Ce travail a été soutenu par un financement à RAW de ce qui suit: National Institutes of Health accorde K01 DK083512, DP2 OD008470, et R01 DK100237; Mars of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar octroi d&#39;une subvention # 5 FY12-75; les fonds de démarrage de l&#39;Université de Notre Dame College of Science et Département des sciences biologiques; et un don généreux à l&#39;Université de Notre Dame de Elizabeth et Michael Gallagher au nom de la famille Gallagher à favoriser les cellules souches. Les bailleurs de fonds n&#39;ont joué aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte de données et l&#39;analyse, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Nous remercions le personnel du Département des sciences biologiques pour leur soutien, et le Centre pour la recherche de poisson zèbre à Notre-Dame pour leur dévouement exceptionnel dans le soin et le bien-être de notre colonie de poisson zèbre. Enfin, nous remercions les membres de notre laboratoire de recherche pour leurs commentaires, discussions et idées sur ce travail.

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer.

Ici, nous avons décrit des procédés qui permettent la visualisation des composants de segments de néphron dans le poisson zèbre adulte. L&#39;injection de dextran conjugués fluorescents permet préférentiel étiquetage du PCT en raison des propriétés d&#39;endocytose de ces cellules des tubules proximaux 30,38. Cette méthode peut être réalisée avec une grande flexibilité en raison de l&#39;existence des dextranes qui peut être obtenu avec une multitude de différents conjugués fluorescents. En outre, l&#39;utilisation de dextranes de lysine peut être fixé est d&#39;une manière particulièrement commode pour étiqueter PCT segments, comme les procédures d&#39;étiquetage secondaires ne sont pas nécessaires. Cela permet la détection du signal relativement simple et est compatible avec de nombreux autres marqueurs fluorescents, immunomarquage, et l&#39;utilisation de lignes de journaliste transgéniques. Alcaline phosphatase étiquetage de marque aussi le tubule proximal, avec une forte réactivité dans le PCT et réactivité légèrement plus faible dans le PST. Enfin, la coloration de DBA permet l&#39;étiquetage des segments des tubules distaux, qui affichent un characteristic morphologie ramifiée. Différentes molécules de lectine, qui sont des protéines de sucre de liaison d&#39;origine non immune, ont été largement utilisés pour distinguer les segments de néphron de mammifère 47. Il est intéressant de noter que DBA dans le poisson zèbre est en corrélation avec les segments de tube distal, comme il est utilisé pour marquer les tubes collecteurs dans les reins de mammifères 47. Pris ensemble, ces procédés peuvent être utilisés dans diverses combinaisons pour documenter la composition et la fonction rénale. Depuis toutes ces méthodes peuvent être utilisées dans les préparations de rein entiers, ils fournissent des outils pour évaluer la structure et la fonction des néphrons tout au long de l&#39;organe sans dépendre entièrement de l&#39;utilisation de plus de temps, les méthodes fastidieuses, par exemple, le travail de cryosection et immunomarquage. Cependant, les colorants décrits dans cet article sont des méthodes viable en cryosection. analyse de Coupe à congélation génère des échantillons (par rapport à l&#39;ensemble de montage) qui sont mieux adaptés pour l&#39;immunohistochimie pour détecter Pepti spécifiquesdes, même si bien sûr ce type d&#39;analyse nécessite la disponibilité d&#39;anticorps primaires appropriés. Malheureusement une limitation majeure à travailler avec le modèle animal le poisson zèbre reste la faible disponibilité d&#39;anticorps. Ainsi WISH reste le plus largement utilisé, c&#39;est à dire, &quot;go-to&quot;, procédure pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique. WISH utilisant des réactions de substrat BCIP, NBT, et / ou INT à produire des précipités violets ou rouges n&#39;est pas compatible avec coloration fluorescente sur cryosections. Une option serait d&#39;invoquer l&#39;utilisation de la détection de WISH fluorescent, une procédure qui a été optimisé pour les échantillons embryonnaires de poisson zèbre et pourraient être adaptés pour une utilisation avec le rein adulte. La description des méthodes de cet article de la vidéo doit permettre de poursuivre l&#39;expérimentation des techniques comme WISH fluorescent en combinaison avec des lignes de poisson zèbre transgénique dans les segments individuels sont étiquetés avec un journaliste comme eGFP ou mCherry. Alternativement, les méthodes décrites ici CoulD être testé en combinaison avec d&#39;autres colorants vitaux, par exemple, d&#39;autres lectines. Ainsi, outre l&#39;adaptation et l&#39;expansion des méthodes décrites ici peuvent être invoquées pour répondre aux besoins du chercheur pour préparations entières de rein de montage et d&#39;analyse. En tant que tels, ces procédés ont un large potentiel d&#39;application avec le modèle de poisson zèbre pour les études en cours de régénération et également dans la modélisation de la maladie génétique. Il ya un besoin urgent pour la recherche innovante et les traitements contre les affections rénales. Des millions de personnes souffrent d&#39;une forme de la maladie rénale chaque année qui résulte de causes congénitales, aigu, et / ou chroniques. En outre, la prévalence de la maladie rénale continue d&#39;augmenter dans le monde entier, faisant de ces maladies une émission de la santé publique mondiale 14,15. Les traitements tels que l&#39;hémodialyse sont disponibles grâce auquel une machine de dialyse externe sert à débarrasser le sang des déchets métaboliques du patient si leurs reins ne sont pas en mesure de remplir ce rôle. Malheureusement, Cette intervention a des limites, comme le traitement en cours est nécessaire pour la survie. En outre, les patients auront éventuellement besoin d&#39;une transplantation rénale, qui peut prendre des années pour recevoir une fois par patient est placé sur une liste d&#39;attente. Même après l&#39;obtention d&#39;une greffe de rein, de nombreux patients souffrent d&#39;effets indésirables à la suite de la procédure et doivent combattre ces effets pour le reste de leur vie. Ces difficultés montrent la nécessité grave pour le développement de nouveaux traitements pour soit prévenir les maladies du rein ou à augmenter peut-être la régénération des tissus 8,16,52,53. Compte tenu des limites éthiques évidentes de l&#39;utilisation de sujets humains dans les laboratoires biomédicaux, les modèles animaux sont essentiels pour l&#39;étude de la pathogenèse de la maladie humaine et pour les essais de nouveaux traitements. En raison de sa ressemblance anatomique et la proximité de l&#39;évolution, la souris est devenu le modèle le plus utilisé de la maladie humaine 45. Cependant, il ya certaines limites de cet animal, yment incapacité de visualiser le développement des organes in vivo et la praticité de remplir les écrans génétiques à grande échelle. Le poisson zèbre sont un organisme modèle pertinent et utile pour l&#39;étude du développement des organes et de la modélisation des maladies humaines 45,46. En ce qui concerne les maladies humaines, des homologues fonctionnels chez le poisson zèbre existent pour près de 70% de tous les gènes humains 54,55. Des travaux récents ont mis en évidence l&#39;utilité de poisson zèbre pour de nombreux domaines de 31,37,56 de recherche du rein. Études de régénération et de réparation chez le poisson zèbre après l&#39;IRA suggèrent que tubule épithéliale régénération et neonephrogenesis sont deux processus qui se produisent tout au long et se chevauchent la régénération timecourse 30,37. L&#39;utilisation d&#39;un aminoglycoside antibiotique appelé la gentamicine a été utilisé comme un paradigme de la blessure qui permet d&#39;étudier les résultats de l&#39;IRA en 29,30,37 poisson zèbre adulte. Au cours d&#39;une de deux semaines environ blessure période suivante de la gentamicine, la Tubul proximalees régénérer, et en attendant de nouveaux néphrons forment tout au long de l&#39;organe 29,30,37. En général, les mécanismes qui régulent la régénération épithéliale restent très controversée. Dans un mécanisme proposé du processus de réparation, il est l&#39;événement de blessure aiguë initiale suivie par une desquamation des cellules mortes dans la lumière. Ensuite, il existe une série de dé-différentiation, la prolifération, la migration et événements, après quoi de nouvelles cellules se différencient, repeupler la membrane basale lésé et à rétablir la fonction du site lésé. Alternativement, d&#39;autres études ont suggéré que les cellules de remplacement proviennent de cellules souches / progénitrices qui résident dans les tubules de néphrons. En ce qui concerne le processus de neonephrogenesis chez le poisson zèbre, les agrégats cellulaires ont été observés AKI suivante par injection de gentamicine 29,30. Ces agrégats maturité plus tard dans de nouveaux néphrons qui sondent en tubules 29,30 existants. Le fil conducteur qui unit néphron épithéliale régénération et neonephrogenesis est leur facteur de mystère pure: à l&#39;heure actuelle il ya exponentiellement plus de questions sur la façon dont ces exploits se produit une régénération qu&#39;il n&#39;y idées disponibles. À ce jour, cependant, plusieurs lignes intéressantes de données appuient l&#39;idée que la recherche de la régénération rénale en utilisant le poisson zèbre peut en effet fournir des indications pertinentes comparables en AKI humain qui peut aussi avoir directement translation potentiel 56-58. criblage de produits chimiques afin d&#39;identifier de petites molécules qui augmentent la prolifération des cellules souches rénales chez l&#39;embryon de poisson zèbre a récemment conduit à l&#39;identification de la -butanoate inhibiteur de l&#39;histone déacétylase de méthyl-4-(phénylthio) (m4PTB) 56,57. L&#39;administration de ce composé pour les larves de poisson zèbre avec AKI la gentamicine a révélé que la survie des larves augmente et que la prolifération tubulaire rénale a été renforcée 56,58. Lorsque les souris modérée AKI induite par l&#39;ischémie ont été traités avec m4PTB, leur récupération a été accélérée dans association avec une réduction à la fois et l&#39;atrophie tubulaire cycle cellulaire arrêt de la prolifération des cellules des tubules rénaux 58. Ces résultats suggèrent que les voies responsables pour le développement normal du poisson zèbre rénale et / ou la réponse régénérative à AKI seront conservées avec les mammifères 56. Ainsi, tandis que d&#39;autres études sont nécessaires pour démêler les mécanismes de régénération, à savoir d&#39;identifier les voies de signalisation qui sont impliqués et de comprendre leur interaction-le poisson zèbre offre une avenue prometteuse pour poursuivre cet objectif important dans le domaine de la néphrologie. Des outils tels que les étiquettes de cellules néphron décrites dans ce protocole constituent un groupe de tests qui peuvent être utilisés pour évaluer la composition rénale et la fonctionnalité des modèles AKI. En outre, ils peuvent être appliqués à caractériser des modèles transgéniques de la maladie rénale et peuvent fournir des moyens pour identifier les agents thérapeutiques chimiques capables de promouvoir la restauration de la structure de barrage après néphron rénalâge.

Le rein est un organe complexe qui remplit une multitude de fonctions physiologiques de l&#39;organisme. La principale fonction du rein est l&#39;excrétion des déchets métaboliques, et cette tâche est étroitement liée avec le maintien de l&#39;homéostasie fluide. Le rein effectue ces travaux en filtrant le sang et la formation de l&#39;urine, tout en régulant de façon concomitante la pression artérielle, les niveaux d&#39;électrolyte, et l&#39;équilibre acide-base. Tubules épithéliales hautement spécialisées appelées néphrons servent de l&#39;unité fonctionnelle de base du rein 1,2. Chez les vertébrés adultes, néphrons sont généralement organisés dans une disposition étroitement enroulé autour d&#39;un système de drainage centralisée, permettant ainsi de nombreux tubes pour emballer dans le assez petit orgue. Par exemple, chaque rein humain peut contenir plus de 1 million de néphrons 3. D&#39;autres mammifères comme la souris possèdent de l&#39;ordre de 8 à 10000 néphrons par rein 4. Le degré de complexité rénale diffère entre les mammifères et les autres vertebrates dues à des variations dans le nombre de néphrons totale et leur disposition architecturale dans le rein. espèces de vertébrés forment jusqu&#39;à trois structures rénales successives au cours du développement, et chaque formulaire affiche une complexité croissante à l&#39;égard de néphrons dotation et arrangement: les pronephros, mésonéphros, et metanephros. Le dernier bâtiment rénale doit être conservé sert de rein adulte organe, généralement un mésonéphros ou un metanephros 2. Chaque forme de rein, cependant, a une composition à base de néphrons-2. Le néphron est l&#39;outil de travail du rein et est responsable de la filtration du sang avec un métabolite de la sécrétion et la réabsorption. Néphrons sont des structures tubulaires simples composées de cellules épithéliales et avoir une organisation segmentaire, dans lequel discrets domaines hautement spécialisés, de l&#39;épithélium différenciés effectuer des tâches spécifiques. Dans l&#39;ordre de l&#39;écoulement du filtrat à travers le néphron, il ya généralement trois grandes parties qui COMPRISe chaque unité: (1) le corpuscule rénal, (2) un tubule proximal avec, intermédiaire, et segments distaux, et (3) un canal collecteur 1. Le tube proximal est responsable de la réabsorption de solutés organiques, et plus particulièrement du glucose et des acides aminés 1. Le tube intermédiaire (ou boucle de Henle) est un site majeur de sel et d&#39;eau réglementation 1. Enfin, réglage fin de sel et d&#39;autres ions se produit dans le tubule distal et le tube collecteur et est fortement régulée par le système endocrinien 1. A partir de là, le filtrat traverse l&#39;uretère et de la vessie, en fin de compte la sortie du corps comme un produit de déchets 1. La perte de la fonction rénale peut provenir d&#39;une multitude de causes qui empêchent l&#39;activité des néphrons normale. Ces causes peuvent se produire au cours du développement du rein, par exemple, des anomalies congénitales qui conduisent à la malformation de néphrons 5, ou des causes de différents types de dommages (provenant de l&#39;environnement à la fois génétique etorigines NTAL). Blessures acquises sont généralement classés comme des blessures rénale aiguë (IRA) ou de blessure rénale chronique (IRC). AKI implique une perte soudaine de la fonction rénale, souvent résultant d&#39;une ischémie ou d&#39;une toxine exposition 6,7. Chez les mammifères, la réparation de l&#39;épithélium des néphrons est possible après de telles blessures 8, et de nombreuses personnes présentent pleine restauration de la fonction rénale après l&#39;IRA. Cependant, AKI est également associée à une forte morbidité et la mortalité qui ont été signalés dans un large 30 - gamme de fréquence de 70% 6,7. CKD, en revanche, est associée à une perte progressive de la fonction rénale résultant de nombreuses années de dommages prolongée, généralement associée à une fibrose 8,9. En outre, une interaction existe entre AKI et CKD, soit comme on peut prédisposer un individu à l&#39;autre 10-12. Par exemple, ceux qui ont souffert de l&#39;insuffisance rénale aiguë sont plus sensibles à la maladie rénale chronique et même la mort 13. L&#39;incidence de la maladie rénale, à la fois aux États-Unis et dans le monde, a atteint épidéproportions micro et devrait augmenter que la population âgée augmente-donc il ya un besoin croissant d&#39;identifier les interventions de la médecine régénératrice pour le rein 14,15. Malgré la connaissance que patients atteints d&#39;IRA peuvent récupérer, il a longtemps pensé que le rein est un organe sans pouvoirs de régénération innées. Cette vision traditionnelle a été considérablement révisé au cours des dernières années 16. Des études portant sur ​​des lésions rénales chez les souris et les rats après l&#39;IRA ont montré que les cellules épithéliales des tubules des néphrons peuvent proliférer et reconstruire néphrons fonctionnels 17-20. Bien que les mammifères possèdent cette capacité d&#39;adaptation à régénérer néphrons, il ya des limites notables et des réponses inadaptées peuvent être déclenchées qui conduisent à la fibrose rénale et CKD 21. Par exemple, une étude récente a démontré que l&#39;ablation répétée des cellules épithéliales dans les néphrons murins a été associée à une diminution de la régénération et néphrons la fibrose rénale suggérant VHAea limitée seuil de régénération 22. Il n&#39;existe aucune preuve que l&#39;adulte rein de mammifère forme de nouvelles néphrons pour remplacer ceux perdus ou endommagés, ainsi leur destruction conduit à un déficit de 8,9 néphrons permanent. Fait intéressant, certains vertébrés ne répondent à AKI en régénérant néphron épithéliums et en produisant de nouvelles néphrons, un processus connu sous le neonephrogenesis ou néphron néogénèse 23. Neonephrogenesis se produit dans les poissons après exposition à des toxines ou résection partielle, et des modèles de blessures ont toujours inclus le poisson rouge 24,25, le tilapia 26, patin 27, médakas 28, et plus récemment, le poisson zèbre 29,30. Parmi ceux-ci, le poisson zèbre constituent un modèle de recherche génétique viable pour découvrir les voies cellulaires et moléculaires responsables de la régénération rénale. Dans cet article, vidéo, nous démontrons comment étiqueter les segments de néphrons chez le poisson zèbre adulte. Connaissance des néphrons anatomie, les caractéristiques moléculaires,et les caractéristiques fonctionnelles sont indispensables pour les études rénales futurs succès en utilisant le poisson zèbre. Le rein de poisson zèbre adulte est une structure de mésonéphros et est par nature moins complexe en termes de nombre de néphrons et de l&#39;organisation de la structure de metanephros chez les mammifères adultes, aviaires et reptiles 31. Cependant, le poisson-zèbre organisation segment de néphron est analogue pour les mammifères, et a été documentée dans le rein embryonnaire sur la base des études d&#39;expression génique 31-35. Néphrons d&#39;embryons de poisson zèbre contiennent des segments linéaires tubulaires qui incluent le tubule contourné proximal (PCT), tubule proximal droite (PST), distale tôt (DE), et distale retard (DL) 31-35 (Figure 1). Néphrons adultes poisson zèbre possèdent segments tubulaires similaires 30,31,36,37 (Figure 1). Le PCT peut également être identifié par un phénotype fonctionnel: les cellules épithéliales de la PCT seront incorporer des composés de dextrane marquées par fluorescence (10-70 kDa en taille) présents dans lecirculation, qui a été utilisé à la fois dans le poisson zèbre de rein embryonnaire et adulte afin d&#39;évaluer l&#39;absorption endocytique par les cellules du tubule proximal 38 à 41 (figure 1). Une différence dans les segments du néphron entre le poisson-zèbre et les mammifères, c&#39;est que le poisson-zèbre manquent un tube intermédiaire, ou l&#39;anse de Henle, 30-37; car le fonctionnement de ce secteur chez les mammifères d&#39;économiser l&#39;eau, et le poisson-zèbre est une espèce d&#39;eau douce sans l&#39;urgence de concentrer leur urine, il n&#39;est pas surprenant que le poisson-zèbre manque ce segment 32,33. Ainsi, la composition d&#39;ensemble du néphron est largement conservée entre le poisson zèbre et le rein des mammifères 32,33. Ces similitudes ont permis de poisson zèbre à être un outil de recherche efficace pour étudier les fonctions des gènes rénales exprimée pendant néphrogenèse développement 32-35,42 et de modéliser de nombreuses maladies rénales 43,44, ce qui ajoute à la liste substantielle de la situation des droits qui peuvent être étudiée en utilisantpoisson zèbre 45,46. Aujourd&#39;hui, le rein de poisson zèbre adulte est un modèle attractif pour les études comparatives de régénération rénale en raison de sa traçabilité génétique et le palais en éveil des ressources technologiques disponibles pour interroger la fonction des gènes et voies de signalisation dans cette espèce. Plusieurs études ont utilisé les mésonéphros poisson zèbre pour étudier les mécanismes de régénération après AKI 29,30,37. Pour la recherche AKI continué à utiliser le rein de poisson zèbre adulte, il est essentiel de disposer de méthodes exquis pour étiqueter les différentes régions et les méthodes néphrons pour étudier la fonctionnalité des néphrons. Plusieurs méthodes d&#39;analyse de rein adulte ont été adaptées à partir des protocoles de rein embryonnaire. L&#39;injection intrapéritonéale de dextran marqué par fluorescence dans le poisson zèbre adulte étiquettes l&#39;épithélium du PCT dans mésonéphros néphrons par endocytose 30, comme dans embryons de poisson zèbre 38-41 (Figure 1). Cette méthode a été utilisée pour visualize quand tubules proximaux à retrouver leurs biens résorber suivante AKI, qui permet à un évaluation de restaurer la fonction physiologique 30 (Figure 1). Une autre caractéristique du néphron tubule proximal est que les cellules epitheliales dans ce segment présentent une bordure en brosse 37 montre que des niveaux élevés de l&#39;activité phosphatase alcaline endogène. Ainsi, l&#39;épithélium proximale peut être localisé visuellement chez l&#39;adulte rein poisson zèbre en utilisant une technique basée sur la fluorescence connu comme Elf-(marqué par une enzyme de fluorescence) -97 47. Ici, nous décrivons comment effectuer fluorescentes essais d&#39;absorption de dextran 30,48 chez l&#39;adulte rein poisson zèbre, de façon à obtenir une évaluation fonctionnelle du tubule proximal et la carte de la taille et les contours de ce segment de tubule. Ensuite, nous décrivons les techniques d&#39;étiqueter les régions du tubule proximal du néphron adulte avec l&#39;étiquette fluorescente phosphatase alcaline. En troisième lieu, on montre pour la première fois que le Rhodamine-tagged lectine agglutinine de Dolichos biflorus (DBA), qui a été utilisé comme marqueur général des tubes collecteurs dans les reins des mammifères 49, marque les tubules distaux du rein adulte de poisson zèbre. En tant que DBA est mutuellement exclusif de coloration alcaline phosphatase, ces étiquettes offrent un moyen de distinguer large pan-proximale par rapport étendues pan-distale de l&#39;adulte néphron poisson zèbre. Tout au long de la mise en œuvre de ces colorants fluorescents à la fois toute la montagne et des coupes histologiques cryostat, nous corréler ces étiquettes avec des domaines d&#39;expression des gènes soluté de transporteurs qui identifient de façon unique chaque segment de néphrons. Par conséquent, ce protocole contient également un guide sur les procédures de traitement des tissus modifiés pour l&#39;ensemble de tissu adulte montage hybridation in situ (WISH) analyse dans la base de notre embryon protocole WISH 50. Ces procédures peuvent être utilisées dans diverses combinaisons (Figure 2) de documenter les attributs morphologiques et fonctionnelles of adultes néphrons rénaux poisson zèbre. Ainsi, ces protocoles peuvent être appliqués à des études de régénération, la caractérisation phénotypique des autres modèles de maladie rénale, et encore utilisés pour étudier la formation de rein adulte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

Le modèle de poisson zèbre a émergé comme un système pertinent pour étudier le développement du rein, de la régénération et de la maladie. Les deux reins embryonnaires et adultes poisson zèbre sont composés d&#39;unités fonctionnelles appelées néphrons, qui sont hautement conservées avec d&#39;autres vertébrés, y compris les mammifères. La recherche dans le poisson-zèbre a récemment démontré que deux phénomènes distincts transpirent après néphrons adultes encourent des dégâts: d&#39;abord, il ya la régénération robuste dans néphrons existants qui remplace les cellules épithéliales des tubules détruits; deuxième, entièrement nouveaux néphrons sont produites à partir de progéniteurs rénaux dans un processus connu sous le nom neonephrogenesis. En revanche, les humains et d&#39;autres mammifères semblent avoir seulement une capacité limitée pour la régénération de l&#39;épithélium des néphrons. À ce jour, les mécanismes responsables de ces phénomènes rein de régénération restent mal compris. Depuis reins poisson zèbre adultes subissent à la fois néphron épithéliale régénération et neonephrogenesis, ils fournissent un para expérimentale exceptionnelleparadigme pour étudier ces événements. En outre, il existe un large éventail d&#39;outils pharmacologiques et génétiques disponibles dans le modèle de poisson zèbre qui peuvent être utilisés pour délimiter les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent la régénération rénale. Un aspect essentiel de cette recherche est l&#39;évaluation de la structure et la fonction des néphrons. Ce protocole décrit un ensemble de techniques de marquage qui peuvent être utilisés pour évaluer la composition du rein et de la fonctionnalité du néphron de test dans le rein adulte de poisson zèbre. Ainsi, ces méthodes sont largement applicables à l&#39;avenir la caractérisation phénotypique des adultes poisson zèbre paradigmes de lésions rénales, qui comprennent, mais ne sont pas limités à, des régimes d&#39;exposition nephrotoxicant ou des méthodes génétiques de la mort cellulaire ciblée comme la technique d&#39;ablation de cellules nitroreductase médiation. En outre, ces méthodes pourraient être utilisées pour étudier les perturbations génétiques dans la formation du rein adulte et pourraient également être appliquées pour évaluer la fonction rénale lors de la modélisation des maladies chroniques.

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Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Le rein adulte poisson zèbre est un excellent système pour les études de régénération et de maladies rénales. Un aspect essentiel de cette recherche est l&#39;évaluation de la structure et la fonction des néphrons. Ce protocole décrit plusieurs méthodes qui peuvent être mises en œuvre pour évaluer la composition néphrons des tubules et d&#39;évaluer la réabsorption rénale.

Analyse de néphron Composition et fonction du rein poisson zèbre adulte

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

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Research

JoVE Journal

Biology

43.7K vues.  University of Notre Dame.  Le rein adulte poisson zèbre est un excellent système pour les études de régénération et de maladies rénales. Un aspect essentiel de cette recherche est l'évaluation de la structure et la fonction des néphrons. Ce protocole décrit plusieurs méthodes qui peuvent être mises en œuvre pour évaluer la composition néphrons des tubules et d'évaluer la réabsorption rénale. 

Vidéo: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

La transplantation de moelle rein entier chez le poisson zèbre pour adultes

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Recherche

Biologie

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection d&#39;organes sur le poisson zèbre pour adultes

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Injection intrapéritonéale en Zebrafish adultes

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

La transplantation de cellules directement dans le rein de poisson zèbre adulte

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection du rein Zebrafish adultes

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la régénération des adultes Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

Collecte de sang pour analyse biochimique chez le poisson zèbre adulte

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavage poisson zèbre pour adultes

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Évaluation de poisson zèbre fonction rénale utilisant une habilitation immunofluorescence

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...