Nous avons développé un protocole défini, reproductible et de longue date pour le séquençage de petits ARN et pour l’analyse des lectures normalisées à l’aide d’outils bioinformatiques opensource. Les principaux avantages de notre stratégie sont qu’elle recueille avec précision les microARN par purification de gel et que l’analyse bioinformatique peut être appliquée indépendamment de la façon dont les microARN sont collectées. Le séquençage à haut débit des microARN peut révéler un aperçu des mécanismes de la maladie, du traitement des microARN et de la quantification précise des approches de thérapie génique qui fournissent de petits ARN.
Assurez-vous de travailler dans un environnement exempt de RNase et de garder tous les produits ARN sur la glace tout au long de la procédure. La visualisation des étapes de coupe du gel aidera les téléspectateurs à identifier la taille correcte des produits nécessaires pour les applications en aval. Pour trois ligatures d’adaptateurs de premier plan, combinez 11 microlitres d’ARN avec 1,5 microlitres de tampon de réaction de ligase 10X T4RNA libre de l’ATP, un microlitre de polyéthylène glycol et 0,5 microlitres de trois maillons principaux.
Chauffer les échantillons à 95 degrés Celsius sur un thermocycleur pendant 30 à 40 secondes, puis les refroidir sur la glace pendant une minute. Ajouter un microlitre de ligase T4RNA deux et incuber la réaction à température ambiante pendant deux heures. Pendant que les échantillons couvent, versez un gel polyacyrilamide de 15 % entre 0,8 millimètre de plaques de verre séparées dans un plâtre en plastique et insérez un peigne.
Lorsque le gel s’est solidifié, ajouter 0,5 5 X TBE au réservoir et pipette vigoureusement pour laver les puits d’urée résiduelle. Après avoir pré-couru le gel de polyacrylamide pendant 25 minutes à 375 volts, chargez les échantillons en laissant au moins une voie entre chaque échantillon. Chargez 20 microlitres d’au moins deux ensembles de marqueurs dans un modèle asymétrique pour garder une trace de l’orientation du gel et faire fonctionner le gel à une constante 375 volts.
Après 15 minutes, augmenter à une constante 425 volts pour le reste de la course et faire fonctionner le gel pendant environ deux heures. À la fin de la course, utilisez un séparateur de plaque pour enlever le gel des plaques de verre et placer le gel sur un protecteur de page en plastique. Diluer cinq microlitres de bromure d’éthidium dans 500 microlitres d’eau distillée et ajouter le colorant sur les voies marqueurs juste au-dessus du marqueur bleu clair supérieur.
Ensuite, utilisez une lame de rasoir propre pour couper les gels du marqueur supérieur au marqueur inférieur dans chaque voie sous la lumière ultraviolette et transférer les morceaux à un carré de quatre par quatre centimètres de film d’étanchéité de laboratoire. Couper le gel avec environ trois coupes horizontalement et deux coupes verticalement pour produire 12 petits carrés. Ajouter 400 microlitres de chlorure de sodium molaire de 0,3 molaire sur le film d’étanchéité et guider les morceaux de gel dans des tubes siliconés de 1,5 millilitre.
Agiter les échantillons sur un nutator à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, transférez 400 microlitres de chaque supernatant dans de nouveaux tubes. Ajouter un millilitre de 100% d’éthanol et un microlitre de 15 milligrammes par millilitre glycogène co-précipitant par tube.
Ensuite, conservez les tubes à moins 80 degrés Celsius pendant une heure. Pour cinq ligatures linker premier, d’abord tourner vers le bas les échantillons décongelés et resuspendre les granulés dans l’eau. Ensuite, ajoutez 0,5 microlitres de 100 micromolaires cinq linker principaux, un microlitre de tampon ligase T4RNA, un microlitre de 10 millimillons ATP, et un microlitre de polyéthylène glycol à chaque échantillon.
Chauffer les réactions à 90 degrés Celsius pendant 30 secondes avant de les placer sur la glace. Ajouter ensuite un microlitre de ligase T4RNA à chaque tube et incuber les réactions à température ambiante pendant deux heures. Pour la transcription inverse, recueillir les échantillons par centrifugation et réutiliser la pastille séchée à l’air dans 8,25 microlitres d’eau sans nucléase.
Ajoutez 0,5 microlitres de 100 amorces de transcriptase inverse micromolaire et cinq microlitres de mélange de réaction de transcriptase inverse de 2X à partir d’un kit complémentaire de synthèse d’ADN. Après trois minutes à 42 degrés Celsius, ajouter 1,5 microlitres d’enzyme de transcriptase inverse 10X à chaque échantillon pour une incubation de 30 minutes à 42 degrés Celsius dans un thermocyclre. Après neutralisation, préparer une réaction PCR avec 29,5 microlitres d’eau, cinq microlitres de tampon 10X taq, un microlitre de triphosphate nucléoside, deux microlitres de 25 amorces avant micromolaires, deux microlitres de 25 amorces inverses micromolaires, 0,5 microlitres de polymétéase taq et 10 microlitres de l’ADN complémentaire transcrit inversé.
Ensuite, exécutez deux réactions PCR. Pour la purification du gel d’agarose, préparez un gel agarose de 4 % avec une agarose à faible fond et chargez 40 microlitres ou plus du produit PCR sur le gel avec colorant de chargement et 100 marqueurs de base et 25 marqueurs de taille paire de base. Après avoir fait fonctionner le gel, couper la bande au-dessus de la bande de 125 paires de base et utiliser un kit d’extraction de gel selon les instructions du fabricant.
Agiter pour dissoudre la bande de gel dans le tampon à température ambiante avant d’utiliser l’équipement approprié pour quantifier la bibliothèque de séquence finale. Utilisez ensuite les outils bioinformatiques opensource appropriés pour analyser les données de séquence. Dans cette réaction représentative de PCR sur le gel d’agarose de basse fonte, l’acquisition du produit cloné correct comparé au produit obtenu de linker linker et aux échantillons insaturés contre saturés peut être observée.
Après l’alignement sur les épingles à cheveux microARN humaines, une forte concordance entre les comptes de lecture microARN dans chaque réplique peut être observée. Un total de 306 espèces de microARN ont été détectées avec le plus grand nombre de lecture cartographiées à microARN 122. Il est important de se rappeler de couper les gels à la taille appropriée pour permettre une récupération précise des microARN.
Après le séquençage des microARN, les utilisateurs peuvent appliquer une analyse bioinformatique pour caractériser la distribution des microARN dans leurs tissus d’intérêt. Cette technique a été utilisée pour identifier comment les microARN sont traités et quels ensembles de microARN sont modifiés dans certains cancers. Assurez-vous d’exercer des soins lors de la manipulation du bromure d’éthidium et lorsque vous regardez les gels sous la lumière ultraviolette.
