Tous les auteurs reconnaissent le soutien du NHMRC CTC, Université de Sydney, la Fondation de recherche sur le diabète juvénile (FRDJ), l&#39;Australie et la Fondation Rebecca Cooper, l&#39;Australie infrastructure. Cette recherche a été financée par des subventions du Conseil australien de la recherche (FT110100254) et la FRDJ, Australie (CRN201314) pour AAH WW, RJF et MVJ effectuée tous laboratoire humide expérimentation, ASJ effectué l&#39;analyse des données. WW a écrit la première ébauche. AAH prévu l&#39;étude et analysé les données. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale du manuscrit, des chiffres et des feuilles de travail soumis pour publication.

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease.">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. 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V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+of+developing+and+regenerating+pancreas+reveal+post-transcriptional+regulation+of+neurogenin3.">MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3.</a> Dev Biol. 311, 603-612 (2007).</li><li>Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum.">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Exp Diabetes Res. 2012, 168368 (2012).</li><li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA.">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).</li><li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li></ol>

Article coûts de transformation / de publication ont été couverts par Life Technologies, après acceptation de ce manuscrit pour publication.

Les étapes critiques dans les protocoles de qPCR basée sonde à obtenir des résultats précis et reproductibles pour se assurer 1) le même volume et la concentration de RT-produit est chargé dans chaque réaction qPCR, 2) les rapports et les volumes corrects des composants nécessaires pour réaction qPCR sont préparés et bien mélangé, 3) les volumes corrects et cohérents sont ajoutés à chaque réaction qPCR, et 4) la préparation et le chargement de chaque échantillon et mélange réactionnel est terminée dans le plus court laps de temps possible, tout en conscient de les étapes critiques ci-dessus mentionnés plus tôt. Les cartes de réseau microfluidique besoin centrifugeuse appropriée et seaux spécifiques. Chaque godet peut contenir jusqu&#39;à trois cartes (chargé / vide). Toujours se assurer que tous les trois fentes d&#39;un seau sont occupés et le seau est équilibré en plaçant seau similaire (ce seau devrait également contenir trois cartes, soit vides ou pleines) dans la fente en face de la centrifugeuse. En plaçant la carte dans le Buckeporte-t, assurez-vous que les huit réservoirs projettent vers le haut et puits de réaction face à la paroi extérieure de la centrifugeuse. Faites tourner les cartes à 331 g pendant 1 min à température ambiante. Après la première centrifugation, ouvrir la centrifugeuse et se assurer visuellement le mélange de réaction a été distribué à travers les 384 puits. Répétez le spin au mêmes paramètres pour une fois de plus. Retirez la carte de seau et se assurer que le niveau de mélange réactionnel dans chacun des huit réservoirs est uniforme. Les incohérences dans les volumes de liquide dans les réservoirs gauche font la carte inapproprié d&#39;utiliser davantage. Pour avoir la même concentration de la RT-produit, même concentration d&#39;entrée de l&#39;ARN est ajoutée dans chaque réaction RT. La concentration d&#39;ARN total est mesuré en utilisant un micro-volumespectrophotometer. Le ratio observé 260/280 peut être aussi faible que 1,3 pour l&#39;ARN isolé à partir de plasma / sérum; cela ne semble pas avoir un effet sur ​​le processus ou les données liées qPCR-aval généré 30. De même, le rapport de 260/280les échantillons d&#39;ARN testés ici sont entre 1.3 à 1.7 sans effets anormaux dans le qPCR observés. Lors de l&#39;utilisation des échantillons à faible teneur d&#39;ARN, tels que ceux de fluides biologiques, il peut être difficile de quantifier l&#39;ARN avant le traitement. Nous recommandons l&#39;utilisation du synthétique pic-in à l&#39;isolement de l&#39;ARN ainsi que les étapes de transcription inverse. Dans notre expérience, les candidats Arabidopsis thaliana (miARN miR-ath-159a et ath-miR-172a) sont préférés Caenorhabditis elegans miARN (tels que cel-miR-39 ou cel-miR-54), qui, dans notre expérience peut avoir plus homologie que ceux de A. thaliana. L&#39;utilisation de tels spécifique du stade pic-in peut tenir compte de la normalisation des données miRNA sur plusieurs échantillons analysés à différents moments. L&#39;utilisation d&#39;un volume d&#39;entrée fixe de l&#39;ARN pour la réaction de synthèse d&#39;ADNc est également recommandé 32,33. Les trois protocoles basés sonde-miARN pour la quantification décrites ici nécessitent des quantités variablesde l&#39;entrée de l&#39;ARN total, différents flux de travail et les coûts. Chacun des flux de travail sont conçus pour répondre à différents débits basés sur le nombre de cibles miARN et le nombre d&#39;échantillons à analyser. Avec l&#39;augmentation de débit (96 RXN 384 RXN 3072 RXN), le coût par réaction diminue avec une augmentation de la quantité de données obtenues au cours d&#39;une unité de temps. Étant donné que toutes ces plates-formes utilisent chimie TaqMan, la qualité des données obtenues peut se attendre à être similaires. TaqMan qPCR est une méthode bien établie pour identifier l&#39;abondance des miARN dans les échantillons de sérum / plasma 9,11,27. Bien que les trois plates-formes discutées ici ont la même composition chimique, une diminution dans le volume de réaction conduit à une diminution de la gamme dynamique de détection de transcription (RJ Farr et al., Données non publiées). Le 96 puits plateforme qPCR est un débit plus faible, mais la plate-forme de haute sensibilité et à notre avis, le «gold standard» pour toutes les plateformes de PCR (ou colorant à base de) basée sonde. Cependant, cela peutne pas être la plate-forme la plus économique ni efficace si plusieurs centaines ou milliers d&#39;échantillons sont analysés et pour plusieurs microARN. Microfluidique (TLDA) et nanofluidique (OA) plates-formes sont des plates-formes à haut débit / contenu conçus pour permettre l&#39;acquisition de données plus grands dans un temps plus court. Bien que les différences de lots ont été observés dans les cartes TLDA, ce peut être minimisée en demandant TLDA cartes du même lot. Nous observons que la plate-forme TLDA (figure 3) montré une variation significative dans 17% des mi - miARN de faible abondance lorsqu&#39;il est testé en utilisant le même échantillon sur différents lots de cartes TLDA. Nous vous recommandons donc d&#39;utiliser les mêmes numéros de lot pour l&#39;analyse en utilisant des cartes TLDA. Cette variation pourrait aussi être due à la variabilité technique, y compris des erreurs de chargement et de pipetage. Cependant, nous conseillons de commander / demandant le même lot de cartes TLDA. Aucune variation significative n&#39;a été observée lot sur la plate-forme de l&#39;arthrose. Malgré cela, TaqMan expéri basetal qPCR approches offrent facilité pour mesurer l&#39;abondance des miARN dans les échantillons de plasma / sérum. Les approches de débit faible, moyenne et haute discutés ici offrent la flexibilité d&#39;analyser une série d&#39;échantillons et miARN l&#39;aide d&#39;un (faible bruit de fond) la chimie hautement efficace, reproductible et propre.

Les microARN (miARN) sont ~ 22 nucléotides non codante (NC) ARN, fonctionnant comme régulateurs de l&#39;expression du gène 1-3. La plupart des miARN chez les animaux fonctionnent par appariement de bases spécifique de séquence avec un ARNm, ciblant l&#39;extrémité 3 &#39;UTR, ce qui conduit à une régulation négative de l&#39;expression de gène 2-4. Cela se produit généralement par l&#39;intermédiaire de l&#39;inhibition de la traduction de l&#39;ARNm ou en ribosomique de débarquement. miARN en circulation se sont révélés être de nouveaux biomarqueurs dans la recherche et les domaines cliniques pour une variété de maladies telles que le diabète, 7.5, 8 ovaire, de la prostate et cancer du sein 9 10,11, 12 l&#39;hépatite B et d&#39;autres 13 maladies auto-immunes. Des recherches ont été menées pour identifier les miRNAs abondantes dans différentes cellules ou des tissus, ainsi que dans la circulation du plasma humain et des échantillons de sérum, ce qui est plus accessible et moins invasive 9,11-15. Différentes méthodes de quantification miARN ont été eréé en utilisant de multiples plates-formes, telles que la plate-forme de plaque standard 96 puits 4,12,16-18, la plate-forme de carte microfluidique 12,18-23 et la plate-forme de tableau 17,24 nanofluidique. Quantitative PCR en temps réel (qPCR) offre la possibilité de mesurer les nombres relatifs ou absolus de transcriptions utilisant multiple (teinturerie ou à base de sonde-chimiques). La chimie PCR en temps réel basée sur une sonde offre l&#39;avantage d&#39;une faible fluorescence de fond et une haute sensibilité pour détecter un seul exemplaire de la transcription. Il est relativement rentable, simple à utiliser et hautement reproductible, ce qui en fait une méthode privilégiée pour quantifier et déterminer miRNA expression 25. Méthode qPCR base-Probe implique généralement deux étapes: la transcription (RT) et qPCR 4,26,27 inverser. RT est l&#39;endroit où l&#39;amorce tige-boucle RT est hybridée à une molécule miARN mature ou primaire et convertie en (c) un ADN complémentaire. La quantification du produit de l&#39;ADNc est ensuite effectuée en utilisant des amorces de PCR spécifiques miARN26-28. Le principe de la PCR quantitative à base de sonde est basée sur la détection de l&#39;extension du brin complémentaire en temps réel, ce qui implique l&#39;hydrolyse de la sonde marqués par fluorescence. Ces sondes sont conçues pour contenir un rapporteur fluorescent et un extincteur qui sont tout autre pour permettre FRET (de Fluorescence Resonance Energy Transfer). La détection de l&#39;émission de la fluorescence rapporteur (émetteur) est masquée par la proximité de la molécule d&#39;agent d&#39;extinction. Lorsque la Taq polymerase (pol) se étend à partir de l&#39;amorce amont et atteint une fourche (de l&#39;extrémité 5 &#39;de la sonde), l&#39;activité pol d&#39;exonucléase de la Taq hydrolyse de la sonde, ce qui conduit à une dissociation / séparation physique de l&#39;émetteur fluorescent à partir de l&#39;extincteur. Cette version d&#39;une seule molécule de la fluorescence émetteur est enregistré par le détecteur et présenté comme une augmentation progressive du signal de fluorescence de ce puits / réaction. L&#39;augmentation de la fluorescence est proportionnelle à la quantité de produit de PCR généré, ce qui permet une précision qu26,28 antification de la cible amplifiée. Avec l&#39;augmentation de la demande dans miRNA quantification, à moyen et à des technologies à haut débit ont été développés pour permettre à un plus grand nombre d&#39;échantillons à traiter dans un court laps de temps. TaqMan Low Density Array (TLDA) est un débit moyen de conception innovante basée sur microfluidique à base de sonde-qPCR chimie offrant une augmentation du nombre de miARN analysés sur une plaque. TLDA impliquent l&#39;utilisation d&#39;un pool prédéfini de RT-amorces qui sont utilisées pour synthétiser l&#39;ADNc. Ces ADNc sont ensuite filées en une carte personnalisée 384 et micro-fluidique pour déterminer l&#39;expression de plusieurs miARN utilisant qPCR 22,26,29. Chaque puits de la carte contient séché amorces et des sondes pour amplifier miARN (s) spécifique, donc à 384 réactions peuvent être transformés dans la carte unique TLDA 26. La matrice de nanofluidique est une plate-forme à haut débit qui est utilisé pour la détection de produits de transcription de gènes <sup&gt; 24 en utilisant la même chimie du sonde. Il utilise une matrice exclusive offrant interactions hydrophobes hydrophile pour faciliter le chargement facile du mélange de réaction 33 en nanolitres en un tableau de 3072 trous traversants sur une lame en acier inoxydable 24. Cet article se concentre sur la démonstration de la façon dont ces méthodes pour quantifier miARN dans le sérum / plasma sont effectuées et les facteurs critiques qui doivent être considérés lors de l&#39;exécution et l&#39;interprétation de ces données. Prises pour compte, leurs avantages et leurs limites individuelles seront discutés dans cet article.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well-platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4427975</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 
			The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4366597 or 4366596</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 
			The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For qPCR run on a 96-well platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4367846</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 
			The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on&#160; the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346907</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics platform (TLDA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399966</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444281</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444750</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 
			The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4391128 or 4488593</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 
			The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444303</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399233</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE Buffer (100 mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090-015</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 
			The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444913</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4470187</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4469576</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray 384-well Sample Plates&#160;&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4406947</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4462159</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray AccuFill System Tips&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4457246</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129117</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas

PCR quantitative basée-Probe (qPCR) est une méthode privilégiée pour mesurer l&#39;abondance des transcrits, puisque ce est l&#39;une des méthodes de détection les plus sensibles qui fournit une analyse précise et reproductible. La chimie à base de sonde offre le moins de fluorescence d&#39;arrière-plan par rapport aux autres chimies (à base de colorants). Actuellement, il existe plusieurs plates-formes disponibles que la chimie basée sur une sonde d&#39;utilisation pour quantifier l&#39;abondance des transcrits. qPCR dans une plaque de 96 puits est la méthode la plus couramment utilisée, mais seulement un maximum de 96 échantillons ou miARN peut être testée en un seul passage. Ce est fastidieux et pénible si un grand nombre d&#39;échantillons / miRNAs sont à analyser. Plateformes sonde haut-débit tels que la microfluidique (par exemple TaqMan tableau Card) et des tableaux de nanofluidique (par exemple OpenArray) offre de facilité de détecter de façon reproductible et efficacement l&#39;abondance de plusieurs microARN dans un grand nombre d&#39;échantillons en peu de temps. Ici, nous démontrons le dispositif expérimental d&#39;unee protocole pour la quantification de miARN échantillons de sérum ou plasma EDTA, en utilisant la chimie à base de sonde et de trois plates-formes différentes (plaque de 96 puits, la microfluidique et les tableaux de nanofluidique) offrant des niveaux croissants de débit.

Le volume recommandé pour une réaction qPCR de dosage à base de sonde miARN est de 20 pi. REMARQUE: Nous avons confirmé que un volume réactionnel de 5 ul est capable de produire des résultats similaires à ceux obtenus en utilisant 20 ul de volume 4,7,30. L&#39;abaissement du volume de réaction de 5 ul permet une diminution de 75% dans les coûts de réactifs sans perte appréciable de la sensibilité. Comme présenté sur la figure 2, les volumes de réaction de 20 ul et 5 ul montrent une corrélation forte jusqu&#39;à 39 cycles (avec R 2 de 0,92, p = 0,0002). réseau de microfluidique fournit un outil pour obtenir des données sur 754 miARN exprimés dans un échantillon d&#39;environ 5 heures (pour carte A et B carte), qui est un moyen plus efficace d&#39;analyser de multiples échantillons par rapport aux classiques 96 PCR de la plaque ainsi. Nous avons comparé miRNA cartes du tableau de la microfluidique pour le même échantillon (échantillon A et de l&#39;échantillon A répétition) Figure 3A -. B montre un graphique de Bland-Altman (&lt;strong&gt; 3A) et l&#39;intrigue de corrélation (3B) pour tous les 754 miARN testés pour ces échantillons. Il ya trois miARN de contrôle différents (U6, RNU44 et RNU48) placés au hasard sur les deux cartes (carte A et B) dans de multiples endroits. Lorsque le seuil de cycle de U6 (CT) valeurs sont comparées entre les deux courses, nous ne avons pas observé de différences significatives entre les valeurs (tableau 4). Il est également important de noter ici que U6 est exprimé à plus grande abondance (valeur inférieure Ct) dans l&#39;échantillon évalué. Nous avons ensuite comparé les miARN qui ont des valeurs Ct entre 0 à 19,99 dans les deux pistes (n = 150), qui avait expression similaire des miARN globale avec un coefficient de détermination de 98% (figure 3C-D). De tous les 277 miARN qui ont des valeurs Ct entre 20 et 29,99 dans les deux pistes, 16 Mirs différaient significativement entre les pistes originales et les reprises (Figure 3E - F) Le nombre de miARN avec différence significative betwee.n les pistes ont augmenté (89 sur 327) lorsque les valeurs de Ct ont été sélectionnés entre 30-40 pour les deux courses (Figure 3G - H). La plate-forme nanofluidique tableau fournit des données pour 754 miARN de chaque échantillon sérum / plasma testées, comme représenté sur la figure 4A Il est important d&#39;examiner ces courbes d&#39;amplification -. Comme il est avec tous qPCR - pour se assurer que le résultat est révélateur d&#39;une véritable amplification. Chacun des 48 sous-réseaux (Figure 1) contient également un test pour les trois &quot;ménage&quot; ncRNAs plus populaires:. U6, RNU44 et RNU48 figure 4B illustre un regroupement typique de U6 reproduit à partir d&#39;un seul échantillon. Ces répétitions affichent faible déviation standard (SD &lt;0,5) et sont donc un indicateur de la fiabilité. Alternativement, la figure 4C montre la variabilité accrue des répétitions de U6 (SD&gt; 0,5) dans un second échantillon. Ce ne nie pas la validité of les essais restants, bien qu&#39;il ne nécessite une critique plus approfondie. U6, comme avec la plupart miARN &quot;d&#39;entretien&quot; dans les liquides biologiques, peut avoir une expression variable. Il convient de noter que l&#39;un des échantillons, décrites dans la figure 4C, affiche quatre fois moins de contenu U6 que celle présentée dans la figure 4B. Puisque le niveau de U6 dans l&#39;échantillon présenté dans 4C est 75% de moins pour commencer que celui présenté dans le panneau 4B, une plus grande variabilité technique est prévu en raison de la distribution de Poisson des transcriptions, qui est exacerbé par le faible volume de réaction 17. Un autre outil utile est les images de contrôle de la qualité (CQ), disponibles à l&#39;exportation une fois la course terminée. Une sélection de ceux-ci utilise la fluorescence du ROX, le colorant passif trouvé dans le mélange de réactifs qPCR, pour confirmer que chaque trou de passage a été chargé correctement (figure 5). Un trou de passage, voire une salle<html> pneu sous-réseau, ne peut pas charger en raison du volume d&#39;échantillon insuffisant, l&#39;évaporation, des bulles présentes dans les puits de la plaque de l&#39;échantillon de 384 puits, le défaut de supprimer complètement le joint de la plaque de l&#39;échantillon, ou des défauts dans le système Accufill ou de ses conseils. Toute déchargés trous traversants doivent être identifiés afin d&#39;éviter miARN d&#39;étiquetage «indétectable», alors qu&#39;en réalité, le test n&#39;a jamais été chargé. Si ce problème est rencontré, confirmer que au moins 5 pi de l&#39;échantillon / mastermix est chargé dans chaque puits de la plaque de l&#39;échantillon de 384 puits, la plaque d&#39;échantillon est correctement centrifugé avant le chargement, le papier d&#39;aluminium est complètement enlevée, et l&#39;OpenArray chargé diapositive est scellé et exécuté dans le délai imparti pour tous les essais successifs. Si des problèmes de chargement persistent, ils peuvent être plus susceptibles relatives à lot spécifique ou un lot des tableaux ou des consommables connexes et obtenir de l&#39;aide devrait être recherchée par le fabricant. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1: Disposition des échantillons pour le tableau flux Nanofluidique: (A) Chaque plaque d&#39;échantillon 384 puits peut contenir des échantillons jusqu&#39;à huit tableaux de nanofluidique. (B) Dilué, ADNc pré-amplifiée est placé dans huit puits (2 colonnes par quatre lignes), avec piscine A et le groupe B en groupes de 8 puits adjacents. Chaque cercle représente un puits. (C) Chaque puits de la plaque de l&#39;échantillon sera chargé dans un sous-réseau de la matrice de nanofluidique. Chaque petit carré représente une sous-tableau. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> Figure 2: L&#39;analyse des co-relation pour les plateformes classiques 96 puits PCR: Co-relation entre 20 pi et 5 volumes de réaction de pi sur TaqMan en temps réel qPCR utilisant une plate-forme de plaque standard 96 puits dans les valeurs CT (39 cycles). Nous avons comparé quatre différents microARN (miR-375, miR-30c, miR-30d et miR-7) dans quatre échantillons différents de sérum et de plasma humains. Seuls les 11 points de données sont tracés puisque les autres étaient indétectables. R 2 = 0,92, p = 0,0002. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . Figure 3: circulation miRNA profilage à l&#39;aide de cartes microfluidique tableau en utilisant deux cartes microfluidiques (carte-A et de la carte-B), un profil de 754 miARN est généré (A - B). Comme le montre ici, nous avons utilisé même échantillon pour deux tableau microfluidique exécute pour vérifier la reproductibilité des résultats de cartes de la microfluidique. Nous avons observé une expression similaire des miARN dans l&#39;ensemble, avec des valeurs Ct entre 0 à 19,99 (C - D). Il ya peu de miARN (16 de 277) avec les valeurs de Ct entre 20 à 29,99 et significatives différences entre répétition pistes (E - F). Quatre-vingt neuf des 327microARN avec les valeurs de Ct plus élevés (30 à 40) présentaient des différences significatives entre les deux manches (G - H). &#160; Les données sont analysées en utilisant le test t apparié. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> Figure 4: Profil des courbes représentant l&#39;amplification par PCR produit: est une figure représentative des courbes (A) d&#39;amplification combinés de toutes les cibles miARN pour un échantillon de plasma humain. Un dosage de U6 (un contrôle commun ARNnc) est placé dans chaque sous-réseau. L&#39;échantillon en (B) présente une faible variabilité (SD &lt;0,5), tandis que (C) montre écart-type élevé (SD&gt; 0,5) dans U6 réplique. Les deux échantillons sont total ARN isolé à partir de plasma humain. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> Figure 5: Analyse des Nanofluidique QC tableaux: contrôle de la qualité (CQ) des images d&#39;un tableau nanofluidique chargé correctement (à gauche) et un tableau nanofluidique mal chargé (à droite). Le colorant passif, ROX (présent dans le mélange de réactifs qPCR), émet une fluorescence à indiquer un trou traversant correctement chargé. Le tableau sur la droite dispose de plusieurs sous-réseaux / trous traversants qui ne sont pas chargées avec le mélange de réactifs qPCR et ceux-ci doivent être identifiés comme des réactions PCR faussement négatifs. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Composants </td><td> Volume réactionnel par 5 ul (ul) </td></tr&gt; <tr><td> Tampon RT (10x) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> dNTP (100 mM) </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Inhibiteur RNase </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> L&#39;eau sans nucléase </td><td> 1,39 </td></tr><tr><td> Transcriptase inverse </td><td> 0,33 </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 2,33 </td></tr></tbody></table> Tableau 1A: RT composants de mélange réactif dans un 5 pi RT préparation de réaction pour TaqMan en temps réel qPCR utilisant une plate-forme de plaque de 96 puits standard. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Composants </td><td> Volume réactionnel par 5 ul (ul) </td><td> Volume par réaction 20 ul (ul) </td></tr><tr><td> Mastermix PCR rapide (2x) </td><td> 2,5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Dosage TaqMan PCR quantitative (20x) * </td><td> 0,25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Sans nucléaseeau </td><td> 1,45 </td><td> 5,8 </td></tr><tr><td> Volume total: </td><td> 4.2 </td><td> 16,8 </td></tr></tbody></table> * Composant de dosage basé sur le miRNA choisi testé. Tableau 1B: qPCR composants de mélange réactif dans un 5 ou 20 ul qPCR préparation de réaction pour TaqMan en temps réel qPCR utilisant une plate-forme de plaque de 96 puits standard. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Composants </td><td> Volume par réaction (ul) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primaires (10x) </td><td> 0,8 </td></tr><tr><td> dNTP avec dTTP (100 mM) </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> MultiScribe la transcriptase inverse (50 U / ul) </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0,8 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0,9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor &amp; #<html> 160; (20 U / ul) </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tableau 2A: RT composants de mélange réactif dans un 5 pi RT préparation de réaction pour le panneau TLDA miARN. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Composants </td><td> Volume par réaction (ul) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12,5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primaires (10x) </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> L&#39;eau sans nucléase </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 22,5 </td></tr></tbody></table> Tableau 2B: PreAmp composants de mélange réactif dans une préparation de réaction 25 pi pré-amplification pour le panneau TLDA miARN. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Composants </td><td> Volume par réaction (ul) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primaires (10x) </td><td> 0,75 </td></tr><tr><td> dNTP avec dTTP (100 mM) </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> MultiScribe la transcriptase inverse (50 U / ul) </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0,75 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0,9 </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la RNase (20 U / ul) </td><td> 0,09 </td></tr><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> 0,35 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tableau 3A: RT composants de mélange réactif dans un 5 pi RT préparation de réaction pour le panneau nanofluidique miARN basé sonde. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Composants </td><td> Volume par réaction (ul) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12,5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primaires (10x) </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> L&#39;eau sans nucléase </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 22,5 </td></tr></tbody></table> Tableau 3B:. PreAmp composants réactifs de mélange dans une préparation de réaction 25 pi pré-amplification pour le panneau nanofluidique miARN base de sonde REMARQUE: Le complémentaire interactive feuilles de calcul Excel fournies pour les trois plates-formes, représente déjà l&#39;ajout de 5% afin de compenser pour le pipetage erreur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Échantillon A </td><td> Exemple Une répétition </td></tr><tr><td> 15,535 </td><td> 16,156 </td></tr><tr><td> 15,471 </td><td> 15,652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16,063 </td></tr><tr><td> 15,963 </td><td> 15,889 </td></tr><tr><td> 14,006 </td><td> 13,993 </td></tr><tr><td> 14,502 </td><td> 14,623 </td></tr><tr><td> 14,907 </td><td> 14,384 </td></tr><tr><td> 13,732 </td><td> 14,946 </td></tr></tbody></table> Tableau 4: circulation miRNA profilage U6 microfluidique carte de tableau. L&#39;utilisation de deux cartes de réseau microfluidique (A et B). Les valeurs Ct de miARN de commande de U6 de l&#39;échantillon A (total = 8). Contrôle de U6 Conformément miRNA abondance observée entre les pistes.

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Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

MicroARN qui circulent ont récemment émergé comme biomarqueurs prometteurs et novateurs en vue de divers cancers et d&#39;autres maladies. Le but de cet article est de discuter de trois plateformes de PCR différents basés sonde en temps réel et les méthodes qui sont disponibles pour quantifier et déterminer l&#39;abondance des microARN circulation.

PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

probe-based-real-time-pcr-approaches-for-quantitative-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

33.0K vues.  The University of Sydney.  MicroARN qui circulent ont récemment émergé comme biomarqueurs prometteurs et novateurs en vue de divers cancers et d'autres maladies. Le but de cet article est de discuter de trois plateformes de PCR différents basés sonde en temps réel et les méthodes qui sont disponibles pour quantifier et déterminer l'abondance des microARN circulation. 

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Experimental Approaches to Tissue Engineering

Approches expérimentales pour le génie tissulaire

Recherche

Biologie

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analyse de l&#39;expression génique dans l&#39;agrile du frêne ( Agrilus planipennis) En utilisant quantitative en temps réel-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Détermination des profils d&#39;expression génétique dans les C. elegans Utilisation microréseaux et PCR en temps réel

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET microscopie pour Surveillance en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant Biocapteurs unimoléculaires

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Quantitative, en temps réel Analyse de l&#39;activité de réparation par excision de base dans les lysats cellulaires Utilisant des lésions spécifiques Beacons moléculaires

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Cellules de mammifères autonome bioluminescentes pour la surveillance continue et en temps réel de la cytotoxicité

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...