Nous avons récemment constaté que de nombreuses cellules B dans le poisson zèbre LCK GFP expriment de faibles niveaux de GFP. Cela fait de cette ligne un outil utile pour l’étude des cellules B ainsi que des cellules T. Le principal avantage de cette technique est que maintenant nous pouvons étudier les cellules B et les cellules T du poisson zèbre LCK GFP ou nous pouvons étudier les cellules B-ALL et T-ALL à partir de poissons atteints de cancer.
Ces méthodes permettent le développement des cellules B et des études B-ALL chez le poisson zèbre. Qui sont pertinents pour comprendre le système immunitaire adaptatif et ses malignités communes dans le cancer pédiatrique. Si vous n’avez jamais fait ces dissections avant que vous puissiez vouloir affiner votre technique à quelques reprises jusqu’à ce que vous puissiez obtenir de bons échantillons de thymus et de moelle.
La démonstration visuelle aidera les téléspectateurs à reconnaître le fluor et le B-ALL chez les poissons et à choisir les bons réglages pour discriminer les cellules B et T pour leur isolement. Après anesthésie avec 0,02%Tricaine dans l’eau du système de poissons utiliser le filtre GFP sur un microscope d’épifluorescence pour examiner le poisson zèbre de deux à six mois pour thymi fluorescent à l’aspect médial dorsale de la cavité branchiale. Après avoir localisé le thymus placer le poisson euthanasié dans une boîte de Pétri et utiliser le microscope fluorescent pour enlever le thymi positif GFP.
Et les paramètres de microscopie brightfield pour récolter la moelle rénale et la rate. Placer chaque organe recueilli dans un tube de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de milieu de tri à froid et utiliser un homogénéisateur de microtube de pilon pour homogénéiser les tissus sur la glace. Ensuite, filtrer le tissu homogénéisé à travers un filtre à mailles de 35 micromètres pour générer une suspension cellulaire unique et placer les cellules sur la glace.
À partir de deux à quatre mois, utilisez un microscope fluorescent pour dépister les poissons EGFP à double transgénique2:hMYC LCK utilisant des paramètres de faible exposition pour identifier la leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T ou T-ALL et les milieux d’exposition élevés pour identifier les animaux b-all faibles. Les poissons de type sauvage et pré-leucémiques n’ont gfp localisé que dans le thymus. Catégoriser le poisson en fonction de l’étendue de la fluorescence GFP à l’aide d’un système simple à trois catégories.
Les poissons de niveau un démontrent un signal fluorescent comme tumeur thymique avec seulement une diffusion locale limitée. Les poissons de niveau deux démontrent un signal fluorescent au-delà du thymus impliquant moins de 50% du corps. Et les poissons de niveau trois démontrent un signal fluorescent s’étendant au-delà de 50% du corps.
Séparez le poisson avec ALL de ceux qui n’ont pas de cancer. Et surveiller les poissons pré-leucémiques sans tumeurs positives GFP une fois par mois pour le développement de la nouvelle ALL. Pour l’isolement cellulaire T ou B-ALL, utilisez une lame de rasoir pour enlever la tête et la région thymique d’un poisson de niveau trois euthanasié et placer le corps dans une boîte de Pétri.
Utilisez une pipette P-1000 pour laver la cavité péritonéale du poisson avec 500 microlitres de milieu de tri à froid, en recueillant les cellules et le milieu dans un tube de cinq millilitres. À l’aide d’une pointe de pipette fraîche injecter deux à trois volumes supplémentaires de 200 à 300 microlitres de milieu de tri à froid dans la cavité du corps et utiliser le bout de la pipette pour appliquer une pression douce sur le corps du poisson pour extruder les cellules de la cavité du corps dans le tube de cinq millilitres. Ensuite, filtrer la suspension cellulaire à travers un filtre à mailles de 35 microlitres.
Et placez les cellules sur la glace jusqu’à leur analyse par cytométrie d’écoulement. Pour l’homogénéisation du corps entier utiliser un homogénéiseur microtube pilon pour homogénéiser le corps du poisson et ajouter 300 microlitres supplémentaires de milieu de tri à froid au tube. Filtrer la suspension cellulaire à travers un filtre à mailles de 35 micromètres, en lavant le filtre avec un milieu de tri supplémentaire si nécessaire jusqu’à ce que seuls les débris tissulaires restent sur le filtre.
Ensuite, placez les cellules sur la glace jusqu’à leur analyse. Pour l’analyse cytométrique de flux des cellules isolées définir les paramètres du cytomètre d’écoulement selon les lignes directrices du fabricant. Et acquérir 10 000 à 50 000 événements pour définir les paramètres avancés de dispersion et de dispersion latérale pour définir les portes des lymphocytes et des cellules progénitrices et exclure les débris cellulaires.
Exclure les doublets cellulaires et utiliser les portes lymphoïdes et/ou précurseurs pour déterminer le nombre et le pourcentage des cellules positives du GFP. L’utilisation de la phycoerythrine et des intensités GFP définissent les portes pour les cellules gfp négatives par rapport aux cellules élevées GFP. Il est essentiel d’apprendre où placer les barrières pour isoler les cellules hautes GFP et GFP pour obtenir des populations pures de cellules B et T.
Deux populations positives distinctes de GFP, des cellules de bas B de GFP et des cellules hautes de T de GFP peuvent être obtenues du thymus. Les cellules B résidant dans la moelle rénale du poisson zèbre de trois mois expriment de faibles niveaux de GFP. Les cellules élevées de GFP sont rares cependant, indiquant que seulement un petit pourcentage des lymphocytes de T sont présents dans la moelle à trois mois d’âge.
De même, les échantillons spléniques montrent des pourcentages plus élevés de GFP faible que les cellules élevées GFP. Chez les poissons double-transgéniques qui n’ont pas encore développé de leucémie lymphoblastique aiguë, l’expression du GFP dans le thymus, la moelle et la rate est similaire à celle observée chez les poissons EGFP LCK mono transgéniques. Cependant, le nombre de lymphocytes par organe est augmenté.
Vraisemblablement, en raison de l’expansion entraînée par myc des populations immatures de cellules B et T dans lesquelles le promoteur rag2 est actif. Chez les poissons double-transgéniques avec B et ou T-ALL qui ont développé des cancers fluorescents de six mois B-ALL sont des cancers faiblement fluorescents contenant principalement des cellules faibles GFP. En revanche, les poissons brillamment fluorescents peuvent abriter des populations isolées de T-ALL ou mixtes des cellules GFP low B-ALL et GFP high T-ALL.
En effet, tel qu’évalué par l’analyse quantitative de réaction en chaîne de polymése GFP les cellules basses expriment des niveaux plus élevés des transcriptions de cellules de B. Et les cellules élevées GFP expriment des niveaux plus élevés de gènes des cellules T, LCK et le marqueur GFP. Il est essentiel d’apprendre à reconnaître les poissons avec B-ALL par microscopie.
Et comment bien définir les barrières de cytométrie de flux pour séparer les populations faibles et GFP élevées. Après cette procédure, vous pouvez isoler l’ADN, l’ARN ou les protéines des cellules hautes GFP faible et GFP pour pcr, séquençage, ce qui est dans le sang ou des expériences de transplantation in vivo. Une fois que nous avons appris que les poissons LCK GFB ont des cellules B fluorescentes en plus des cellules T, nous avons pu étudier les deux types de cellules du même animal pour évaluer B et T-ALL.
