. Après avoir compté les cellules, ajouter deux à 3 millions de cellules à un flacon T25 en 10 millilitres de médias culturels. Remplacez la moitié des médias culturels tous les trois jours.
Utilisez le milieu de cryopréservation disponible dans le commerce pour congeler les cellules. Transférer les neurosphères dans un tube de 50 millilitres et permettre aux sphères de s’installer au fond. Utilisez une pointe de pipette de 200 ou 1000 microlitres pour transférer les grandes neurosphères dans un nouveau tube de 50 millilitres avant de passer.
Centrifuger les neurosphères restantes à 300 à 400 fois g pendant trois minutes et retirer soigneusement le supernatant. Resuspendez jusqu’à mille sphères en un millilitre de réanimateur cryopréservation et transférez-le dans un tube cryo. Conservez le tube toute la nuit à moins 80 degrés Celsius, puis déplacez-le vers de l’azote liquide pour le stockage à long terme.
Pour mesurer l’excroissance neuronale, ouvrez l’image aux Fidji et sélectionnez Analyze, Tools et ROI Manager. Cliquez à droite sur la cinquième icône de la barre d’outils Droite et passez à la ligne à main levée. En option, double-cliquez sur la même icône pour changer la largeur de la ligne à 10.
Tracez ensuite le plus long neurite commençant près du corps cellulaire et s’étendant jusqu’à la pointe. Contrôle de presse et T puis F pour ajouter la mesure au gestionnaire de retour sur investissement et mettre en évidence le neurone mesuré. Sélectionnez tous les numéros dans le roi.
Cliquez sur Mesurer, puis copiez et coller les mesures dans une feuille de calcul. Pour mesurer l’intensité de fluorescence des cellules étiquetées, cliquez sur la quatrième icône de la barre d’outils Sélections à main levée et dessinez la forme de la cellule. Cliquez sur Analyser et définir les mesures.
Assurez-vous ensuite que la zone, la valeur grise moyenne, la valeur gris max Min et la densité intégrée sont sélectionnées. Cliquez sur Analyser et mesurer. Sélectionnez la région à côté de la cellule comme arrière-plan.
Et puis cliquez sur analyser et mesurer. Sélectionnez toutes les données de mesure et copiez-les, coller dans une feuille de calcul. Pour enrober la plaque, ajouter 30 microlitres de poly-L-lysine dans chaque puits d’une plaque de 384 puits et incuber la plaque à température ambiante pendant une heure.
Lavez-le deux fois avec du PBS et laissez-le sécher pendant environ 30 minutes. Ajouter 30 microlitres de laminine à chaque puits, puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Répétez les lavages avec PBS et procéder au placage des cellules.
Ajouter 20 000 neurosphères unicelliques dans 25 microlitres de médias de différenciation à chaque puits de la plaque de 384 puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq jours. Des compétences de pipetage de haute précision sont requises pour placage du nombre exact de neurosphères qui sont toutes séparées en cellules individuelles. Par conséquent, la différenciation des neurosphères en neurones avant le placage est recommandée pour obtenir des résultats plus reproductibles.
Après l’incubation, ajouter cinq microlitres de composé d’essai à chaque puits à six fois la concentration désirée. Et incuber les cellules pendant encore 24 heures. Pour effectuer l’essai de viabilité cellulaire, ajoutez 30 microlitres de réaccente luminescente à chaque puits.
Et laisser la plaque sur un shaker pendant deux minutes. Centrifuger la plaque à 300 à 400 fois g pendant 30 secondes, puis incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes, la protégeant de la lumière. Après l’incubation, mesurer la luminescence sur un lecteur de microplaque.
Les neurones humains dérivés des cellules progénitrices neurales ont été utilisés pour examiner l’effet des inhibiteurs du HDAC en tant que composés épigéniques à petites molécules pour l’extension des neurites et la capacité névrogène subséquente des composés de petites molécules. La neurotoxicité des inhibiteurs du HDAC a également été évaluée après avoir différencié les cellules progénitrices neurales dans des plaques de 384 puits, montrant le potentiel d’échelle du protocole pour un plus grand nombre de composés. Dans une étude différente, la mesure de l’intensité neuronale de fluorescence cellulaire a été utilisée pour quantifier l’abondance de l’histone H4 lysine cinq acétylation comme marqueur d’histone après avoir traité les neurones avec des composés modificateurs épigénétiques.
En outre, ce protocole a été utilisé pour visualiser une protéine présynaptique, la synaptophysine, pour vérifier les effets synaptogéniques possibles des composés de petites molécules. À l’aide de la méthode présentée, le nombre de neurites, l’intensité, la longueur et la largeur, ainsi que les caractéristiques synaptiques, y compris les modifications pré et post-synaptiques des protéines, pourraient être mesurés de façon fiable.
