Soutenu par l&#39;Institut Pasteur, l&#39;Inserm, l&#39;Agence Nationale de Recherche (ANR Grant &#39;Lymphopoïèse&#39;), le Programme d&#39;investissement REVIVE avenir et «La Ligue contre le cancer&quot;.

Déclaration éthique: toutes les expériences ont été réalisées conformément à la Charte Ethique Institut Pasteur, approuvé par le ministère français de l&#39;Agriculture, et les lignes directrices de l&#39;UE. Un manipulateur avec une formation sur la chirurgie petit rongeur, certifié par le ministère français de l&#39;Agriculture, effectue toutes les interventions chirurgicales. NOTE: Voir en annexe le tableau 1 montrant la procédure du plan en 5 étapes. 1. La sélection des embryons <ol><li> Utilisez 36 femelles C57BL / 6 CD45.2, 12 femelles CD45.1, 12 C57BL / 6 Les mâles CD45.1 et 12 C57BL / 6 mâles CD45.2. Traverser les femelles avec soit le génotype mâle va produire des embryons CD45.1 / 2 et CD45.1 utilisés comme une source de TSP ou CD45.2 utilisé comme une source de bénéficiaires lobes thymiques. Maison tous les mâles individuellement. </li><li> Pour obtenir des embryons pour E18 TSP isolement, placez 2 femelles dans une cage avec un mâle CD45.1 à 18 heures, 21 jours avant l&#39;expérience de greffage. Vérifier la présence d&#39;un bouchon vaginal le lendemain, avant midi. Sepaévaluer les femelles branchés. </li><li> Pour obtenir des embryons E14 à être colonisée par TSP, répétez la procédure ci-dessus (1.2), en utilisant les mâles CD45.2, 17 jours avant l&#39;expérience de greffage. </li><li> Pour obtenir des embryons pour isoler E13 TSP, répétez la procédure ci-dessus (1.2), en utilisant les mâles C57BL / 6 CD45.1, 16 jours avant l&#39;expérience de greffage. </li></ol> 2. Dissection du embryons Sous une Horizontal Hotte à flux laminaire REMARQUE: Deux jours avant l&#39;expérience de greffage. <ol><li> Sacrifice des femelles gravides par dislocation cervicale ou par administration progressive du CO 2 gazeux pendant au moins 5 min, dans une enceinte fermée saturation. Veiller à la mort par arrêt définitif des mouvements de cardio-respiratoires. Mouillez l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Faire une incision longitudinale dans la peau à l&#39;abdomen de la ligne médiane et l&#39;ouvrir en tirant la peau de l&#39;autre. Ouvrir le péritoine avec des pinces et des ciseaux, sans toucher le tube digestif. Sortez le uter bifidenous et le séparer du vagin avec les ciseaux. </li><li> Placez l&#39;utérus dans un plat de 90 x 15 mm de Pétri contenant 40-50 ml DPBS et couper transversalement entre la caduque de chaque embryon. </li><li> Avec la paire de ciseaux fins de pointe et une pince fine retirer la membrane musculaire de l&#39;utérus, sortez les embryons en coupant entre le placenta et le sac jaune, et de supprimer l&#39;amnios, qui est retenue les embryons. </li><li> Placez les embryons dans une boîte de Pétri de 90 x 15 mm contenant HBSS + 1% de sérum de veau foetal (FCS). Pour les embryons âgés de plus de E15, retirez les têtes avec une paire de ciseaux avant toute nouvelle dissection. </li></ol> 3. Isolement du Thymus <ol><li> Sous la loupe binoculaire, placer l&#39;embryon, se trouvant en position couchée (vue ventrale), sur une literie de gaze humide. </li><li> Insérez une pince longitudinalement le long du cartilage du sternum, pincer et ouvrir la grille thoracique. Avec pince courbe, tirez la paroi thoracique de côté pour visualiser le thymic lobes de chaque côté de la trachée. </li><li> Tenez soigneusement chaque lobe en pinçant dessous avec une pince fine et les placer dans une boîte de Pétri contenant 1 ml de HBSS + 1% de FCS. Isoler les lobes et enlevez tissu conjonctif environnant avec deux seringues de 1 ml + 26 G ⅜ &quot;aiguilles, sans endommager la capsule. </li><li> Laver les lobes dans 3 ml de HBSS + 1% de FCS pour éliminer les cellules sanguines. REMARQUE: Avant E15, lobes thymiques sont situés de chaque côté de la trachée et fusible plus tard dans le milieu pour constituer un organe bi-lobaire. </li></ol> 4. suspensions cellulaires <ol><li> Démêler les lobes sous la loupe binoculaire, avec deux aiguilles 26 G montés sur seringues de 1 ml, dans HBSS + 1% de FCS. On filtre la suspension de cellules à travers une maille de nylon. </li></ol> 5. coloration avec des anticorps et des cellules fluorescentes tri NOTE: Tous les anticorps sont préalablement titrés pour obtenir la définition optimale des populations (le titration peut varier avec le lot d&#39;anticorps). <ol><li> Incuber les thymocytes (E13 ou E18) pour 15-30 minutes à 4 ° C avec 100 ul d&#39;un cocktail d&#39;anticorps biotinylés pour colorer les cellules positives de la lignée (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , anti-CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25). </li><li> Pour laver l&#39;excès d&#39;anticorps ralentissent les tubes avec 4 ml de HBSS + 1% de FCS à 280 g pendant 7 min, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans HBSS frais + 1% de FCS. Répétez la centrifugation. </li><li> Incuber les cellules marquées à la biotine E18 avec les microbilles de streptavidine pendant 15 minutes à 4 ° C et laver les cellules deux fois dans du HBSS à 1% de FCS. Re-suspendre les cellules dans 2 ml de HBSS + 1% de FCS. La plupart des thymocytes E13 sont lignée négative et ne nécessitent donc pas MACS enrichissement avant le tri de cellules. </li><li> Faire passer les cellules sur la colonne de LS, selon les instructions du fabricant. Lorsque toute la suspension de cellules est entré dans la colonne d&#39;ajouter 2 ml de HBSS + 1% de FCS. Récupérer le4 ml de l&#39;écoulement à travers la colonne et centrifuger les cellules pendant 7 minutes à 280 x g. </li><li> Re-suspendre le culot E18 soit appauvri ou thymocytes totaux E13 dans 50 pi de l&#39;anticorps mélange TSP (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 et streptavidine Pacific Blue ) et incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules avec 4 ml de HBSS + 1% de FCS et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de HBSS + 1% de FCS avec de l&#39;iodure de propidium. </li><li> Trier la FST Lin - CD44 + CD117 + CD24 + CD135 bas CD127 + cellules dans un FACS (avec 4 lasers) sur une tubes de 1,5 ml contenant 200 pi de milieu complet + 20% FCS. Première porte les cellules en fonction de leur taille et de granularité sur le FSC et les canaux de la SSC. Éliminer les cellules mortes (coloration avec l&#39;iodure de propidium), porte sur doublets et marquer la fluorescence dans les échelles exponentielles. Environ 100 ou 600 FST peuvent être obtenus d&#39;un E13 ou E18 un thymus, respectivEly. </li></ol> 6. La colonisation de E14 thymique lobes avec progéniteurs: Hanging Technique Goutte <ol><li> Irradier (30 Grays = 30 Gy) E14 lobes thymiques à partir d&#39;embryons CD45.2, 3 h avant la culture. NOTE: E14 ou E15 lobes thymiques ont été utilisés avec succès en tant que destinataire de progéniteurs de lymphocytes T. Utilisation bénéficiaires lobes thymiques de résultats ultérieurs jours de gestation dans la nécrose prématurée en raison de la grande taille de l&#39;organe tout en lobes thymiques au antérieures jours de gestation développent mal, probablement en raison du développement incomplet des cellules épithéliales. </li><li> Centrifugeuse triés FST et remettre en suspension les cellules dans du milieu de culture (OPTI-MEM milieu complet avec 10% de FCS, de la pénicilline (50 unités / ml), streptomycine (50 ug / ml) et de 2β-mercaptoéthanol (50 uM)) de telle sorte que 35 ul contient 500 TSP. </li><li> Déposer une goutte de 35 pi de suspension cellulaire tous les autres puits d&#39;une plaque bien Terasaki 60. REMARQUE: 35 ul gouttes peuvent fusionner si elles sont placées dans des puits adjacents. </li><li> Placer une lobe irradié sur la surface de chaque goutte. Fermez la plaque Terasaki et tourner la plaque à l&#39;envers pour laisser les cellules atteignent le pôle apical de la goutte par gravité. </li><li> Hit doucement le côté supérieur de la plaque inversée pour forcer les lobes de coulisser sur le bord apical de la goutte. Incuber la plaque Terasaki inversé dans un incubateur humidifié pendant 48 heures à 37 ° C + 5% CO 2. Après la colonisation, soit la culture E14 thymus dans FTOC 7, ou greffé sous la capsule du rein d&#39;une souris adulte bénéficiaire 8. </li></ol> 7. fœtale thymique Organ Culture <ol><li> Placer 3 ml de milieu complet dans un plat de Pétri de 35 mm. Placer un filtre à membrane de isopore flottant sur le support. Placez les lobes reconstituées sur le bord de la membrane avec une pince (pas plus de huit lobes sur une seule membrane). </li><li> Placez les boîtes de Pétri contenant les lobes thymiques dans un plat de 90 mm de Petri, avec une boîte de 35 mm, sans couvercle, contenant 2 ml de Water, à assurer une humidité optimale. Incuber 12 jours à 37 ° C + 5% CO 2. </li></ol> 8. Les greffes sous la capsule du rein dans des conditions stériles NOTE: Le parenchyme rénal est entouré par du tissu conjonctif formant une capsule. La région sous-capsulaire est particulièrement riche en vaisseaux sanguins et lymphatiques, fournissant ainsi un environnement approprié pour le développement des greffes (par exemple, les lobes thymiques, des îlots pancréatiques ou des cœurs nouveau-nés). Les greffes sont habituellement effectuées sur le rein gauche, car il est plus accessible que le rein droit. CD3 - / - souris mâles ont été utilisés en tant que bénéficiaires évitant ainsi la réaction du greffon contre l&#39;hôte due à des antigènes mineurs d&#39;histocompatibilité liés au chromosome Y parce que la détermination du sexe avant E15 est pas fait facilement. <ol><li> Stériliser les instruments et porter des gants stériles long de la chirurgie. Anesthésier la souris par injection intra-péritonéale d&#39;une solution de kétamine à 10 mg / ml + 1 mg de xylazine /ml dilué dans du PBS (50 à 100 pl par 10 g de poids corporel), en utilisant une seringue de 1 ml. Vérifiez l&#39;anesthésie en vérifiant l&#39;absence de réflexes interdigitaux. Déposer une goutte de gel hydro-Optimune sur chaque œil pour prévenir la sécheresse pendant l&#39;anesthésie. NOTE: La solution doit être préparée de manière inopinée et réchauffé à température ambiante avant l&#39;injection. L&#39;anesthésie dure au moins 20 min. Le degré de l&#39;anesthésie doit être contrôlée tout au long de la chirurgie. L&#39;anesthésie peut être prolongée par injection intra-péritonéale de la moitié de la dose toutes les 20 min. </li><li> Placez la souris sur son côté droit, sous une hotte à flux lamina horizontale. Stériliser le champ opératoire avec 70% d&#39;éthanol et 10% d&#39;une solution dermique iodure. Avec une partie de la pince à cheveux de la souris sur une longueur de 2 cm au-dessus de l&#39;articulation de la patte postérieure. Rasez la zone chirurgicale. </li><li> Avec un scalpel, faire un cm de longueur de la première, le tissu cutané incision 1,5, puis avec des ciseaux coupent le tissu musculaire. Appliquer une légère pression sur les deux côtés de l&#39;incision, Ce qui forcera le rein hors de la cavité abdominale. </li><li> Appliquer une solution saline avec un coton tige pour garder le rein humide. Si vous avez des difficultés à exposer l&#39;orgue, utilisez une pince à plat pour retirer le tissu adipocytaire environnante à laquelle le rein est attaché. Maintenir le rein hors de la cavité rétropéritonéale par un coton-tige placée au-dessous de l&#39;organe. </li><li> Avec deux pinces fines, faire un trou de 2-3 mm dans la capsule (éviter de toucher le parenchyme pour prévenir les saignements). Pendant toute la procédure chirurgicale garder la capsule rénale exposée en permanence humide. </li><li> Insérez soigneusement les lobes sous la capsule du rein, par le maintien de la paroi de la capsule ouverte et faites glisser la greffe sous la capsule vers le pôle de bord. Placez jusqu&#39;à 6 lobes par les reins. </li><li> Remplacer le rein dans la cavité rétro-péritonéale. Suturer les aponévroses musculaires, puis la peau avec des nœuds de chirurgien individuels. Mouiller la plaie avec 10% de solution de povidone iodure. Placez la souris sur un an chaufféed à 37 ° C. </li><li> Enquête sur la souris transplanté jusqu&#39;au rétablissement complet de l&#39;anesthésie par le contrôle des cardiaques, respiratoires et moustaches mouvements, couleurs muqueuses jusqu&#39;à la récupération totale vu par autonome mouvements. NOTE: Nous vous recommandons injection d&#39;une solution analgésique (buprénorphine, 0,1 mg / kg) intra musculaire juste après la chirurgie et les deux jours suivant la chirurgie pour prévenir la douleur post-opératoire. </li><li> Gardez l&#39;animal opéré dans l&#39;isolement jusqu&#39;à guérison complète. Inspecter tous les deux jours les points de suture de la plaie pour vérifier et prévenir l&#39;infection. Jamais observé infection de la plaie suivant cette procédure. NOTE: Analyse hebdomadaire de cellules sanguines périphériques de la CD3 - / - souris greffées nous permettent de détecter l&#39;thymique populations issues provenaient soit progéniteurs E13 ou E18 en utilisant le marqueur CD45 allotypique et la lignée de cellules T anticorps spécifiques (Figure 3). </li></ol> 9. Analyse de la descendance TSP par cytométrie en flux <ol><li&gt; taquiner le FTOCs individuellement pour obtenir des suspensions de cellules uniques (voir la section de protocole 4). </li><li> Suspensions cellulaires tache de lobes individuels avec un mélange d&#39;anticorps contenant des anticorps reconnaissant CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE et incuber comme décrit dans la section 5. </li><li> Re-suspendre les cellules dans HBSS + 1% FCS + iodure de propidium et d&#39;analyser dans un cytomètre de flux (voir résultats de la figure 2). </li></ol>

<ol>
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C., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+T+cell+precursor+activity+in+the+murine+fetal+thymus:+evidence+for+an+input+of+T+cell+precursors+between+days+12+and+14+of+gestation.">Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation.</a> Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).</li><li>Calderon, L., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic,+context-dependent,+and+hierarchical+functions+of+epithelial+components+in+thymic+microenvironments.">Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments.</a> Cell. 149, 159-172 (2012).</li><li>Adolfsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Flt3++lympho-myeloid+stem+cells+lacking+erythro-megakaryocytic+potential+a+revised+road+map+for+adult+blood+lineage+commitment.">Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment.</a> Cell. 121, 295-306 (2005).</li><li>Kondo, M., Weissman, I. 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P., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+earliest+prethymic+bipotent+T/NK+progenitor+in+murine+fetal+liver.">Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver.</a> Blood. 99, 463-471 (2002).</li><li>Malissen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+T+cell+development+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+CD3-epsilon+gene.">Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene.</a> EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Deux principaux essais peuvent être utilisés pour analyser la différenciation des cellules T ex vivo. Le plus récemment rapporté est la co-culture de progéniteurs hématopoïétiques avec des cellules stromales BM, OP9, exprimant les ligands de Noth1, delta comme 1 ou 4 12. Cette analyse 2-D est facile à réaliser, très efficace et sensible, permettant une analyse à le niveau de la cellule unique. Toutefois, il ne soutient le développement des cellules T au-delà de la phase de DP ni la gé...

Lymphocytes T, portant le αβ ou le récepteur de lymphocytes T γδ de (TcR), se différencient dans un organe spécialisé, le thymus. Le thymus entièrement développé est divisé en deux régions distinctes: le cortex, où progéniteurs thymiques se développent et où thymocytes qui réarrangent productive les β TCR et gènes de la chaîne α sont sauvés de la mort programmée (un processus connu sous le nom sélection positive); et la moelle, où sélectionné thymocytes trop forte réactivité aux auto-ligands sont supprimés (sélection négative) 1,2. Le thymus est originaire de la couche endodermique de la troisième poche pharyngienne qui est ensuite entouré par trois cellules mésenchymateuses. Il est colonisée par les progéniteurs hématopoïétiques à partir de jour embryonnaire E12 et, par la suite, le recrutement continue T est requis pour le développement des cellules normales 4. Immigrés thymiques évoluent par étapes de développement successives, orchestrée par un programme strictement réglementé, initié et maintained par l&#39;activation de la voie de signalisation Notch dans les thymocytes lors de l&#39;interaction avec son ligand, comme delta 4, exprimé sur les cellules épithéliales thymiques (CET) 5. le développement de Thymocyte commence au CD4 dite - CD8 - Double Negative (DN) étapes. Thymocytes DN peuvent être subdivisés selon l&#39;expression de CD25 et CD44 dans DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) et DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) et CD117 (c-kit) subdivise le compartiment DN1 en 5 sous-ensembles où DN1A et b correspondent aux progéniteurs thymiques précoces (ETP). Thymocytes réorganiser les δ, β et α chaînes de TCR au stade DN et subissent pré-TcR sélection (stades DN3-DN4). Ils ont en outre en commun pour le CD4 + CD8 + double positif (DP) compartiment où la chaîne α TcR réorganise avant sele positif et négatifction. A ce stade, la plupart des thymocytes sont éliminés et seulement un faible pourcentage (3-5%) atteignent la CD4 + ou CD8 + T matures compartiment cellulaire. La voie de différenciation lymphoïde progresse à travers les étapes de la CSH qui génèrent des progéniteurs multipotentes (MPP) et les progéniteurs lymphoïdes multipotentes amorcée (PPSP) qui ont perdu des érythrocytes et le potentiel 6 mégacaryocytes. PPSP sont phénotypiquement définie par l&#39;absence de marqueurs de cellules sanguines différenciées (lignée négative, Lin -), l&#39;expression de c-Kit (CD117), Sca-1 et Flt3 / flk2 (CD135) et l&#39;absence de taux détectables de l&#39;interleukine ( IL) -7 récepteur α chaîne (IL-7rα ou CD127). LMPPs différencient en précurseurs communs lymphoïdes (CLP) 7 qui à ce stade ont perdu la capacité de générer des cellules myéloïdes. CLP conserver lymphocytes (cellules B et T), cellules NK, DC et la cellule lymphoïde innée (CIT) de potentiel, et diffèrent de PPSP par l&#39;expression de CD127 et l&#39;absence de niveaux élevés de Sca-1. Bien que la nature des thymiques régler progéniteurs (TSP) a été largement débattue 8, il est récemment devenu clair que TSP changement phénotype, le potentiel et la fonction de différenciation, tout au long du développement 9. Nous avons effectué in vitro et in vivo pour caractériser la TSP, isolé par la cellule de tri FACS soit E13 (première vague) ou E18 (deuxième vague). Cultures thymiques foetaux d&#39;organes (FTOC) avec lobes thymiques irradiés colonisés par un nombre égal de E13 et E18 progéniteurs, portant différents marqueurs de allotypiques, admis suivant leur progéniture dans un environnement de développement similaire et révélées propriétés intrinsèques cellulaires, différents entre les deux types de progéniteurs. Lobes thymiques colonisés par E13 ou E18 soit TSP permis le développement sans sélection en raison de la concurrence entre les deux progéniteurs. In vivo transplantation des lobes thymiques colonisés en outre montré que aussi til descendance mature de E13 et E18 TSP ont différentes propriétés biologiques in vivo. FST de la première vague de générer rapidement des cellules T, mais donnent lieu à un faible nombre de cellules T αβ et γδ. Parmi ces derniers, nous avons détecté des cellules dendritiques Vγ5Vδ1 épithéliales T (DETC), qui ont un TcR invariant, migrent vers l&#39;épiderme où ils exercent une fonction dans la cicatrisation des plaies et ne sont produites pendant le développement embryonnaire 10. En revanche, TSP de la deuxième vague de prendre plus de temps pour générer des nombres élevés de cellules TcR + T et sont incapables de générer DETC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes.</td>
			<td>TPP</td>
			<td>T93100/T9340</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak.</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300015</td>
			<td>Cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.36</td>
			<td>Sterility Actions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodide Povidone 10% (Betadine)&#160;</td>
			<td>MEDA Pharma</td>
			<td>314997.8</td>
			<td>Sterility Actions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 100mg/ml (stock solution)</td>
			<td>MERIAL</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Anesthesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td>Anesthesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution</td>
			<td>AXIENCE</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Morphinic analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)</td>
			<td>Schering-Plough Animal Health</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Eyes protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>14040-174</td>
			<td>to isolate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS Hanks&#39; Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>24020-091</td>
			<td>to wash out the blood and dissect the embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>51985-026</td>
			<td>Medium for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F&#339;tal Calf serum</td>
			<td>EUROBIO</td>
			<td>CVFSVF00-0U</td>
			<td>additive for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>15640-055</td>
			<td>Antibiotics for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 b mercapto ethanol</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>31350010</td>
			<td>additive for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA MZ6 Dissection microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MZ6 10445111</td>
			<td>Occular W-Pl10x/23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold lamp source</td>
			<td>SCHOTT VWR</td>
			<td>KL1500 compact</td>
			<td>Two goose neck fibers adapted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Dissecting Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoon, round and perforated</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11253-25</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two pairs of fine straight watchmakers&#8217; forceps Dumont #5 11 cm fine tips.</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-20</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyamid thread with needle 6-0&#160;&#160; C-3 3/8c</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>F2403</td>
			<td>for sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-holder</td>
			<td>MORIA/F.S.T.</td>
			<td>12060-02</td>
			<td>for sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100229-100</td>
			<td>To maintain mouse temperature during anesthesy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Isopore RTTPO2500</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>44210</td>
			<td>For FTOC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki 60 wells plates</td>
			<td>FISHER</td>
			<td>1x270 10318801</td>
			<td>For hanging drop technique</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm</td>
			<td>Hydrex</td>
			<td>11522</td>
			<td>To apply disinfecting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence or biotin labelled antibodies</td>
			<td>BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences&#160;</td>
			<td>Clone Number see table below</td>
			<td>Staining cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Columns/Streptavidin Microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401/130-048-101</td>
			<td>Cell depletion&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs&#160; (CD45.2)</td>
			<td>C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2</td>
			<td>Source of cells and thymic lobes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>CDTA Orl&#233;ans, France</td>
			<td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td>
			<td>&#160;Grafting experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of thymic settling progenitors in the mouse embryo using in vivo and in vitro assays

Caractériser thymiques régler progéniteurs est important de comprendre les étapes de pré-thymiques du développement des cellules T, essentiels pour élaborer des stratégies pour le remplacement des cellules T chez les patients lymphopéniques. Nous avons étudié thymique régler progéniteurs de murin jour embryonnaire 13 et 18 thymus par deux complémentaires in vitro et in vivo techniques, tous deux basés sur la méthode &quot;goutte suspendue&quot;. Cette méthode a permis de coloniser irradiés lobes thymiques foetaux avec E13 et / ou E18 progéniteurs CD45 thymiques distingués par marqueurs allotypiques et suivants de leur progéniture ainsi. La colonisation par des populations mixtes permet d&#39;analyser les différences cellulaires autonomes dans les propriétés biologiques des progéniteurs tandis colonisation soit avec la population supprime possibles pressions sélectives compétitifs. Les lobes thymiques colonisés peuvent également être greffés chez des souris immunodéficientes bénéficiaires masculins permettant l&#39;analyse de la descendance maturité des cellules T in vivo, tels que la dynamique des populations de til périphérique système immunitaire et la colonisation de différents tissus et organes. Des cultures d&#39;organes thymiques foetaux révélé que progéniteurs E13 développées rapidement dans tous maturité cellules CD3 + et ont donné lieu à la sous-ensemble de cellules T γδ canonique, connu sous le nom de cellules T épithéliales dendritiques. En comparaison, les progéniteurs E18 ont un retard de différenciation et ont été incapables de générer des cellules dendritiques T épithéliale. La surveillance de sang périphérique de CD3 thymus greffé - / - souris en outre montré que les progéniteurs E18 thymique décantation génèrent, avec le temps, un plus grand nombre de cellules T matures que leurs homologues E13, une caractéristique qui n&#39;a pas pu être apprécié dans le thymus du fœtus à court terme des cultures d&#39;organes.

Afin de choisir une méthode d&#39;épuiser lobes thymiques de thymocytes endogènes permettant le meilleur développement des progéniteurs colonisateurs, nous avons comparé les niveaux de T reconstitution cellulaire dans lobes thymiques colonisés après irradiation ou un désoxy-guanosine 5 jours (d-Gua) traitement. Les résultats montrent que bien qu&#39;il n&#39;y ait pas de différence au jour 9 de la culture, lobes irradiés contiennent plus de cellules T que ceux traités avec d-Gua, au jour 12. Ainsi, l&#39;ir...

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Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l&#39;embryon de souris Utilisation<em&gt; In Vivo</em&gt; Et<em&gt; In Vitro</em&gt; Essais

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

8.2K vues.  Institut Cochin. This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny. 

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Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Recherche

Biologie du développement

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans l&#39;embryon de souris par cytométrie de flux

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

Imagerie in vivo de Transgenic Gene Expression en Retinal individuelle progéniteurs dans chimériques Zebrafish Embryons à étudier cellulaires Influences non autonomes

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Cellule des épreuves d’agrégation pour évaluer la liaison de l’encoche de la drosophile avec Trans-Ligands et son Inhibition par Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

Génération d’insuline exempte d’échafaudage, en trois dimensions exprimant Pancreatoids de souris progéniteurs pancréatique In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-based System for In Vivo l’Implantation des Cardiomyocytes embryonnaires chez l’embryon aviaire

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Différenciation et caractérisation des progéniteurs neuronaux et des neurones à partir de cellules souches embryonnaires de souris

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.

Manipulation subcellulaire spatio-temporelle du cytosquelette de microtubules dans l’embryon de souris préimplantatoire vivant à l’aide de photostatines